專利名稱：一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于分子生物學檢測領域，涉及結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測方法，提出一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法。
背景技術(shù)：
近年全球范圍內(nèi)，發(fā)達國家和發(fā)展中國家都出現(xiàn)結(jié)核病流行的大回升。據(jù)統(tǒng)計，全球已有1/3 (約20億)人感染了結(jié)核菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約2000萬，每年新發(fā)生約900萬病人，每年死亡人數(shù)高達300萬。而耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resistant tuberculosis,·MDR-TB) / 廣泛耐藥結(jié)核病(Extensively drug-resistanttuberculosis, XDR-TB)的涌現(xiàn)，更是對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴重威脅，大大增加全球結(jié)核病控制的負擔。據(jù)WHO資料顯示，中國現(xiàn)有的耐藥結(jié)核病患者數(shù)占全球20%左右，結(jié)核病依然是中國三大傳染病之一，防治仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。2007— 2008年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查顯示我國肺結(jié)核病人中耐多藥率為8. 32%，廣泛耐藥率為0.68%。據(jù)此估算，我國每年新發(fā)耐多藥(MDR)肺結(jié)核患者12萬例，而人員遷移流動、城市居住條件擁擠不堪等現(xiàn)況加劇了它的發(fā)生。目前結(jié)核病最常用的診斷方法已有100多年的歷史，抗結(jié)核病藥物在過去50年間沒有變化，遏制耐藥結(jié)核病蔓延需要創(chuàng)新理念，而更深入地了解抗結(jié)核藥物以及結(jié)核分枝桿菌的耐藥機制對于更好地預防和控制結(jié)核的蔓延是非常必要的。利福平自1972年首次作為抗結(jié)核藥物以來，一直發(fā)揮著巨大的殺菌效力，它是目前一線抗結(jié)核藥物中最重要的藥物之一。利福平抗菌譜廣且作用強大，對靜止期和繁殖期的結(jié)核菌均有作用，能增加鏈霉素和異煙肼的抗菌活性。它通過作用于結(jié)核分枝桿菌的RNA聚合酶3亞基，抑制RNA聚合酶活性，干擾分枝桿菌RNA的轉(zhuǎn)錄，阻礙蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用。RNA聚合酶是由四個不同的亞基a、00 '和0組成,分別由rpoA、rpoB、rpoC和rpoD基因編碼。全酶是由核心酶和0亞基共同構(gòu)成，核心酶是由兩條a鏈，一條0鏈和一條鏈4條肽鏈形成的具有催化能力的酶，0亞基作為啟動子特異地啟動轉(zhuǎn)錄。目前，對利福平耐藥已經(jīng)成為結(jié)核病治療方面一個較為嚴重的問題，并且這些耐藥菌很快還會產(chǎn)生對異煙肼的耐藥，從而形成耐多藥結(jié)核分枝桿菌。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌耐利福平的發(fā)生是由于其編碼RNA聚合酶3亞基的rpoB基因突變所致。rpoB基因含有3534bp的開放閱讀框架，編碼1178個氨基酸。此基因中少數(shù)密碼子突變會引起它所編碼的氨基酸的改變，使得RNA聚合酶分子上利福平結(jié)合位點的構(gòu)象發(fā)生改變，從而喪失了結(jié)合利福平的能力導致耐藥性的出現(xiàn)。超過95%的突變都是發(fā)生在rpoB基因的一個高度保守的81bp(507飛33位27個氨基酸)的核心區(qū)域內(nèi)，主要包括點突變、缺失突變等，因此該區(qū)又稱為RFP耐藥決定區(qū)。突變通常發(fā)生在531、526和516位密碼子，其他突變的密碼子還有511、513、514、515等，，但最常見的突變位點是531位絲氨酸(Ser)—亮氨酸(Leu)，526位組氨酸(His)—酪氨酸(Tyr) >516位天冬氨酸(Asp)—纟顏氨酸(Val),其中531位是突變率最高的密碼子?，F(xiàn)有的結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測所使用的方法，有絕對濃度法、RFLP法和測序法，其中絕對濃度法存在著二次培養(yǎng)，每次八周，周期長及污染機率高；RFLP法由于采用限制性內(nèi)切酶，而RFP耐藥決定區(qū)內(nèi)缺少合適的酶切位點，致rpoB基因突變的檢出率僅為10%，不能滿足臨床診斷的要求；測序法價格昂貴等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人在多年從事醫(yī)學檢測的工作和研究活動中，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測方法，存在著諸多缺陷，經(jīng)過不斷探索分析，反復大量試驗，目的在于提出一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，能夠快速、準確、低成本檢測出rpoB基因RFP耐藥決定區(qū)的全部突變，更有效地滿足臨床診治的需求。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，該方法采用以下步驟培養(yǎng)-提取-擴·增-純化-消化-分離-密集-顯像-鑒定，其中
A.培養(yǎng)，米集病人痰液標本于37°C進行一次培養(yǎng),制備結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物；
B.提取，從上述結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中提取總DNA；
C.擴增，采用包括新型上、下游引物在內(nèi)的反應體系進行PCR反應，擴增出258bpDNA基因片段；
所述反應體系為 IOXTaq Buffer 5 u 1,10mmol/L dNTP 4 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 Iu 1/pair, DNA 模板 2. 5ul,5u/ U I Taq DNA polymerase 0. 5ul,加滅菌雙蒸水至總體積50ul,
所述新型上游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3，
所述PCR反應的條件，采用94°C預變性5min，然后按93°C 0. 5min變性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，經(jīng)35個循環(huán)后，最后一次循環(huán)72°C延伸IOmin;
D.純化，對上述PCR反應擴增出的258bpDNA基因片段產(chǎn)物，采用核酸外切酶和DNA片段純化試劑進行提純；
E.消化，采用核糖核酸裂解酶對純化后的258bpDNA基因片段產(chǎn)物進行裂解消化，成為長度不同的多個基因片段；
所述消化的條件采用從30°C以0. 1°C /s的速度逐漸上升到80°C對基因片段進行梯度加熱以充分消化；
F.分離，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離經(jīng)消化后的多個基因片段；
G.密集，將分離后的多個基因片段轉(zhuǎn)移到醋酸纖維濾膜上，并加以提純、濃縮、密集；
H.顯像，采用標記地高辛顯色系統(tǒng)對密集后的醋酸纖維濾膜進行條帶著色顯像，得到基因片段圖譜；
I.鑒定，以正常型做對照，依據(jù)圖譜中條帶長度、數(shù)量、遷移位置及顯像強度鑒別確定結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因。本發(fā)明的這種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，與現(xiàn)有的檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法相比，由于采用一次培養(yǎng)，減少了培養(yǎng)次數(shù)，縮短了檢測周期，實現(xiàn)了快速檢測，又減少了細菌、真菌等雜菌的污染機率；由于反應體系中采用了能擴增覆蓋rpoB基因RFP耐藥決定區(qū)的新型上、下游引物，對目的基因片段進行擴增，生成的258bp基因片段適于消化生成良好的條帶；由于在消化前采用了純化步驟，排除了 PCR反應中異常擴增產(chǎn)物和未充分反應的剩余反應體系等雜質(zhì)；由于采用核糖核酸裂解酶進行裂解消化，無需選擇酶切位點，能檢測rpoB基因耐藥決定區(qū)內(nèi)的全部突變基因；由于采用梯度溫度消化，能對PCR產(chǎn)物進行充分消化；由于在顯像前將分離后的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到醋酸纖維濾膜上加以提純密集，增強了圖譜條帶的顯像清晰度；由于采用標記地高辛顯色系統(tǒng)，對條帶進行著色，排除了環(huán)境中核酸雜質(zhì)對圖譜的干擾，增強了圖譜條帶著色的識別性，從而提高了結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因檢測的檢出率和鑒定的準確率；由于采用了常規(guī)分子生物學設備及易得的藥劑，所以降低了成本?？傊?，本發(fā)明具有檢測快速、檢出率高、圖譜識別性好、鑒定準確、成本低等顯著優(yōu)點，更確切有效地滿足臨床診治的需求。


圖I表示本發(fā)明檢測流程 圖2表示結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因圖譜?！?br> 具體實施例方式結(jié)合附圖和實施例，進一步說明本發(fā)明一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法的具體步驟，其特征和優(yōu)點更加清楚。實施例，參見圖I本發(fā)明一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，采用以下步驟培養(yǎng)-提取-擴增-純化-消化-分離-密集-顯像-鑒定，其中
A.培養(yǎng)，采集肺結(jié)核病人痰液，接種于改良羅氏培養(yǎng)基(由無錫某某藥業(yè)公司提供)，于37 °C孵箱中一次培養(yǎng)4周；
B.提取，取一環(huán)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物溶于100U I蒸餾水，100°C加熱30分鐘，12，OOOg離心10分鐘，取上清液2. 5 ill作為PCR反應體系中的DNA模板，其余貯存于_20°C冰箱中備用;
C.擴增，采用以下的反應體系進行PCR擴增反應
IOXTaq Buffer 5. 0 y，10mmol/L dNTP 4. 0 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 I. Oy I/pair, DNA 模板 2. 5 U I, 5u/U I Taq DNA polymerase 0. 5 U I,加滅菌雙蒸水至總體積50u I ；
其中新型上游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3’ ；
該新型上、下游引物(由發(fā)明人設計，委托某某公司制備)，用無菌雙蒸水溶解并稀釋到20mmol/L,并貯存于_20°C冰箱中備用；
擴增反應條件，采用94°C預變性5min，然后按93°C 0. 5min變性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，經(jīng)35個循環(huán)后，最后一次循環(huán)72°C延伸lOmin，可擴增rpoB基因開放閱讀框共258bp長的基因片段；
D.純化，向擴增后的258bp基因片段中加入5U/ill核酸外切酶I(由某某生物工程有限公司提供)10iU，在37°C保溫15min，再采用離子交換柱(由某某生物工程有限公司提供)對258bp基因片段進行洗脫純化；
E.消化，將純化后的258bp基因片段在熱循環(huán)器中加熱至95°C，維持15s，再冷卻至30°C，加入一定量的核糖核酸裂解酶預混液(由某某生物有限公司提供)，所用量能滿足核糖核酸裂解酶預混液中 MOPS 10 mM, Tween-20 0. 05%, Nonidet P-40 0. 05%,MnCl2 0. 2 mM, Cleavase I enzyme 25U，pH 7. 5的組分含量的要求，再將溫度從30°C以0. I0C / s的速度升高到80°C，加入16ul終止液，得到含長度不同的基因片段的混合物；
F.分離,將10%變性聚丙烯酰胺凝膠板室溫聚合40min后,40°C加熱40min,將凝膠板溫度升至50°C，向凝膠板加樣孔注入10 — 15iU消化得到基因片段，在0. 5 X TBE緩沖液中垂直電泳(電壓600V，電流40-50mA) 20min，使長度不同的基因片段在凝膠板內(nèi)彼此間分離開；
G.密集
將凝膠板中的基因片段用半干法轉(zhuǎn)移到醋酸纖維濾膜上，使基因片段加以提純、濃縮、·磁隹
山: oH.顯像，將密集后的醋酸纖維濾膜按下述步驟處理
(1)用緩沖液I在室溫下沖洗醋酸纖維濾膜2次，每次3min，去除雜質(zhì)并維持pH值； 該緩沖液 I 的成分含IOOmmol / L tris-HCl, IOOmmol / L NaCl, SOmmoI /T, MgCl,
pH 7. 5 ；
(2)將沖洗處理后的醋酸纖維濾膜，放入封閉液并于室溫下浸泡45min，起到封閉未吸附核酸的空白部位的作用，以減少顯色液的異常著色；
該封閉液含以下成分封閉劑(Boehringer Mannheim) 0. 2%, NaCl 150mM, Tris-HClIOOmM,pH 7.5 ；
(3)加入40iiI堿性磷酸酶標記的地高辛抗體(20 ii g/ml)于37°C保溫30min,結(jié)合于基因片段上，以便更好地著色。(4)用緩沖液I在室溫下再漂洗醋酸纖維濾膜3次，每次3min，去除雜質(zhì)并維持pH值；
(5)用緩沖液2于室溫下浸泡醋酸纖維濾膜lOmin，固定地高辛抗體；
緩沖液 2 的成分含SDS 0. l%,NaCl 150mmol / L, tris-HCl IOOmmol / L，pH 7. 5 ；
(6)用300u g/ml的BCIP / NBT顯色液室溫避光浸泡醋酸纖維濾膜4h，并每隔I小時取出在顯微鏡下觀察顯色強度，使基因片段良好顯像；
(7)取出醋酸纖維濾膜晾干；
(8)對晾干后的醋酸纖維濾膜在成像系統(tǒng)中掃描，制成本發(fā)明的圖譜。I、鑒定
以正常型的條帶為對照，依據(jù)圖譜中條帶的分子量變大或變小、條帶的缺失或多出、條帶位置的遷移、條帶顯像強度的明暗等來鑒別突變基因。與正常型條帶一致的圖譜中的條帶表示未突變基因。參見圖2，以譜帶20為對照，譜帶I 一 19表示突變基因，被檢RFP耐藥決定區(qū)其它位未突變基因，圖中未示。其中，譜帶I表示526 (CAC->TAC)點突變，譜帶2表示531 (TCG->TTG)點突變，譜帶3表示526 (CAC->CTC)點突變，譜帶4表示517 — 518 (CAGAAC)缺失突變，譜帶5表示513 —516 (AATTCATGG)缺失突變，譜帶6表示514 (CAA_>TTC)點突變，譜帶7表示511 (CTG_>CGG)點突變，譜帶8表示512 (AGC->ACC)點突變，譜帶9表示513 (CAA_>AAA)點突變，譜帶10表示513(CAA->CTA)點突變，譜帶11表示517 — 518 (CAGAAC)缺失突變，譜帶12表示531 (TCG->TTG)點突變，譜帶13表示526 (CAC->AAC)點突變，譜帶14表示516 (CFG->CGG)點突變，譜帶15表示513 (CAA->AAA)點突變，譜帶16表示515 (CAC->GAC)點突變，譜帶17表示531 (TCG->TTG)點突變，譜帶18表示515 (CGG->CGT)點突變，譜帶19表示528 (CGC->CGT)點突變，譜帶20表示以正常型為對照。·
權(quán)利要求
1. 一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，其特征是該方法采用以下步驟培養(yǎng)-提取-擴增-純化-消化-分離-密集-顯像-鑒定，其中 A.培養(yǎng)，米集病人痰液標本于37°C進行一次培養(yǎng),制備結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物； B.提取，從上述結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中提取總DNA； C.擴增，采用包括新型上、下游引物在內(nèi)的反應體系進行PCR反應，擴增出258bpDNA基因片段； D.純化，對上述PCR反應擴增出的258bpDNA基因片段產(chǎn)物，采用核酸外切酶和DNA片段純化試劑進行提純； E.消化，采用核糖核酸裂解酶對純化后的258bpDNA基因片段產(chǎn)物進行裂解消化，成為長度不同的多個基因片段； F.分離，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離經(jīng)消化后的多個基因片段； G.密集，將分離后的多個基因片段轉(zhuǎn)移到醋酸纖維濾膜上，并加以提純、濃縮、密集； H.顯像，采用標記地高辛顯色系統(tǒng)對密集后的醋酸纖維濾膜進行條帶著色顯像，得到基因片段圖譜； I.鑒定，以正常型做對照，依據(jù)圖譜中條帶長度、數(shù)量、遷移位置及顯像強度鑒別確定結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，其特征是在擴增步驟中， 所述反應體系為 IOXTaq Buffer 5 u 1,10mmol/L dNTP 4 y 1，20mmol/L 新型上、下游引物 Iu 1/pair, DNA 模板 2. 5ul,5u/ U I Taq DNA polymerase 0. 5ul,加滅菌雙蒸水至總體積50ul ； 所述新型上游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-GCGGCGGATCAAGGTCAAGA 3’，新型下游引物采用地高辛標記序列5’ DIG-CGAGTGGCACACAGACGCGGC 3 ； 所述PCR反應的條件，采用94°C預變性5min，然后按93°C 0. 5min變性，采用58°C 45s退火，72°C Imin延伸，經(jīng)35個循環(huán)后，最后一次循環(huán)72°C延伸lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，其特征是在消化步驟中，所述消化的條件采用從30°C以0. l°C/s的速度逐漸上升到80°C對基因片段進行梯度加熱以充分消化。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學檢測領域，涉及結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性檢測方法，提出一種檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB突變基因的方法，采用以下步驟培養(yǎng)—提取—擴增—純化—消化—分離—密集—顯像—鑒定，與現(xiàn)有的同類檢測方法相比，由于采用一次培養(yǎng)，采用新型上、下游引物，由于采用純化步驟，采用裂解消化，采用在顯像前經(jīng)過密集步驟，由于采用標記地高辛抗體顯色系統(tǒng)，以及采用常規(guī)設備和易得藥劑，所以本發(fā)明具有檢測快速、檢出率高、圖譜識別性好、鑒定準確、成本低等顯著優(yōu)點，更確切有效地滿足臨床診治的需求。
文檔編號C12Q1/68GK102787168SQ20121029260
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者包東武, 滿永宏, 羅小萌 申請人:南陽醫(yī)學高等專科學校