專利名稱：一種麻疹病毒RT-tHDA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種麻疹病毒RT-tHDA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
麻疹是由麻疹病毒引起的一種以發(fā)熱、呼吸道癥狀與出疹為特征的急性傳染病。自20世紀(jì)70年代全球?qū)嵤U(kuò)大免疫規(guī)劃(EPI)以來(lái)，全世界麻疹發(fā)病率、死亡率大幅度下降，但目前每年仍出現(xiàn)許多散發(fā)病例，并常常引起局部的流行。按照我國(guó)消除麻疹的工作要求，對(duì)出現(xiàn)的麻疹病例必須要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)麻疹病毒核酸的試劑 盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種麻疫病毒核酸的逆轉(zhuǎn)錄依賴耐熱解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(RT-ThermophilicHelicase-dependent Amplification, RT-tHDA)試劑盒，主要包括主要包括 RT-tHDA 反應(yīng)試劑和特異性擴(kuò)增引物，所述特異性擴(kuò)增引物如下上游引物5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’ ;下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3 ’。本發(fā)明試劑盒的關(guān)鍵在于引物的選擇，RT-tHDA反應(yīng)試劑為RT-tHDA反應(yīng)中所用的常規(guī)試劑，如 IsoAmp Enzyme Mix, MgC12, hermoScript Reverse Transcriptase 等,這些組分對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)屬于公知常識(shí)，可根據(jù)需要自行配制，或者直接購(gòu)買時(shí)候HAD試劑盒,如Biohelix公司的HDA試劑盒等。本發(fā)明還涉及利用所述試劑盒檢測(cè)麻疹病毒的方法，所述方法包括(I)提取待測(cè)樣品RNA ;所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。(2)以待測(cè)樣品RNA為模板，加入特異性擴(kuò)增引物和PCR反應(yīng)試劑，配成RT-tHDA反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；(3 )對(duì)RT-tHDA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)于I IObp大小的電泳條帶，則待測(cè)樣品中含有麻疹病毒；反之則否。本發(fā)明中，所述擴(kuò)增反應(yīng)條件為65°C，120min。所述RT-tHDA反應(yīng)體系終濃度組成如下IOxAnneal ing buffer Ii 5μ MgSO4 [100 (mM)] 1.75μ1 NaCl ( 500mM ) 4μ1 IsoAmp dNTP Solution 3.5μ1 IsoAmp Enzyme Mix 3.5μ 樣品RNA 2μ1
20μΜ上下游引物各0.75μ1Invitrogen 公司耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶 ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ I加水補(bǔ)齊至50 μ I。 目前，實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)麻疹的常用方法，包括血清學(xué)檢測(cè)與病原學(xué)檢測(cè)，前者用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測(cè)患者血清中的特異性麻疫免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)M，后者則是以分離麻疹病毒和檢測(cè)麻疹病毒核酸來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。一般采用病毒分離、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction, RT-PCR)或熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行核酸檢測(cè)，但由于儀器成本較高，使其在基層推廣時(shí)受到一定的限制。近年發(fā)展起來(lái)的依賴解旋酶的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[Helicase-dependent Isothermal Deoxyribonucleic Acid(DNA)Amplification,HAD],模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的自然過(guò)程，使其擴(kuò)增反應(yīng)的全過(guò)程均在單一溫度下進(jìn)行，無(wú)需專門的擴(kuò)增儀器，克服了 PCR反應(yīng)需經(jīng)歷幾十個(gè)溫度變化的循環(huán)過(guò)程，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。本發(fā)明自行設(shè)計(jì)特異性引物，建立了快速檢測(cè)麻疹病毒核酸的逆轉(zhuǎn)錄依賴耐熱解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(RT-Thermophilic Helicase-dependent Amplification, RT-tHDA)方法,現(xiàn)將結(jié)果陳述如下。本申請(qǐng)發(fā)明人從美國(guó)的NCBI基因庫(kù)上下載了近二十年來(lái)世界各地的麻疹病毒核酸序列，對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，在麻疹病毒核酸的血凝素基因設(shè)計(jì)若干對(duì)引物，對(duì)該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從中篩選出最佳的引物，并對(duì)RT-tHDA方法進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)分別對(duì)腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、呼吸道合胞病毒與疑似患者臨床樣本的檢測(cè)比較，該方法具有高特異性，只能檢出麻疹病毒核酸，與其他呼吸道病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RT-PCR法更快速和簡(jiǎn)便。用建立的新方法，對(duì)近期浙江省疑似麻疹患者21份臨床樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷，獲得了令人滿意的結(jié)果，為該病及時(shí)采取控制措施發(fā)揮了很好的作用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明方法對(duì)麻疹病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與其他呼吸道病毒腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、呼吸道合胞病毒等病毒無(wú)交叉反應(yīng)；本發(fā)明方法檢測(cè)的靈敏度高，可直接從疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子、尿液等標(biāo)本中檢測(cè)麻疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3h左右。


圖I. RT-tHDA方法檢測(cè)麻疹病毒特異性結(jié)果；M :OX174_Hinc II DNAMarker ；1 麻疹疫苗株滬191 ；2 :麻疹流行株浙江/05/08 ；3 :風(fēng)疹病毒；4 :腮腺炎病毒5. EV71 ；6 :呼吸道合胞病毒。圖2為RT-tHDA方法檢測(cè)不同稀釋度麻疹病毒結(jié)果；圖3為RT-PCR方法檢測(cè)不同稀釋度麻疹病毒；圖2、圖 3 中M ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 的病毒濃度 5. 012X l(T7mol/L ；2 的病毒濃度
5.012Xl(T8mol/L ；3 的病毒濃度 5. 012 X l(T9mol/L ；4 的病毒濃度 5. 012 X l(T10mol/L ；5 的病毒濃度 5. 012X l(Tnmol/L ；6 的病毒濃度 5. 012 X l(T12mol/L。圖4為直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)麻疹病毒的結(jié)果； Μ. ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 :陰性對(duì)照；2 :麻疹疫苗株滬191 ;3 6熒光定量RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本；7 :熒光定量RT-PCR陰性樣本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :材料與方法I. I實(shí)驗(yàn)病毒株麻疹疫苗株滬191(上海，Shanghai ;S191 )、流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒Jerry Lynn (JL)株,風(fēng)疫病毒GOS株,呼吸道合胞病毒Long株,分別由上海生物制品 研究所與中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。麻疹病毒流行株浙江(Zhejiang，ZJ) /05/08，腸道病毒71型(Enterovirus Type71, EV71)株，以及疑似麻疹患者含漱液、咽拭子、尿液等，由浙江省疾病預(yù)防控制中心(CDC)病毒所提供。I. 2引物設(shè)計(jì)對(duì)麻疹病毒不同基因型進(jìn)行比對(duì)，選取各基因型病毒血凝素基因的共同保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，以保證引物的通用性。受DNA解旋酶解鏈能力影響，RT-tHDA產(chǎn)物大小控制在80堿基對(duì)(Base Pair, bp) 120bp，引物長(zhǎng)度在24bp 30bp，DNA熔解溫度(Melting temperature,Tm)設(shè)置在62°C 74°C,胞卩密唳及鳥嘌呤(Guanine and Cytosine,GC)百分比在40% 60%，引物內(nèi)避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物間與引物內(nèi)無(wú)互補(bǔ)序列，并用基于局部比對(duì)算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性確認(rèn)。根據(jù)以上條件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物F:5， -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，。擴(kuò)增片段大小為llObp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成純化。L 3病毒核酸的提取麻疹病毒核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)的提取采用德國(guó)Roche公司的核酸提取試劑盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取病毒RNA，置于_70°C保存?zhèn)溆?。I. 4RT-tHDA的反應(yīng)條件RT-tHDA采用Biohelix公司HDA試劑盒并添加耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系50微升(μ 1)，其中IOXAnnealingbuffer ΙΙ5μ I、MgSO4[100毫摩爾(mM)]l. 75 μ I、NaCl (500mM) 4 μ I、IsoAmpdNTP Solution 以及 IsoAmp Enzyme Mix各3·5μ I、樣品RNA2y 1、20μΜ上下游引物各O. 75μ I、Invitrogen公司耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ 1，加 ddw 至 50 μ I。將反應(yīng)液混勻后，置于650C 120min進(jìn)行反應(yīng)后，取5μ I以O(shè). 02克/毫升(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。I. 5 常規(guī) RT-PCR 反應(yīng)麻疹病毒核酸序列引物 F: 5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，

擴(kuò)增片斷l(xiāng)lObp。采用 TAKARA 公司 one step RT-kit (code :DRR024A)，按試劑盒說(shuō)明書操作，反應(yīng)體系為25μ 1，其中10父町- 0 緩沖液2.5111，]\%(122.5111 (25mM), dNTP混合物(各 IOmM) 2. 5 μ 1，RNase 抑制劑(40U/μ I) O. 5 μ 1，AMV 酶(5U/μ I) O. 5ul，Taq 酶(5U/y l)0.5ul，上游與下游引物(20μΜ)各 0·5μ 1，模板 RNA2y 1，DEPC 水 4·5μ I。反應(yīng)條件為 50°C 30min,95°C 3min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后 95°C 20s, 50°C 25s，72°C 30s 進(jìn)行擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)入72°C lOmin，取5μ I產(chǎn)物電泳后判斷有無(wú)特異性條帶(110bp)。I. 6RT-tHDA特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)分別對(duì)麻疹疫苗株滬191、麻疹流行株浙江/05/08、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、EV71、呼吸道合胞病毒提取核酸，用本發(fā)明建立的RT-tHDA方法進(jìn)行檢測(cè)，比較其檢測(cè)的特異性。用NanoVue分光光度計(jì)測(cè)麻疹病毒核酸原液濃度，將核酸原液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_5，采用相同引物和反應(yīng)體積，平行進(jìn)行RT-tHDA和RT-PCR反應(yīng)，比較兩種核酸擴(kuò)增方法的敏感性。2 結(jié)果2. I特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)，本發(fā)明建立的RT-tHDA方法對(duì)麻疹病毒具有較好的特異性，對(duì)其他呼吸道病毒如腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、呼吸道合胞病毒等無(wú)交叉反應(yīng)。2. 2敏感性試驗(yàn)用NanoVue分光光度計(jì)測(cè)麻疹病毒核酸原液濃度，將核酸原液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_5，采用相同引物和反應(yīng)體積，平行進(jìn)行RT-tHDA和RT-PCR反應(yīng)，比較兩種核酸擴(kuò)增方法的敏感性，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明建立的RT-tHDA方法對(duì)麻疹病毒的敏感性與RT-PCR反應(yīng)相當(dāng)，最低檢出濃度均為10-10mol/L。2. 4臨床樣本的檢測(cè)從近期浙江省各地麻疹疑似患者的含漱液，咽拭子和尿液共21份臨床樣本中直接提取病毒RNA，用本發(fā)明RT-tHDA和熒光定量RT-PCR方法(見(jiàn)操作I. 5)同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果本發(fā)明RT-tHDA方法檢測(cè)出麻疹病毒核酸陽(yáng)性20份，熒光定量RT-PCR法檢測(cè)出麻疹核酸陽(yáng)性20份，本發(fā)明麻疹病毒RT-tHDA方法和熒光RT-PCR方法檢測(cè)麻疹病毒的陽(yáng)性率相當(dāng)。本發(fā)明麻疹病毒RT-tHDA方法用于臨床樣本檢測(cè)的驗(yàn)證在4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，均獲得了滿意的結(jié)果，圖4顯示的是臨床樣本的檢測(cè)圖譜。
權(quán)利要求
1.一種麻疹病毒RT-tHDA檢測(cè)試劑盒，主要包括RT-tHDA反應(yīng)試劑和特異性擴(kuò)增引物，其特征在于所述特異性擴(kuò)增引物如下 上游引物5 ’ -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，; 下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。
2.利用權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)麻疹病毒的方法，所述方法包括 (1)提取待測(cè)樣品RNA; (2)以待測(cè)樣品RNA為模板，加入特異性擴(kuò)增引物和PCR反應(yīng)試劑，配成RT-tHDA反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)； (3)對(duì)RT-tHDA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)于IlObp大小的電泳條帶，則待測(cè)樣品中含有麻疹病毒；反之則否。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述擴(kuò)增反應(yīng)條件為65°C，120min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種麻疹病毒核酸的依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。所述試劑盒主要包括RT-tHDA反應(yīng)試劑和特異性擴(kuò)增引物，所述特異性擴(kuò)增引物如下上游引物:5’-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’;下游引物:5’-TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。本發(fā)明方法對(duì)麻疹病毒的檢測(cè)有高度的特異性，與其他呼吸道病毒無(wú)交叉反應(yīng)，且靈敏度高，可直接從疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子和尿液等標(biāo)本中檢測(cè)麻疹病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3h左右，非常適用于麻疹病毒感染引起突發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室早期診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102827949SQ20121029205
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者盧亦愚, 徐昌平, 馮燕, 馬麗敏, 鐘淑玲 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心