專利名稱：一種快速鑒定辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉抗藥性的方法及專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關(guān)基因CesA3核苷酸點(diǎn)突變的鑒定及其在殺菌劑丁吡嗎啉抗性監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，具體公開(kāi)ー種快速鑒定辣椒疫霉CesA3基因的核苷酸點(diǎn)突變及其對(duì)丁吡嗎啉抗藥性的分子檢測(cè)方法及專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是ー種重要的植物病原卵菌，由辣
椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是ー種世界性分布的毀滅性病害，在我國(guó)普遍發(fā)生，且有逐年加重趨勢(shì)。在氣候適宜的的條件下，短期內(nèi)就可爆發(fā)，蔓延速度極快，一般發(fā)病可引起30%產(chǎn)量損失，嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致辣椒絕收。辣椒疫霉還可以侵染茄科、豆科、葫蘆科等多種作物，引起產(chǎn)量損失。目前，在農(nóng)業(yè)措施、抗病育種、生物防治、植物檢疫和化學(xué)防治等諸多防治措施中，化學(xué)防治仍是控制植物病原卵菌病害的主要手段，在卵菌的病害防治中發(fā)揮著不可替代的作用。以甲霜靈為代表的苯酰胺類殺菌劑，成為卵菌病害化學(xué)防治的里程碑，然而，目前病原卵菌對(duì)該類殺菌劑已普遍產(chǎn)生抗藥性，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中苯酰胺類殺菌劑的使用受到限制。丁卩比嗎啉(pyrimorph)是2003年由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)制的新型殺菌劑,在中國(guó)已獲批臨時(shí)登記，用于辣椒疫病和番茄晚疫病等卵菌病害的防治。丁吡嗎啉的作用機(jī)制目前還不明確，但研究顯示該藥劑與CAA類殺菌劑具有交互抗藥性，因此，推測(cè)丁吡嗎啉與CAA類殺菌劑具有相似的作用機(jī)制。已有研究表明，與纖維素合成相關(guān)的蛋白酶cesA3是CAA類殺菌劑的作用靶標(biāo)(朱書(shū)生等，2007 ；Blum etal. ,2010) 迄今，尚未發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉敏感性下降的報(bào)道。然而，毎年近20，OOOkg丁吡嗎啉用于田間生產(chǎn)，且逐年增多。而且在室內(nèi)條件下通過(guò)自然篩選和藥劑馴化的方式獲得了對(duì)丁吡嗎啉產(chǎn)生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且抗性菌株的生存適合度較高，表明具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn)。因此，在使用丁吡嗎啉防治卵菌病害的過(guò)程中需要注意避免抗藥性的產(chǎn)生，加強(qiáng)檢測(cè)和早期預(yù)警病原菌對(duì)丁吡嗎啉的抗性發(fā)生發(fā)展情況，這有助于指導(dǎo)丁吡嗎啉的科學(xué)使用，延緩其抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，延長(zhǎng)藥劑的使用壽命?？梢杂糜诓≡顾幮詸z測(cè)的常規(guī)方法包括菌絲生長(zhǎng)測(cè)定法、菌絲干重測(cè)定法，孢子萌發(fā)測(cè)定法、瓊脂展布法和抑菌圈測(cè)定法等。但是這些方法都需要通過(guò)離體條件下分離培養(yǎng)獲得病原菌的純培養(yǎng)物，測(cè)定藥劑對(duì)病原菌的EC5tl，借助已建立的敏感基線，比較敏感和抗性菌株的差異，試驗(yàn)需要多個(gè)處理，多次重復(fù)，因此檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大、消耗的人力資源和材料較多。而且上述常規(guī)方法檢測(cè)靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在I %以上才能被檢測(cè)到。由于病原菌的繁殖、傳播速度一般都很快，在自然界存在的數(shù)量有很大，因此經(jīng)過(guò)幾次藥劑選擇后,抗藥性病原菌亞群體可能會(huì)成為致病病原群體的主體,造成病害大流行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，限制性酶切PCR、等位特異PCR分子技術(shù)開(kāi)始在病原菌抗藥性檢測(cè)中應(yīng)用。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，不但節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間(一般不超過(guò)4h)、提高了工作效率，而且提高了檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)頻率在10_5 10_4，更適用于檢測(cè)低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法?？梢灶A(yù)測(cè)，分子檢測(cè)技術(shù)將在病害的可持續(xù)管理系統(tǒng)中發(fā)揮愈來(lái)愈重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點(diǎn)的方法及其專用引物對(duì)。本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟以待測(cè)辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為168 bp的片段，則所述待測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點(diǎn)；所述突變位點(diǎn)指辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸為A。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO 5中自5’末端起第3365位核苷酸。上述過(guò)程中，所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為58°C。本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點(diǎn)的引物對(duì)，由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供辣椒疫霉中CesA3基因或蛋白的突變位點(diǎn)。本發(fā)明所提供的辣椒疫霉中CesA3基因的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉中CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸為A。所述CesA3基因的基因組序列自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO :5中自5’末端起第3365位核苷酸。本發(fā)明所提供的辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸為賴氨酸。所述CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸也就是SEQ ID NO :4中自N端起第1077位氨基酸。上述任一所述突變位點(diǎn)在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述抗藥性為抗丁吡嗎啉。上述應(yīng)用中，存在所述突變位點(diǎn)的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :4所示蛋白或SEQ ID NO :5所示基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的檢測(cè)辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，有助于快速、靈敏地檢測(cè)田間辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉的抗藥性發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)，為抗藥性的治理提供技術(shù)支持，便于及時(shí)調(diào)整病害防治策略，以延緩和控制抗藥性的進(jìn)ー步發(fā)展。


圖I為抗丁吡嗎啉的辣椒疫霉菌株及敏感菌株的cesA3基因DNA序列比較發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的ー個(gè)突變位點(diǎn)。Hd3和Hdll為敏感親本菌株，R3-2，R3-3，Rll-I為抗性菌株。圖2為采用特異性引物對(duì)擴(kuò)增對(duì)丁吡嗎啉敏感和抗性的辣椒疫霉菌株。引物對(duì)CF1077(SEQ ID NO I)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于檢測(cè)對(duì)丁吡嗎啉的敏感和抗性的辣椒疫霉菌株，引物對(duì)R1077B(SEQ ID NO 2)+R1077 (SEQ ID NO :3)用于檢測(cè)辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉的抗性菌株。其中Hd3，Hdll為辣椒疫霉敏感親本菌株；R3-2，R3-3，Rll-I為抗性菌株。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。文中“抗性菌株”均指對(duì)殺菌劑丁吡嗎啉抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指對(duì)殺菌劑丁吡嗎啉敏感的辣椒疫霉菌。下述實(shí)施例中使用的辣椒疫霉菌株為抗性菌株R3-2，R3-3，和Rll-I ;敏感菌株Hd3 和 HdlI。上述各個(gè)菌株均經(jīng)過(guò)菌落生長(zhǎng)測(cè)定法進(jìn)行抗藥性驗(yàn)證。上述菌株Hd3、Hdll、R3-2、R3_3和Rll-I采自中國(guó)河北地區(qū)。經(jīng)過(guò)現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為辣椒疫霉。上述各個(gè)菌株均經(jīng)過(guò)菌絲生長(zhǎng)測(cè)定法進(jìn)行抗藥性驗(yàn)證。實(shí)施例I、辣椒疫霉對(duì)丁吡嗎啉的敏感性測(cè)定三株辣椒疫霉抗性突變體，菌株編號(hào)分別為R3-2，R3-3，和Rll-I ;兩株辣椒疫霉敏感親本菌株，菌株編號(hào)分別為Hd3和HdlI。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g，瓊脂粉13g，葡萄糖18g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20分鐘。I、實(shí)驗(yàn)步驟如下I)將丁吡嗎啉用ニ甲基亞砜(DMSO)配成IO4U g/ml的母液。對(duì)于辣椒疫霉敏感菌株的敏感性測(cè)定，將丁吡嗎啉逐級(jí)稀釋成187. 5 ii g/mL, 375 u g/mL, 750 u g/mL,
1.5 X IO3 u g/mL, 3 X IO3 u g/mL, 4 X IO3 u g/mL的濃度梯度；對(duì)于辣椒疫霉疫霉抗性菌株的敏感性測(cè)定，將供試藥劑丁吡嗎啉逐級(jí)稀釋成312. 5 u g/mL, 625 u g/mL, I. 25 X IO3U g/mL,
2.5 X IO3 u g/mL, 5 X IO3 u g/mL, I X IO4 u g/mL 的濃度梯度。2)對(duì)于辣椒疫霉敏感菌株的測(cè)定，用移液槍吸取藥液60 U I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養(yǎng)基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養(yǎng)基倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，設(shè)只加60 ill DMSO的處理為空白對(duì)照，每個(gè)比例藥劑設(shè)3次重復(fù)；對(duì)于辣椒疫霉抗性菌株的測(cè)定，用移液槍吸取藥液600 ill加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養(yǎng)基中，使溶劑含量為1%，混勻，將帶藥的培養(yǎng)基倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，設(shè)只加600 ii 1DMS0的處理為空白對(duì)照,每個(gè)比例藥劑設(shè)3次重復(fù)。3)辣椒疫霉在PDA平板上培養(yǎng)5天后，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為0. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對(duì)照培養(yǎng)基中，置于28°C培養(yǎng)箱中黒暗培養(yǎng)，4d后測(cè)量菌落直徑。4)十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)菌落平均直徑值計(jì)算出各復(fù)配比例對(duì)供試菌株的菌絲生長(zhǎng)的抑制率。然后將抑制率轉(zhuǎn)化成機(jī)率值(Y)，藥劑濃度轉(zhuǎn)換成以10為底的對(duì)數(shù)值(X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，分別求出供試?yán)苯芬呙咕甑亩玖貧w曲線方程Y = a+bX,以及相關(guān)系數(shù)r和有效抑制中濃度EC5tl值，并計(jì)算抗性倍數(shù)。
抗性倍數(shù)=抗性菌株的平均EC5tl/敏感親本菌株的平均EC5tl2、結(jié)果表15株辣椒疫霉菌株對(duì)丁吡嗎啉的敏感性
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟 以待測(cè)辣椒疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為168bp的片段，則所述待測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因存在或候選存在突變位點(diǎn)； 所述突變位點(diǎn)指辣椒疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸為A。
(所述CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸也就是SEQ ID NO :5中自5’末端起第3365位核苷酸)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中，退火溫度為58°C。
3.—種檢測(cè)或輔助檢測(cè)辣椒疫霉中CesA3基因是否存在突變位點(diǎn)的引物對(duì)，由SEQ IDNO :2和SEQ ID NO 3所示DNA分子組成。
4.辣椒疫霉中CesA3基因的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉中CesA3基因的自5’末端起第3365位核苷酸為A。
5.辣椒疫霉中CesA3蛋白的一個(gè)突變位點(diǎn)，為辣椒疫霉中CesA3蛋白的自N端起第1077位氨基酸為賴氨酸。
6.權(quán)利要求4或5所述突變位點(diǎn)在鑒定辣椒疫霉抗藥性中的應(yīng)用；所述抗藥性為抗丁吡嗎啉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于具有所述突變位點(diǎn)的辣椒疫霉具有或候選具有抗藥性。
8.SEQ ID NO 4所示蛋白。
9.SEQ ID NO 5所示基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及辣椒疫霉纖維素合酶相關(guān)基因CesA3核苷酸點(diǎn)突變的鑒定及其在殺菌劑丁吡嗎啉抗性監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，具體公開(kāi)了一種鑒定辣椒疫霉CesA3基因3365位核苷酸突變對(duì)丁吡嗎啉產(chǎn)生抗藥性的分子檢測(cè)方法及專用引物。該特異性引物對(duì)，由SEQ ID N02和SEQ ID NO3所示的DNA分子組成。本發(fā)明提供的檢測(cè)辣椒疫霉對(duì)殺菌劑丁吡嗎啉抗藥性的分子診斷方法，靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)周期短，可以用于高通量地監(jiān)測(cè)田間辣椒疫霉對(duì)殺菌劑丁吡嗎啉的抗性發(fā)生、發(fā)展情況，實(shí)現(xiàn)抗性病害的早期預(yù)警，對(duì)及時(shí)有效地控制抗藥性病害的發(fā)展具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102851363SQ201210294998
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者劉西莉, 龐智黎, 陳磊, 邵菁芃, 李健強(qiáng), 覃兆海, 劉鵬飛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)