專利名稱：臍帶血干細胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激的制作方法
臍帶血干細胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激本申請是2007. 10. 31提交的CN 200780046542. 0，題為“臍帶血干細胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激”的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2006年11月I日提交的美國臨時申請No. 60/856，071的優(yōu)先權，其公開對于所有目的通過引用完整地整合在本申請中。
背景技術：
對于人干細胞的鑒定、分離和產(chǎn)生存在著相當大的興趣。人干細胞通常是能夠自我更新并產(chǎn)生各種成熟的人的細胞系的全能或多能的前體細胞。這一能力是組織和器官發(fā) 育所必需的細胞分化和特化的基礎。最近在干細胞移植方面的成功已經(jīng)為由于疾病、接觸有毒化學品和/或輻射所引起的骨髓肅清(myeloablation)后的骨髓重建和/或補充提供了新的臨床工具。進一步的證據(jù)證明，干細胞可以用于重塑許多(如果不是所有)組織并恢復生理和解剖學功能性。已經(jīng)對許多不同種類的哺乳動物干細胞進行了表征。例如，胚胎干細胞、胚胎生殖細胞、成人干細胞以及其他承認的干細胞或祖細胞是已知的。事實上，對某些干細胞不但進行了分離和表征，而且在允許有限程度分化的條件下對其進行了培養(yǎng)。由于人群中HLA類型的數(shù)千萬種可能組合，存在著一個基本問題，即非常難以獲得充分數(shù)量、種群和多樣性的能夠分化成能與單個患者HLA匹配的所有細胞類型的人干細胞HLA類型。不同HLA類型的干細胞的供給嚴重短缺。由于其在各種疾病和癥狀(包括惡性腫瘤、先天性代謝缺陷、血紅蛋白病和免疫缺陷)治療中的重要性，獲得各種HLA類型的干細胞的足夠來源會是非常有利的。出于幾個原因難以獲得足夠數(shù)量的人干細胞。首先，部分是由于在血液和組織中所發(fā)現(xiàn)的數(shù)量非常有限，在成人組織中分離正常產(chǎn)生的干細胞群在技術上是困難的且昂貴的。其次，從胚胎或胎兒組織(包括流產(chǎn)胎兒)中獲得這些細胞引起了倫理問題。因此，不需要使用從胚胎或胎兒組織中獲得的細胞的其他來源是進一步發(fā)展干細胞臨床使用的根本問題。然而，只有很少的干細胞、尤其是人干細胞的可行的其他來源，因此其供給是受到限制的。而且，從其他來源獲得用于治療和研究目的的足夠數(shù)量干細胞通常是費力的。例如，美國專利No. 5，486，359公開了源自骨髓的人間葉細胞樣干細胞(HMSC)組合物。通過對不含與造血細胞或分化的間葉細胞相關標志的粘附骨髓或骨膜細胞的陽性選擇獲得均一的HMSC組合物。所分離的間葉細胞樣細胞群表現(xiàn)出與間葉細胞樣干細胞相關的特征、具有在培養(yǎng)基中不分化而再生的能力、并且在體外誘導或體內(nèi)置于受損組織處時具有分化成特定間葉細胞系的能力。然而，這樣的方法的缺點在于，為了隨后進行HMSC分離，首先需要從供體中以侵入和疼痛的方式收集骨髓或骨膜細胞。臍帶血是另一種已知的間葉細胞樣干細胞以及造血干細胞和祖細胞的來源。臍帶血干細胞通常冷凍保藏用于重建造血功能，這是骨髓和其他相關移植中使用的一種治療方法(參見例如美國專利5，004, 681和5，192，553)。用于收集臍帶血的常規(guī)技術基于使用針或套管，其在重力幫助下將臍帶血從胎盤排出(參見例如美國專利5，004，681,5, 192，553、5，372，581和5，415，665)。針或套管通常置于臍帶經(jīng)脈中，并輕輕按摩胎盤以幫助臍帶血從胎盤排出。然而，由臍帶血獲得干細胞的主要限制在于所獲得的臍帶血體積經(jīng)常不足，導致細胞數(shù)量不足以在移植后有效重建骨髓。干細胞具有在大量各種疾病和損傷的治療中使用的潛力，這包括神經(jīng)系統(tǒng)損傷(例如脊髓損傷)、惡性腫瘤、遺傳疾病、血紅蛋白病和免疫缺陷。然而，由于其收集的限制、通常從臍帶血收集的細胞數(shù)量不足(尤其是如果用于治療成年患者)、以及建立大臍帶血庫的高成本，臍帶血干細胞嚴重短缺。因此，在本領域內(nèi)，對于在細胞培養(yǎng)體系中能夠將干細胞擴展到足以進行移植的數(shù)量的臍帶血干細胞培養(yǎng)方法存在著強烈需求。在本領域內(nèi)對于提高所移植的干細胞的生長和存活并降低或延緩受體中的干細胞排斥的方法也存在需求。本發(fā)明滿足了這些和其他需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用含鋰鹽的體外細胞培養(yǎng)體系刺激人臍帶血干細胞產(chǎn)生生長因子的方法以及擴展(expanding)臍帶血干細胞的方法。本發(fā)明也提供了通過移植前用鋰鹽 處理細胞提高所移植的臍帶血干細胞的存活和生長的體內(nèi)方法。本發(fā)明進一步提供了通過移植后給予鋰鹽降低所移植的臍帶血干細胞排斥的體內(nèi)方法。本發(fā)明部分基于鋰刺激干細胞產(chǎn)生或表達生長因子這一意外發(fā)現(xiàn)上。不局限于任何具體理論，鋰對干細胞增殖、存活和免疫排斥的作用是由干細胞對鋰鹽的應答中產(chǎn)生或表達的生長因子的數(shù)量所介導的。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了用于刺激人臍帶血細胞產(chǎn)生生長因子的方法，所述方法包括在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。鋰通常刺激諸如細胞存活因子、抗分化因子及其組合的生長因子的產(chǎn)生和表達。細胞存活因子的例子包括但不限于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、肝素結合表皮生長因子(ΗΒ-EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、色素上皮細胞衍生因子(PEDF)、神經(jīng)鞘瘤衍生生長因子(SDGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子a (TGF-α )、轉化生長因子-β(TGF-β )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如BMP I-BMP 15)、生長分化因子-9 (⑶F-9)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌肉生長抑制素(myostatin)(⑶F-8)、紅細胞生成素(ΕΡ0)、血小板生成素(ΤΡ0)、以及它們的組合。白血病抑制因子(LIF)是一種優(yōu)選的抗分化因子。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的例子包括但不限于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-I (NT-1)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、以及它們的組合。非限制性的細胞因子的例子包括IL-I a、IL-I β、IL_2、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27、TNF-a、IFN-a、IFN-β、IFN-y、CXCL1/GR01/GR0a、CXCL2/GR02、CXCL3/GR03、CXCL4/PF-4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15、CXCL16、CXCL17/DMC、CCLI、CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1 a、CCL4/MIP-I β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/CCL10、CCLll/ 嗜伊紅粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/MIP-5、CCL16/LEC、CCL 17/TARC、CCL 18/MIP-4、CCL 19/MIP-3 β、CCL20/MIP-3 α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF1、CCL24/嗜伊紅粒細胞趨化蛋白_2、CCL25/TECK、CCL26/嗜伊紅粒細胞趨化蛋白-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CL1、CL2、CX3CLU 以及它們的組合。適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰以及硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約 O. 5、1、1· 5、2、2· 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或5mM)存在于所述細胞培養(yǎng)基中。在一優(yōu)選實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在于細胞培養(yǎng)基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物(lithium mimetic compound)培養(yǎng)所述胳帶血細胞(參見例如 Gould 等，Neuropsychopharmacology, 30:1223-1237 (2005)；以及Gould, Expert Opin. Ther. Targets, 10:377-392 (2006))。在某些其他情況下，可以用類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細胞，例如丙戍酸(參見例如Hahn等，J. Psychiatr.Res. ,39:355-363(2005) ;Shao 等，Biol. Psychiatry, 58:879-884 (2005);以及 Dokucu 等， Neuropsychopharmacology, 30:2216-2224 (2005))、丙戍酸二鈉(參見例如 Calabrese 等，Am. J. Psychiatry, 162:2152-2161 (2005))、以及卡巴咪嗪(參見例如 Bazinet 等，Biol.Psychiatry,59:401-407 (2006))。在一些實施方式中，首先將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細胞。在其他實施方式中，首先將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞并隨后用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細胞的臍帶血單位中的干細胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養(yǎng)技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所述臍帶血干細胞進行培養(yǎng)。另一方面，本發(fā)明提供了用于擴展人臍帶血細胞的方法，該方法包括在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。適當?shù)匿圎}包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約O. 5、1、1. 5、2、
2.5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、3、3· 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4· 5 或 5mM)存在于所述細胞培養(yǎng)基中。在一優(yōu)選實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在于所述細胞培養(yǎng)基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養(yǎng)所述臍帶血細胞。在某些其他情況下，可以用類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細胞，例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、卡巴咪嗪、以及它們的組合。如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細胞的臍帶血單位中的干細胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養(yǎng)技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所述臍帶血干細胞進行培養(yǎng)。另一方面，本發(fā)明提供了用于提高對象中所移植的人臍帶血細胞的存活和生長的方法，所述方法包括(a)在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；以及(b)將步驟(a)的細胞給予對象。適用于本發(fā)明所述方法用于提高所移植的臍帶血細胞的存活和生長的鋰鹽的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰和硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在一些實施方式中，所述鋰鹽(例如氯化鋰)以約O. 5至約5mM的濃度(例如約O. 5、I、I. 5、2、2. 5,2. 6,2. 7,2. 8、
2.9、3、3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5、4、4. 5或5mM)存在于所述細胞培養(yǎng)基中。在一優(yōu)選實施方式中、所述鋰鹽以約3mM的濃度存在于所述細胞培養(yǎng)基中。在某些情況下，可以用鋰模擬化合物培養(yǎng)所述臍帶血細胞。另外，可以用類似于鋰的精神藥物培養(yǎng)所述臍帶血細胞，例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、卡巴咪嗪、以及它們的組合。如上所述，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡血漿并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡血漿的臍帶血單位中的干細胞。另外，可以將收集的臍帶血單位基本耗盡紅細胞并隨后可以用鋰鹽培養(yǎng)存在于耗盡紅細胞的臍帶血單位中的干細胞?？梢栽诤圎}的培養(yǎng)基中使用精通本領域的人員已知的任何體外培養(yǎng)技術在耗盡血漿或耗盡紅細胞的臍帶血單位冷凍保藏之前或之后對所述臍帶血干細胞進行培養(yǎng)。所述對象通常是一種哺乳動物，如人。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的損傷的情況下，所述培養(yǎng)的細胞優(yōu)選脊柱內(nèi)給藥。 在某些情況下，所述方法進一步包括將鋰鹽(如氯化鋰)給予哺乳動物(如人)。所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限于口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、以及肌內(nèi)的方式給予。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約lmg/kg至約150mg/kg(例如約1、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75、100、125、或 150mg/kg)的劑量給予所述對象。在一優(yōu)選實施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。本發(fā)明所述培養(yǎng)的細胞和鋰鹽可以單獨或與根據(jù)給藥途徑和常規(guī)制藥實踐所選擇的制藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實例，可以將常規(guī)緩沖鹽溶液(例如約135-150mM NaCl)用作制藥上允許的載體。其他適當?shù)妮d體包括但不限于水、緩沖的水、
O.4%鹽溶液、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓制藥科學》(REMINGTON S PHARMACEUTICALSCIENCES),賓西法尼亞州費城麥克出版社(Mack Publishing Co.，Philadelphia, PA),第18版，(1995))中描述了其他適用于運送本發(fā)明所述培養(yǎng)的細胞和鋰鹽的載體。另一個方面，本發(fā)明提供了用于降低對象中所移植的臍帶血細胞排斥的方法，所述方法包括細胞移植后將鋰鹽給予所述對象。所述對象通常是哺乳動物(如人)。在對象已被診斷為諸如脊髓損傷的損傷的情況下，所述細胞優(yōu)選通過脊柱內(nèi)給藥移植。適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽的非限制性實例包括氯化鋰、碳酸鋰、和硫酸鋰。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。在某些情況下，可以在細胞移植前使用體外培養(yǎng)技術在含鋰鹽的培養(yǎng)基中對臍帶血干細胞進行擴展。所述臍帶血干細胞可以從所收集的基本耗盡血漿和/或紅細胞的臍帶血單位中獲得。所述鋰鹽(例如氯化鋰)通常通過包括但不限于口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、以及肌內(nèi)等方式給藥。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約lmg/kg至約150mg/kg(例如約 1,5,6,7,8,9,10,11, 12，13，14，15，20，25，50，75，100，125，或 150mg/kg)的劑量對所述對象給藥。在一優(yōu)選實施方式中，所述鋰鹽以約10mg/kg的劑量給藥。在某些情況下,可以用鋰模擬化合物或類似于鋰的精神藥物(例如丙戊酸、丙戊酸二鈉、和/或卡巴咪嗪)對對象給藥以降低所移植的臍帶血干細胞的排斥。本發(fā)明所述的鋰鹽可以單獨或與根據(jù)給藥途徑和常規(guī)制藥實踐所選擇的制藥上允許的載體混合給藥。作為非限制性實例，可以將常規(guī)緩沖鹽溶液(例如約135-150mMNaCl)用作制藥上允許的載體。其他適當?shù)妮d體包括但不限于水、緩沖的水、O. 4%鹽溶液、
O.3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓制藥科學》(REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES),賓西法尼亞州費城麥克出版社，第18版，(1995))中描述了其他適用于運送本發(fā)明所述鋰鹽的載體。所述鋰鹽可以在細胞移植后幾分鐘、幾小時、幾天、幾周、幾個月和/或幾年內(nèi)給予對象。在一些實施方式中，細胞移植后可以用第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多劑量的相同或不同的鋰鹽對對象進行治療。在某些情況下，也可以在細胞移植前和/或細胞移植過程中用I個或多個劑量的所述鋰鹽對對象給藥。本發(fā)明的其他特征、目標和優(yōu)點及其優(yōu)選實施方式會通過以下的詳細描述、實施例和權利要求加以明確。


·圖I顯示了證明鋰促進N01. I細胞體外增殖的數(shù)據(jù)。圖2顯示了證明鋰刺激N01. I細胞體外生成生長因子的數(shù)據(jù)。圖3顯示了通過定量實時PCR測定的證明鋰促進N01. I細胞體內(nèi)增殖的數(shù)據(jù)。圖4顯示了通過基因組PCR測定的證明鋰促進N01. I細胞體內(nèi)增殖的數(shù)據(jù)。圖5顯示了通過組織學分析測定的證明鋰促進N01. I細胞體內(nèi)存活的數(shù)據(jù)。左嘴側部；右尾側部。比例尺=lmm。圖6顯示了證明鋰刺激N01. I細胞體內(nèi)產(chǎn)生生長因子的數(shù)據(jù)。圖7顯示了證明脊髓損傷后鋰對神經(jīng)保護的作用的數(shù)據(jù)。圖8顯示了證明鋰促進人臍帶血細胞體外增殖的數(shù)據(jù)。圖9顯示了證明鋰刺激人臍帶血細胞體外產(chǎn)生生長因子的數(shù)據(jù)。圖10顯示了證明鋰刺激人臍帶血細胞體外生成生長因子的其他數(shù)據(jù)。發(fā)明詳細描述I.導言鋰用于治療雙相型障礙和其他神經(jīng)學癥狀已有50多年了(參見例如Manji等，Biol. Psychiatry, 46:929-940 (1999))。躁郁癥患者經(jīng)常需要終身攝入鋰，其治療血液濃度為約ImM。盡管如此的高濃度，鋰是相對無毒的。鋰對細胞具有許多潛在作用機制(Jope，Mol. Psychiatry,4:117-128(1999))。例如，鋰調(diào)節(jié)包括 GSK-3、Akt、cAMP 依賴型激酶和蛋白激酶C在內(nèi)的多種酶及其對應的第二信使和轉錄因子的活性。對鋰對神經(jīng)細胞作用的研究顯示，鋰可以刺激神經(jīng)再生(Bustuoabad等，Medicina, 40:547-552 (1980))和神經(jīng)祖細胞增殖(Hashimoto 等，Neuroscience,117:55-61 (2003))、在中風模型中誘導神經(jīng)元和星形膠質細胞在受傷部位附近的增MCChuang, Crit. Rev. Neurobiol, 16:83-90 (2004))、提高膠質細胞在腦下垂體中的增殖(Levine 等，Cell Prolif.，35:167-172 (2002) ；Levine 等，Cell Prolif.,33:203-207 (2000))、刺激白細胞遷移能力(Azzara等，Haematologica，72:121-127 (1987)；Azzara等· Acta Haematol, 85:100-102 (1991))、提高海馬神經(jīng)祖細胞的神經(jīng)元分化(Kim等，J. Neurochem.，89:324-336 (2004))、以及增強小鼠海馬區(qū)中的神經(jīng)形成(Laeng等，J. Neurochem.，91:238-251 (2004))。然而，這些參考文獻都沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細胞產(chǎn)生生長因子的影響。同樣地，這些參考文獻沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細胞增殖和存活的影響。此外，鋰對骨髓的作用的研究顯示，鋰可以提高集落刺激活性產(chǎn)生并加快粒細胞生成和紅血球生成(Labedzki 等，Klin. Wochenschr. , 58:211-218 (1980))、降低化療引起的對粒細胞生成和巨核細胞生成的抑制(Korycka等，Arch. Immunol. Ther. Exp.,39:501-509 (1991))、加快全身福射后的骨髓恢復(Johnke 等，Int. J. Cell Cloning,9:78-88(1991))、逆轉由同時使用環(huán)戊丙酸雌二醇和乙烯雌酚所引起的骨髓發(fā)育不全和血細胞減少(Hall，J. Am. Vet. Med. Assoc, 200:814-816 (1992))、以及恢復氯氮平引起的粒細胞減少患者中的正常血細胞計數(shù)(Papetti等，Encephale. ,30:578-582(2004))。然而,這些參考文獻都沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細胞產(chǎn)生生長因子的影響。同樣地，這些參考文獻沒有考查體內(nèi)和體外鋰對人臍帶血干細胞增殖和存活的影響。
因此，本發(fā)明是部分基于在含有諸如氯化鋰的鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人臍帶血干細胞可以刺激這些干細胞生成生長因子從而促進其增殖和存活這一意外發(fā)現(xiàn)上的。事實上，如本發(fā)明的方法所述培養(yǎng)臍帶血干細胞成倍(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍)地提高了生長因子的表達量和干細胞數(shù)量。本發(fā)明還基于在移植前用鋰鹽處理臍帶血干細胞提高所移植干細胞的存活和增長、以及臍帶血干細胞移植后用鋰鹽給藥降低所移植干細胞的免疫排斥這一意外發(fā)現(xiàn)。因此，這里所述的方法不僅允許對臍帶血中所發(fā)現(xiàn)的有限供給的干細胞的充分擴展，而且通過例如提高所移植干細胞的存活和生長以及/或降低所移植干細胞的免疫排斥，提供了對移植受體臨床結果的顯著改善。II.定義如這里所使用的，除非另有說明，以下術語具有歸其所有的含義。術語“干細胞”是指具有在不確定的時間段內(nèi)分裂并產(chǎn)生專門化細胞的能力的任何細胞。干細胞源于所有胚層(即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)。典型的干細胞來源包括胚胎、骨髓、外周血、臍帶血、胎盤血、肌肉組織和脂肪組織。干細胞可以是全能的，這意味著它們能生長和分化成體內(nèi)的任何細胞。在哺乳動物中，只有受精卵和早期胚胎細胞是全能性的。另外，干細胞可以是多能的，這意味著它們能產(chǎn)生生物體內(nèi)的大部分組織。例如，多潛能(pluripotent)干細胞可以產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、肝、血液、肌肉、骨等等的細胞。多能干細胞的例子包括但不限于臍帶血干細胞、神經(jīng)干細胞、造血干細胞、脂肪衍生干細胞、間葉細胞樣干細胞、胎盤衍生干細胞、乳牙衍生干細胞以及毛囊干細胞。相反，多能(multipotent)干細胞或成人干細胞通常產(chǎn)生有限種類的細胞。除非另有說明，這里所使用的術語干細胞包括祖細胞。術語“祖細胞”是指品系明確的細胞，即一種祖細胞可以產(chǎn)生限于單一品系的后代。祖細胞的非限制性的例子包括神經(jīng)元系、肝系、腎組織系、脂肪組織系、成骨細胞系、破骨細胞系、肺泡系、心臟系、腸系或內(nèi)皮系的前體細胞。這里所使用的術語“培養(yǎng)”是指將干細胞保持在其能增殖并避免衰老的條件下。例如，在本發(fā)明中，干細胞在含有鋰鹽和可選地一種或多種生長因子(即生長因子雞尾酒)的
培養(yǎng)基中培養(yǎng)。術語“刺激生長因子產(chǎn)生”是指使用鋰鹽提高來自干細胞的一種或多種生長因子的表達(例如mRNA、蛋白質)。通常，生長因子表達的提高是與在無鋰鹽條件下培養(yǎng)的對照干細胞相比而言的。如實施例I和2中所述，本發(fā)明的方法(即當干細胞在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時)可以顯著刺激干細胞產(chǎn)生生長因子?？梢酝ㄟ^用鋰鹽培養(yǎng)干細胞所刺激的生長因子的例子包括但不限于細胞存活因子(例如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等等)、抗分化因子(例如白血病抑制因子(LIF)等待)、以及它們的組合。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的非限制性例子包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-I (NT-1)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、大腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子(NGF)(例如NGFa、NGFP和NGF Y )、以及它們的組合。細胞因子的例子包括如上所述的屬于白細胞介素或干擾素亞家族的那些因子。術語“體外擴展”是指在實驗室中培養(yǎng)干細胞。這樣的細胞從哺乳動物中提取并通過在適當環(huán)境中(例如在含鋰鹽的培養(yǎng)基中)培養(yǎng)產(chǎn)生額外的細胞量。如果可能，建立穩(wěn)定的細胞系以進行細胞的連續(xù)繁殖。如實施例I和2中所述，本發(fā)明的方法(即當干細胞在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時)可以顯著促進干細胞的體外增殖。術語“提高存活和生長”是指使用鋰鹽促進所移植的干細胞的活力和增殖。通常， 所移植的干細胞的存活和生長的提高是與在無鋰鹽條件下培養(yǎng)和移植的對照干細胞相比而言的。如實施例I中所述，本發(fā)明的方法(即用鋰處理的干細胞對哺乳動物給藥)可以顯著提高所移植的干細胞的存活和生長。有活力的細胞是活的并通常具有生長和分裂能力的細胞。精通本領域的人員知道確定細胞活力的方法，例如通過其排斥臺盼藍染液的能力。術語“降低排斥”是指使用鋰鹽以降低、延遲或消除所移植細胞的免疫排斥風險。通常，所移植的干細胞的排斥的降低是與在無鋰鹽條件下培養(yǎng)和移植的對照干細胞相比而言的。作為非限制性的例子，當用諸如氯化鋰的鋰鹽對干細胞受體給藥時，本發(fā)明的方法可以顯著延遲所移植干細胞的免疫排斥的發(fā)作。術語“臍帶血”是指從出生后留下的臍帶血中獲得的多潛能和多能干細胞的來源。在臍帶血中發(fā)現(xiàn)的干細胞的例子包括但不限于間葉細胞樣干細胞、造血干細胞和祖細胞。間葉細胞樣干細胞和祖細胞通常能分化成神經(jīng)細胞、骨髓基質細胞、軟骨細胞、造骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、腱細胞和韌帶細胞。造血干細胞通常形成淋巴系、髓系和紅血球系的細胞。下文提供了用于收集和處理臍帶血的方法的詳細描述。這里所使用的術語“臍帶血單位”是指從單個供體收集的臍帶血的體積。本發(fā)明的方法中通常使用單個臍帶血單位，但也可以使用多個臍帶血單位(例如兩個臍帶血單位)以增加干細胞數(shù)。如這里所使用的，術語“基本耗盡血漿的”和“耗盡血漿的”是指其中約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上體積的血漿已經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血單位。例如，通過離心臍帶血并將細胞組分與血漿組分分開可以基本耗盡血漿。基本耗盡后殘留的血漿體積通常為約0%至約30%(體積比)，優(yōu)選約10%至約30%(體積比)。這里所使用的術語“非紅細胞耗盡的”和“紅細胞未耗盡的”是指其中約30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下體積的紅細胞已經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血單位。如這里所使用的，術語“紅細胞基本耗盡的”和“耗盡紅細胞的”是指其中約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 以上體積的紅細胞已經(jīng)耗盡的處理過的臍帶血?！坝泻思毎笔侵妇哂泻?即含染色體DNA的細胞器)的細胞。有核細胞包括例如白細胞和干細胞。“無核細胞”包括例如成人紅細胞。術語“鋰鹽”是指任何制藥上允許的鋰的鹽。適用于本發(fā)明所述方法的鋰鹽的例子包括但不限于氯化鋰、碳酸鋰、以及硫酸鋰、檸檬酸鋰、羥丁酸鋰、乳清酸鋰、醋酸鋰、鋁酸鋰、氫化鋁鋰、氨基化鋰、硼酸鋰、溴化鋰、二異丙氨基鋰、氟化鋰、氫化鋰、氫氧化鋰、碘化鋰、偏硼酸鋰、鑰酸鋰、鈮酸鋰、硝酸鋰、氮化鋰、氧化鋰、高氯酸鋰、過氧化鋰、硫化鋰、鉭酸鋰、Y亞麻酸鋰、以及它們的組合。優(yōu)選地，所述鋰鹽是氯化鋰。 術語“對象”指一種哺乳動物，如人。如這里所使用的，術語“給藥”指通過任何包括但不限于口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、肌內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、病變內(nèi)、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、 或透粘膜給藥途徑的諸如人臍帶血細胞的干細胞或諸如氯化鋰的鋰鹽的遞送。所述鋰鹽通常經(jīng)口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥。在某些情況下，所述鋰鹽通過使用例如Alza公司(Mountain View, CA)提供的DUROSji■植入物植入在對象中的滲透泵給藥。在某些其他情況下，所述鋰鹽通過緩釋儲庫型注射給藥。所述干細胞可以通過例如在疾病部位、受傷部位(例如用于治療脊髓損傷的脊柱內(nèi)給藥)或諸如器官的其他目標部位直接注射或灌注給藥。所述干細胞和鋰鹽可以同時(例如在相同時間)或先后(例如間隔幾分鐘、幾小時或幾天)對對象給藥。III.臍帶血干細胞A.臍帶血的收集臍帶血是干細胞的豐富來源，并且可以方便地以對供體無創(chuàng)方式獲得。相反，收集用于移植的骨髓細胞是一種有創(chuàng)過程，其根據(jù)住院所花費的時間和金錢而言是昂貴的。優(yōu)選地，通過從臍帶直接排出收集臍帶血。因此，嬰兒分娩之后，可以將臍帶雙重十字夾緊并在夾鉗的擠壓部分上方切開，產(chǎn)生的臍帶血管中的胎兒血流可以收集在收集容器中。在胎盤分離發(fā)生前，通?？梢詿o需擠壓臍帶完成足夠量的收集，并且收集過程在約2分鐘內(nèi)完成。需要注意避免分娩區(qū)域中母體血液、尿液或其他流體的污染。也可以通過任何本領域內(nèi)已知的其他方法獲得臍帶血。針對本發(fā)明目的的供體可以包括母體供體，她們是捐贈確認書所針對的供體，并且是對實際新生供體具有監(jiān)護權的母親，其中臍帶血的真實供體是新生兒。母體供體是健康狀況良好并且年齡在約16至約50歲的個人。臍帶血捐贈之前或之后可以收集所述母體供體的某些信息以確定供體的適宜性和不存在輸血傳播的傳染病、遺傳病和造血系統(tǒng)癌癥。例如，可以要求所述母體供體填寫醫(yī)學問卷。在本發(fā)明的一種實施方式中，母體供體在捐贈前應接受醫(yī)學檢查。應當在無菌條件下進行臍帶血收集。在一些實施方式中，收集時可以立即將臍帶血與抗凝血劑混合。通常，約23mL至約35mL的抗凝血劑與最多約255mL臍帶血(即一個臍帶血單位)混合。適當?shù)目鼓獎┌ū绢I域內(nèi)已知的任何抗凝血劑，例如CPDA (朽1檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷)、CPD (檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖)、A⑶(酸-檸檬酸鹽-葡萄糖)、Alsever 溶液(Alsever 等，N. Y. St. J. Med.，41:126 (1941) )、De Gowin 溶液(De Gowin等，J. Am. Med. Assoc, 114:850 (1940) )、Edglugate-Mg (Smith 等，J. Thorac. Cardiovasc.Surg.，38:573 (1959) )>Rous-Turner 溶液(Rous 等,J. Exp. Med. , 23:219 (1916))、其他葡萄
糖混合物、肝素、雙香豆乙酯等等。為了幫助臍帶血處理和提高安全性，用于各種血液成分的處理袋可以是無菌血液袋系統(tǒng)的一部分。在一種實施方式中，在所述處理袋中的一個中整合了血漿存儲溶液。此夕卜，收集袋和處理袋都可以配備有出入口和插拔式連接器。所述出入口可以用于向袋內(nèi)添加材料或從袋內(nèi)抽提材料。插拔式連接器可以用于臨時關閉袋的導管或入口。臍帶血通?？梢栽诶缂sO。C至約42° C之間或約15° C至約26° C之間的溫度下儲藏不超過約48小時。除了臍帶血，胎盤或胎兒血可以用于獲得適于培養(yǎng)和/或移植的干細胞?？梢允褂帽绢I域內(nèi)已知的任何方法收集胎盤或胎兒血。例如，使用由超聲波、胎盤穿刺或胎兒鏡檢引導的針可以在胎盤根部從胎兒循環(huán)中獲取胎兒血。通過例如在根部和擴張的靜脈處從分娩的胎盤中針吸可以獲得胎盤血?！?br> 在一些實施方式中，要求產(chǎn)后的婦女捐獻臍帶血和胎盤血。聯(lián)系醫(yī)院并要求其參加臍帶血/胎盤血收集項目。潛在的供體是通過自然分娩或剖腹產(chǎn)方式分娩中的和準備分娩的婦女。在美國專利No. 5，993，387中描述了一種從產(chǎn)后婦女中獲得臍帶血和胎盤血的方法，例如通過一個家庭在小孩出生前加入一個庫并對出生后所要收集的臍帶血干細胞的收集和保存收取費用。在一種實施方式中，分娩后收集并檢測了臍帶血和/或胎盤血。在一些實施方式中，檢測確保臍帶血或胎盤血適于進一步處理。檢測可以包括檢測胎盤以確保其完整并且不含大量胎便或膿性溢液?？梢詸z測臍帶以確定其完整地含有2條動脈和I條靜脈并且沒有打結或其他異常。如上所述，可以收集在可選地含有諸如檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖-腺苷(CPDA)溶液的抗凝血劑的袋中。B.耗盡血漿處理在一些實施方式中，可以按照例如美國專利公開No. 20060275271中所述的方法減少所收集的臍帶血的體積。作為一個非限制性例子，首先通過在約0° C至約42° C之間、優(yōu)選約15° C至約26° C之間的溫度下對所述混合物加以離心可以降低所收集的臍帶血的體積。進行離心從所述混合物中去除大量體積的液體(例如血漿)。優(yōu)選以約IOOOg至約2500g離心約5至約20分鐘，其中離心力和離心時間足以引起大部分細胞沉淀而不會引起細胞破損。離心后，去除大量體積的血漿以降低臍帶血混合物體積，從而產(chǎn)生未耗盡紅細胞的耗盡血漿的臍帶血單位?；竞谋M后殘留的血漿體積通常為約原體積的0%至約30%，優(yōu)選為約原體積的10%至約30%。在某些情況下，耗盡血漿的臍帶血單位中留有至少約IOmL的血漿。優(yōu)選地,正如通過上清液血漿中的細胞計數(shù)所顯示的,去除上清液時損失少于約5%的有核細胞(例如少于約5%、4%、3%、2%或1%)。在一些實施方式中，將耗盡血漿的單位移至冷凍用容器(例如Cryocyte 袋)，并冷卻至約2° C至約8° C，保持約30至約60分鐘。通過所使用的具體CryoCyte 袋的容積、冷凍保藏的細胞數(shù)量以及冷凍保藏溶液的濃度確定合適的體積。如果耗盡血漿的臍帶血單位的體積太大導致該體積大于約60至約75mL，則可以使用更大的CryoCyte 袋或將樣本封裝在兩個或更多的CryoCyte 袋中。C.培養(yǎng)臍帶血干細胞
可以在冷凍保藏之前或之后使用體外培養(yǎng)技術在含鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)存在于臍帶血單位中的干細胞。已經(jīng)描述了各種用于臍帶血干細胞在培養(yǎng)基中生長的方案(參見例如 Smith 等，Br. J. Haematol,63:29-34(1986) ；Dexter 等，J. Cell. Physiol,91:335(1977) ;Witlock 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，79:3608-3612 (1982))。精通本領域的人員應該知道其他用于體外培養(yǎng)臍帶血干細胞群的方案。各種因子可以與鋰鹽聯(lián)合使用以刺激培養(yǎng)物中臍帶血干細胞的增殖。作為非限制性例子，諸如白介素-I (IL-1)、白介素-3 (IL-3)、白介素-4 (IL-4)、白介素-6 (IL-6)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的各種細胞因子和生長因子可以與鋰鹽組合使用以刺激存在于臍帶血單位中的干細胞的離體擴展。通過本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的臍帶血干細胞可以不經(jīng)過進一步純化就使用。另外，通過各種本領域內(nèi)已知的技術(如免疫親和色譜、免疫吸附、FACS分選等等)可以分離所培養(yǎng)干細胞的特定群或亞群。作為一個非限制性例子，可以在其表達的諸如CD34、c-kit和/或CXCR-4的細胞表面標記的基礎上對臍帶血干細胞加以分離。
本發(fā)明依賴于細胞培養(yǎng)領域內(nèi)的常規(guī)技術。精通本領域的人員通過使用已知的方法學(參見例如Freshney等，《動物細胞培養(yǎng)》(Cimuke Of Animal C—)，第三版(1994))可以確定適當?shù)募毎囵B(yǎng)方法和條件。通常，細胞培養(yǎng)環(huán)境包括對諸如細胞生長底物、細胞密度和細胞粘著、氣相、培養(yǎng)基和溫度等因素的考慮。通常在已知對細胞生長最優(yōu)的條件下進行孵育。這樣的條件可以包括例如約37° C的溫度和含有約5%C02的潮濕空氣。根據(jù)所需要的結果，孵育時間可以變化很大。使用3H胸腺嘧啶脫氧核苷結合或BrdU標記可以方便地測定增殖。塑料皿、燒瓶、滾瓶或懸浮液中的微載體可以用于如本發(fā)明所述的方法培養(yǎng)臍帶血干細胞。適當?shù)呐囵B(yǎng)容器包括例如多孔平板、皮氏平皿、組織培養(yǎng)管、燒瓶、滾瓶等等。臍帶血干細胞通常以基于細胞類型的憑經(jīng)驗確定的最優(yōu)密度生長，并當細胞密度大于最佳密度時進行傳代?？紤]到溫度的地區(qū)差異，培養(yǎng)的臍帶血干細胞通常在提供適當溫度(例如所獲得的細胞所屬的動物的身體溫度)的培養(yǎng)箱內(nèi)生長。通常，37° C是細胞培養(yǎng)的優(yōu)選溫度。大部分培養(yǎng)箱加濕至近似于大氣條件。氣相的重要組成是氧和二氧化碳。通常，將大氣的氧壓用于細胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)容器通常將大氣排入培養(yǎng)箱，從而通過使用透氣蓋或通過防止培養(yǎng)容器密封進行氣體交換。二氧化碳在穩(wěn)定PH以及在為細胞培養(yǎng)基提供緩沖方面發(fā)揮作用，并通常以約1%至約10%的濃度存在于培養(yǎng)箱中。優(yōu)選的CO2濃度通常為約5%?？梢垣@得包裝的、預先混合的粉末或預先滅菌的溶液形式的確定成分培養(yǎng)基。通常使用的培養(yǎng)基的例子包括但不限于Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、DME、RPMI1640、完全Eagle培養(yǎng)基、以及McCoy培養(yǎng)基(參見例如基博科/生命技術公司目錄和參考指引(GibcoBRL/Life Technologies Catalog and Reference Guide);西格瑪公司目錄(Sigma Catalog))。用約 0. 5_5mM(例如約 O. 5、1、1· 5、2、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3、3· I、
3.2、3. 3、3. 4、3. 5、4、4. 5、或5mM)的鋰鹽(例如氯化鋰)補充確定成分細胞培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在。也可以用約5-20%血清(通常是熱滅活血清，例如人、馬、小牛和胎牛血清)補充確定成分細胞培養(yǎng)基。通常，在本發(fā)明的方法中使用10%胎牛血清(FBS)或人血清(HS)。所述細胞培養(yǎng)基通常具有緩沖能力以將細胞保持在pH約7. 2至約7. 4之間。所述培養(yǎng)基的其他補充物包括例如抗生素、氨基酸、糖(例如約5. 5-16. 7mM的葡萄糖)以及生長因子(例如EGF、FGF等等)。IV.所培養(yǎng)的干細胞和鋰鹽的給藥可以通過本領域內(nèi)已知的任何方法將鋰鹽和如本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的干細胞對對象給藥。適當?shù)慕o藥方法包括例如靜脈內(nèi)或皮下給藥、或局部投放(例如直接注射或灌注入疾病部位或其他諸如器官的目標部位)。這里所述的所培養(yǎng)的干細胞和鋰鹽可以單獨或與制藥上允許的載體混合給藥。制藥上允許的載體部分通過給藥的具體成分(例如細胞、鹽等等)以及用于所述成分給藥的具體方法加以確定。因此，對于本發(fā)明所培養(yǎng)的細胞和鋰鹽的給藥來說，存在大量各種適當?shù)闹扑幣浞健Ｗ鳛橐粋€非限制性例子，普通緩沖鹽溶液(例如約135-150mM NaCl)可以用作制藥上允許的載體。其他適當?shù)妮d體包括但不限于水、緩沖的水、O. 4%鹽水、O. 3%甘氨酸等等。在例如《雷明頓制藥科學》 (Remington, s Pharmaceutical Sciences )，賓西法尼亞州費 城麥克出版社，第18版，(1995)中描述了其他適當?shù)妮d體。如這里所使用的，術語“載體”包括任何及所有溶劑、散布媒劑、包被、稀釋劑、抗菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等等。短語“制藥上允許的”是指當對哺乳動物(如人)給藥時不產(chǎn)生過敏或類似的不利反應的分子實體和組合物。本發(fā)明的干細胞和鋰鹽可被制成適于給藥的制劑，例如水性的或非水性的、等滲的無菌注射溶液，它可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得該配方與目標受體的血液等滲的溶質，以及可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液?？梢杂蔁o菌粉末、顆粒和藥片制備注射溶液和懸浮液。在本發(fā)明的背景中，對對象給藥的劑量應當在對象中隨時間推移足以產(chǎn)生有益的治療反應。對于所培養(yǎng)的干細胞而言，應通過所使用的具體干細胞的功效和對象狀況以及所治療的對象的體重或表面積確定劑量。也應當通過在具體對象中具體細胞類型給藥所伴隨的任何不利副作用的存在、本質和程度確定所述劑量的大小。對于鋰鹽而言，應通過所使用的具體鋰鹽的功效和對象狀況以及所治療的對象的體重或表面積確定劑量。也應當通過在具體對象中具體鋰鹽給藥所伴隨的任何不利副作用的存在、本質和程度確定所述劑量的大小。在確定這里所述的疾病或損傷的治療中給予所培養(yǎng)的干細胞有效量的過程中，醫(yī)師對細胞毒性、移植反應、疾病進程、以及抗細胞抗體的產(chǎn)生進行評估。對于給藥而言，根據(jù)對象的體重和整體健康狀況，可以將本發(fā)明所培養(yǎng)的干細胞以有效減少或減輕與疾病或損傷相關的一種或多種癥狀的量給藥，同時考慮到所述細胞類型在各種濃度下的副作用?？梢酝ㄟ^單一劑量或分開的劑量完成給藥。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了一種用于治療受疾病或殘疾(例如脊髓損傷)困擾的對象的方法，該方法包括用如這里所述的方法收集、處理并/或培養(yǎng)的干細胞對對象給藥。作為一個非限制性例子，可以用足以補充由于疾病或損傷而損失的細胞的量的鋰刺激的干細胞對對象給藥。在某些情況下，由于疾病需要替代的細胞是血液細胞。另外，經(jīng)受針對癌癥的化療或放射治療的對象的骨髓細胞可能被這樣的治療所破壞，從而導致發(fā)生各種傳染性疾病的易感性提高。這些對象也可以用源自本發(fā)明方法的干細胞進行治療。在某些其他情況下，所述干細胞可以用于治療遭受脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、中風、帕金森癥、阿爾茨海默病、燒傷、心臟病、糖尿病、骨關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎等等所困擾的對象。所述干細胞也可以用于治療遭受諸如白血病、淋巴瘤、貧血、多發(fā)性骨髓瘤、遺傳性血液異常的疾病、以及導致免疫缺陷(例如AIDS)的疾病或治療所困擾的對象。所述干細胞可以對對象單獨或與其他治療方案聯(lián)合給藥。在某些情況下，所述的其他治療方案包括化療和/或放射治療。在某些其他情況下，其他資料方案包括至少一種生長因子，例如GM-CSF、G-CSF, M-CSF, IL-3、IL-7、EPO、TPO、IL-5或這里所述的任何其他生長因子。治療可以是同時或先后給藥。 V.干細胞移植在一些實施方式中，干細胞移植不需要HLA分型。在其他實施方式中，對干細胞進行HLA分型以保證與受體的相容性。HLA標記的匹配數(shù)取決于使用者的要求和干細胞的來源。例如，可以使用6個標記中具有4個、5個或6個匹配的從包括臍帶血在內(nèi)的胚胎或胎兒組織分離的干細胞。對于來自成人的干細胞，優(yōu)選使用6個HLA標記都相容的。在一些免疫障礙的對象中，移植物對宿主反應可能受到削弱并可以使用并不完全匹配的干細胞。通常，在移植治療性干細胞單位之前，耗盡或減少存在于對象中的正常干細胞群。可以使用化療、輻射或例如美國專利No. 6，217，867中所述的其他技術使得骨髓達到適于移植物移植的要求。最后，可以使用常規(guī)方法將治療性干細胞單位移植入患者體內(nèi)。在一些實施方式中，干細胞與制藥上允許的載體(優(yōu)選水性載體)一起移植?？梢允褂酶鞣N水性載體，例如緩沖鹽溶液等等。這些溶液是無菌的并通常不含不需要的物質。治療性干細胞單位也可以包含適當?shù)纳項l件所需的制藥上允許的輔助物質，如PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、白蛋白、葡聚糖、DMS0、它們的組合等等。輔助物質的濃度可以變化很大，并且應該根據(jù)所選擇的具體給藥模式和對象需求主要在流體體積、粘性、體重等等的基礎上加以選擇。
實施例將通過以下實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述。提供以下實施例是為了舉例說明的目的，并不意味著以任何方式對本發(fā)明加以限制。精通本領域的人員應當容易地識別可以改變或修改以產(chǎn)生基本相同結果的各種非關鍵參數(shù)。實施例I.大鼠新生血細胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激這一實施例顯示了鋰促進從新生大鼠血液中分離的干細胞(N01. I細胞)的增殖和生長因子產(chǎn)生。鋰也提高所移植的N01. I細胞的存活和生長。結果體外。圖I顯示了鋰促進N01. I細胞的體外增殖。將N01. I細胞在含有3mM氯化鋰的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。對兩組細胞都進行細胞數(shù)計數(shù)。氯化鋰組中的細胞數(shù)比對照組高359%。鋰處理的N01. I細胞仍是干蛋白(Nestin)陽性的。圖2顯示了鋰刺激N01. I細胞體外產(chǎn)生生長因子。通過定量實時PCR測定了在含或不含3mM氯化鋰的條件下培養(yǎng)的N01. I細胞中諸如LIF、BDNF,⑶NF、NGF Y和NGF^的生長因子的mRNA水平。LIF和NGFP mRNA水平明顯高于對照組。NGF y、BDNF和⑶NF的mRNA水平之間沒有顯著差異。體內(nèi)。25mm高落重挫傷后立即移植GFP陽性N01. I細胞。每天用100mg/kg的氯化鋰腹膜內(nèi)注射大鼠2周。對照組每天用鹽水注射2周。2周后處死動物用于RT-PCR和組織學分析。圖3和4顯示了鋰促進N01. I細胞的體內(nèi)增殖。圖3中，通過定量實時PCR測定了用鹽水或鋰處理的NO I. I移植后兩周脊髓中的GFPmRNA水平。在鹽水處理的大鼠中，GFPmRNA的量可以檢測到，但是非常低。然而在鋰處理的大鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中高1000倍。圖4中，分離了所移植的脊髓組織的基因組DNA并用GFP引物對進行了基因組PCR分析。在鋰處理的組織中，所擴增的GFP DNA的量顯著高于對照組中所觀察到的量。圖5顯示了鋰促進N01. I細胞的體內(nèi)存活。將GFP陽性N01. I細胞移植入受傷大鼠脊髓。2周后，處死大鼠并在Zeiss Stemi解剖顯微鏡下觀察脊髓。在鹽水處理的大鼠 中，GFP熒光強度低且彌散(圖5A-B)。然而在鋰處理的大鼠中，GFP熒光強度高并占據(jù)兩大塊區(qū)域(圖5C-D)。為了進一步對GFP-N01. I細胞的分布進行評估，將相同的脊髓徑向切片。在鹽水處理的大鼠中，GFP陽性N01. I細胞稀少(圖5E)。相反，鋰處理的大鼠在挫傷中心具有大量GFP陽性N01. I細胞。圖6顯示了鋰刺激N01. I細胞體內(nèi)產(chǎn)生生長因子。為了研究鋰對細胞因子產(chǎn)生的作用，通過定量實時PCR分析了 4組脊髓。在“損傷”和“損傷/LiCl”組中，生長因子mRNA水平?jīng)]有明顯變化。在“損傷/N01. 1”組中，80即、見'3和如？^1111 應水平提高。在“損傷/N01. Ι/LiCl” 組中，⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGFP 和 NGFNGF YmRNA 水平顯著提高。這些結果說明，在N01. I細胞存在的情況下，鋰刺激生長因子產(chǎn)生。圖7顯示了脊髓損傷后鋰對神經(jīng)保護的影響。脊髓損傷后立即注射(腹腔內(nèi))氯化鋰或鹽水。損傷24小時后測量損傷體積。鋰處理的和鹽水處理的大鼠之間沒有觀察到顯著差異。討論檢測了脊髓損傷后鋰對干細胞增殖、基因表達和組織保護的影響。使用從新生大鼠血液中分離的用綠色熒光蛋白(GFP )轉染的表達干蛋白的細胞系(NO I. I )，測定了鋰對培養(yǎng)物中N01. I細胞增殖和植入受損脊髓中的N01. I細胞的影響。將N01. I細胞在3mM鋰中培養(yǎng)導致I周后細胞數(shù)提高了 359%。在25mm挫傷后將N01. I細胞移植入大鼠脊髓的情況下，它們沒有脫離控制生長并且遵守脊髓的灰質-白質界線。移植兩周后，檢測移植部位的GFP mRNA水平。在鹽水處理的大鼠中，可以檢測到GFP mRNA，但量很低。然而在鋰處理的大鼠中，GFP mRNA的量比鹽水處理的大鼠中的高1000倍。組織學也顯示用鋰處理的受損脊髓中具有更多的GFP陽性細胞。鋰處理的大鼠中諸如⑶NF、LIF、BDNF、NT-3、NGF@和NGFy的生長因子的mRNA量也較高。因此，這一實施例說明，通過在體內(nèi)促進細胞增殖和刺激生長因子表達，鋰可以用于提高所移植的干細胞的存活和生長。因此對于接受干細胞移植的患者的組合治療是理想的。方法細胞特征。從野生型新生(PO) Sprague-Dawley (SD)大鼠的血液中分離NOl細胞并用DMEM、10%FBS、EGF和bFGF培養(yǎng)。6周時，60%的NOl細胞是干蛋白陽性的?？寺z驗后，選擇具有100%干蛋白陽性的稱為N01. I的亞克隆。N01. I可以長時間培養(yǎng)而不會發(fā)生形態(tài)或干蛋白標記的改變。當從生長培養(yǎng)基中去除血清時，N01. I細胞形成類似于由神經(jīng)干細胞所形成的神經(jīng)球的球狀結構(Sun,第一屆干細胞研究科學年會QstAnnual ScientificMetting on Stem Cell Research),新澤西,2004)。體外培養(yǎng)。N01. I細胞用3mM氯化鋰在DMEM、10%FBS、bFGF和EGF中在37。C、5%C02的加濕培養(yǎng)箱中處理7天。體內(nèi)脊髓損傷/細胞移植。用綠色熒光蛋白(GFP)轉染N01. I細胞。使用77+1天大的SD大鼠。制造挫傷(MASCIS撞擊器，25mm高)，隨后用與Hamilton注射器相連的玻璃微移液器在距離挫傷部位2mm的兩個位置上合計脊柱內(nèi)注射200，000個細胞(100，000個細胞/yL)。體內(nèi)鋰治療。每天將氯化鋰以每次注射100mg/kg的量腹膜內(nèi)給藥兩周。定量實時PCR。為了評估移植后兩周所植入的GFP陽性N01. I細胞的細胞存活，通 過 SYBR 綠色熒光在 Applied Biosystems 7900HT 實時 PCR 系統(tǒng)(Foster City，CA)上測量GFP mRNA的量。測量了 N01. I細胞移植后脊髓中LIF、BDNF、NT3、⑶NF、NGF Y和NGF^的mRNA水平。損傷體積(LV)。為了評估鋰對組織保護的作用，根據(jù)以下公式測量了損傷后24 小時的損傷體積LV=0. 75-([K]t_4)/120x 體重(Constantini 等，J. Neurosurg.，80:97-111(1994))。實施例2.人臍帶血細胞增殖和生長因子產(chǎn)生的鋰刺激這一實施例顯示了鋰促進從人臍帶血細胞所分離的干細胞的增殖和生長因子產(chǎn)生。圖8顯示了鋰在體外促進人臍帶血細胞增殖。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞并在含有或不含有3mM氯化鋰的含有胎牛血清(FBS)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在為期8周的研究過程中，在鋰處理的培養(yǎng)物中的細胞數(shù)比對照培養(yǎng)物中的高。雖然5周后在鋰處理的和對照培養(yǎng)物中的總細胞數(shù)都降低了，第8周時鋰處理的培養(yǎng)物中明顯具有更多細胞。圖9顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞。細胞在含有或不含有3mM氯化鋰的含有FBS的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第2和第4周進行定量實時PCR以評價生長因子mRNA水平。與對照培養(yǎng)物相比，第4周時鋰處理的培養(yǎng)物的生長因子mRNA水平(例如⑶NF、LIF、BDNF, NT-3、NGF β和CNTF)提高了 2-5倍。圖10顯示了鋰在體外刺激生長因子生成。從新鮮的人臍帶血中分離人單核細胞。細胞在含有或不含有3mM氯化鋰(Li)的含有人血清(HS)的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第I和第2周進行定量實時PCR以評價生長因子mRNA水平。與對照培養(yǎng)物相比，在兩個時間點上鋰處理的培養(yǎng)物都表現(xiàn)出生長因子mRNA水平(例如BDNF、CNTF,⑶NF、LIF、NGF β和ΝΤ-3)的顯著提高。應當理解，以上描述是說明性的而不是限制性的。通過閱讀以上描述，許多實施方式對于精通本領域的人員來說是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍不是通過以上描述確定的，而是應當通過附屬的權利要求以及這樣的權利要求所享有的權利的全部范圍的等價物所確定的。針對所有目的，包括專利申請、專利、PCT公開以及Genbank登錄號在內(nèi)的所有文章和參考文獻通過應用整合在本說明書中。
權利要求
1.一種用于刺激人臍帶血細胞產(chǎn)生生長因子的方法，所述方法包括在含有鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述生長因子選自由細胞存活因子、抗分化因子、以及它們的組合所構成的組。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述生長因子是選自下組的細胞存活因子神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、細胞因子、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、以及它們的組合。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述細胞存活因子是選自下組的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3 (NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4 (NT-4)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、以及它們的組合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述生長因子是抗分化因子，其中所述抗分化因子是白血病抑制因子(LIF)。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養(yǎng)基中。
10.一種用于擴展人臍帶血細胞的體外方法，所述方法包括在含有鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養(yǎng)基中。
15.一種提高對象中所移植的人臍帶血細胞的存活和生長的方法，所述方法包括 (a)在含有鋰鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；以及 (b)給予所述對象步驟(a)的細胞。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
17.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
18.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約O.5至約5mM的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
19.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽以約3mM的濃度存在與所述培養(yǎng)基中。
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
21.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述對象已被診斷為脊髓損傷。
22.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述細胞以脊柱內(nèi)方式給予。
23.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括(c)給予所述對象鋰鹽。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
26.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是通過選自口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)的途徑給予的。
27.如權利要求23所述的方法,其特征在于,所述鋰鹽是以約lmg/kg至約150mg/kg的劑量給予的。
28.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約10mg/kg的劑量給予的。
29.一種用于降低對象中所移植的人臍帶血細胞的排斥的方法，所述方法包括在細胞移植后給予所述對象鋰鹽。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述對象是人。
31.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述對象已被診斷為脊髓損傷。
32.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽選自氯化鋰、碳酸鋰或硫酸鋰。
33.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
34.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是通過選自口服、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)的途徑給予的。
35.如權利要求29所述的方法,其特征在于,所述鋰鹽是以約lmg/kg至約150mg/kg的劑量給予的。
36.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述鋰鹽是以約10mg/kg的劑量給予的。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用含鋰鹽的體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來擴展人臍帶血干細胞的方法和刺激臍帶血干細胞產(chǎn)生生長因子的方法。本發(fā)明還提供了通過在移植前用鋰鹽處理所述細胞來提高所移植的臍帶血干細胞的存活和生長的體內(nèi)方法。還提供了通過移植后用鋰鹽給藥來降低所移植的臍帶血干細胞的排斥的體內(nèi)方法。
文檔編號C12N5/0789GK102911989SQ20121029677
公開日2013年2月6日 申請日期2007年10月31日 優(yōu)先權日2006年11月1日
發(fā)明者D·孫, W·揚 申請人:羅格斯，新澤西州立大學