專利名稱：一種細(xì)胞腫大病毒dna疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞腫大病毒(Megalocytivirus)隸屬于虹彩病毒科,是該科中三個(gè)魚(yú)類病毒中的一種。虹彩病毒(包括細(xì)胞腫大病毒)是大型雙鏈DNA病毒，具有二十面體衣殼。其中細(xì)胞腫大病毒近年來(lái)在東亞及歐洲流行，感染多種硬骨魚(yú)類，給養(yǎng)殖漁業(yè)帶來(lái)極大災(zāi)害。在我國(guó)，已報(bào)導(dǎo)受細(xì)胞腫大病毒危害的養(yǎng)殖魚(yú)種包括石斑魚(yú)、大菱鲆、鱖魚(yú)、真鯛等。目前對(duì)細(xì)胞腫大病毒病的防治沒(méi)有有效的方法。DNA疫苗是一種基因疫苗，其構(gòu)建原理是將疫苗抗原基因克隆于一個(gè)真核表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入受免動(dòng)物后疫苗抗原在機(jī)體內(nèi)表達(dá)，從而誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。較之于其它形式的疫苗，DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)毒性、穩(wěn)定性高、可長(zhǎng)期儲(chǔ)存以及既能誘發(fā)體液免疫也能誘發(fā)細(xì)胞免疫。這些特點(diǎn)使得DNA疫苗具有良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗，以細(xì)胞腫大病毒0RF13序列為抗原基因克隆至真核表達(dá)載體，表達(dá)誘發(fā)即為質(zhì)粒PCN13DNA疫苗。具體為步驟I)以細(xì)胞腫大病毒為模板，采用Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBS13 ；步驟2)將質(zhì)粒pCN3用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時(shí)將pBS13用EcoRV酶切回收O. 3kb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為DNA疫苗質(zhì)粒PCN13。所述引物Fl 為 5' -GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3' ;R1 為 5' -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3'。細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗的應(yīng)用，所述DNA疫苗在制備預(yù)防或治療細(xì)胞腫大病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)I.高保護(hù)率。本發(fā)明的疫苗對(duì)細(xì)胞腫大病毒的免疫保護(hù)效率達(dá)70%以上。2.長(zhǎng)效。本發(fā)明的疫苗的保護(hù)效應(yīng)可持續(xù)至少兩個(gè)月。3.安全。本發(fā)明的疫苗沒(méi)有任何細(xì)胞毒性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法I.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。實(shí)施例I :細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的DNA疫苗基于一個(gè)細(xì)胞腫大病毒基因，即0RF13 (Lu L, Zhou S，ChenCj Weng S，Chan S，and He JG. Complete genome sequence analysis of an iridovirusisolated from the orange-spotted grouper,Epinephelus coioides. Virology2005;339:81-100)。步驟I) DNA疫苗質(zhì)粒pCN13的構(gòu)建方法以及DNA疫苗制備液的制備以已報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞腫大病毒(ZhangM, Xiao Z, Hu Y, Sun L. Characterization ofa megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathus fasciatus(Temminck &Schlege), in China. Aquae Res. 2012;43:556 - 64。)為模板，采用 Fl 和 Rl 為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 條件為:94。C 60s 預(yù)變性模板 DNA，然后 94。C 40s，50。C 60s，72。C 90s, 5個(gè)循環(huán)后改為94° C40s，64° C 60s, 72° C 90s，20個(gè)循環(huán)后再在72° C延伸反應(yīng)lOmin，PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS_T (購(gòu)自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有100 μ g/ml安卡青霉素(Ap)、40 μ g/ml 5_溴_4_氯_3_卩引哚-β _D_乳糖苷(X_gal)和
24μ g/ml異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，挑出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為質(zhì)粒PBS13。將質(zhì)粒pCN3 (pCN3 構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn) Jiao XD, Zhang M, Hu YH, Sun L. Constructionand evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens. Vaccine2009;27:5195-202.)用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時(shí)將pBS13用EcoRV酶切回收0. 3kb片段。將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有Ap (100 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，命名為PCN13，即為DNA疫苗質(zhì)粒。將pCN13懸浮于PBS中至濃度為400 μ g/ml,即為DNA疫苗制備液。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述引物序列為Fl 5/ -GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3/ ；Rl 5/ -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3';實(shí)施例2 :細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗的應(yīng)用
步驟I)疫苗的免疫注射。將200條大菱鲆(每條重約IOg)隨機(jī)分為4組(50條/組)，分別命名為A、B、C和D。將A和C組(免疫組)的每條魚(yú)肌肉注射50 μ I上述步驟I)的DNA疫苗制備液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚(yú)肌肉注射50 μ I PBS。步驟2)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。將細(xì)胞腫大病毒在GF細(xì)胞系(購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)中擴(kuò)增、提取(具體方法參考Zenke K, Kim KH. Functional characterization of theRNase III gene of rock bream iridovirus. Arch. Virol. 2008; 153:1651-6)0 將提取的病毒懸浮于PBS中至105COpieS/ml，即為病毒懸液。在步驟2)免疫注射后的第30天，用病毒懸液腹腔注射步驟2)的A和B組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為100 μ I ;在步驟2)免疫注射后的第60天，用病毒懸液腹腔注射步驟2)的C和D組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為100μ I。在以后的30天中，每天觀察并記錄各組魚(yú)的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚(yú)的總死亡數(shù)目Α組，13條；Β組，47條；C組，14條；D組，48條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫組魚(yú)的總死亡百分比/對(duì)照組魚(yú)的總死亡百分比)據(jù)此算出
DNA疫苗在免疫后一個(gè)月時(shí)針對(duì)細(xì)胞腫大病毒的免疫保護(hù)效率為72%，在免疫后兩個(gè)月時(shí)的免疫保護(hù)效率為71%。故本發(fā)明的DNA疫苗能夠高效并較長(zhǎng)期性地保護(hù)大菱鲆抵御細(xì)胞腫大病毒感染。
權(quán)利要求
1.ー種細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在干以細(xì)胞腫大病毒0RF13序列為抗原基因克隆至真核表達(dá)載體，表達(dá)誘發(fā)即為質(zhì)粒PCN13DNA疫苗。
2.按權(quán)利要求I所述的細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在于 步驟I)以細(xì)胞腫大病毒為模板，采用Fl和Rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PBS13 ； 步驟2)將質(zhì)粒pCN3用Sma I酶切，回收5. 4kb片段，同時(shí)將pBS13用EcoRV酶切回收O.3kb片段；將上述回收的兩片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小吋，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為DNA疫苗質(zhì)粒PCN13。
3.按權(quán)利要求2所述的細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗，其特征在于所述引物Fl為5'-GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3/ ;R1 為 5' -GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3'。
4.按權(quán)利要求I所述的細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于所述DNA疫苗在制備預(yù)防或治療細(xì)胞腫大病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗及其構(gòu)建和應(yīng)用。其構(gòu)建方法利用真核表達(dá)載體pCN3構(gòu)建DNA疫苗質(zhì)粒pCN13。其應(yīng)用方法將pCN13通過(guò)肌肉注射導(dǎo)入受免魚(yú)。本發(fā)明所得細(xì)胞腫大病毒DNA疫苗通過(guò)一次免疫即可誘發(fā)高效和長(zhǎng)期的免疫保護(hù)效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/34GK102847169SQ201210292458
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者張敏, 孫黎 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所