專利名稱：超高處理量光學-納米孔dna讀出平臺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了分析聚合物分子的系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及單鏈多核苷酸分子測序。背景自從Watson和Crick于1953年闡明DNA分子的結(jié)構(gòu)以來,遺傳研究人員已經(jīng)試圖發(fā)現(xiàn)快速且有效的對單個DNA分子測序的方法。在1975至1977年間，Sanger/Barrell和Maxam/Gilbert開發(fā)了 2種進行DNA測序的新方法,它們代表著測序技術(shù)的重大突破。今天廣泛使用的所有方法都是基于Sanger/Barrell方法,近23年來DNA測序的發(fā)展是對該方法的或多或少的改進。多核苷酸是包含以線性方式結(jié)合到一起的核苷酸的重復(fù)單元的聚合分子。多核苷酸的實例是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA聚合物由4種稱作腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的不同核苷酸堿基串組成。這些堿基在特定基因中的特定順序或“序列”，決定著基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)。而且，基因周圍的喊基序列典型地含有關(guān)于在何種細胞類型中以何種頻率廣生特定蛋白等的 目息。了解基因中和周圍的DNA序列，會提供關(guān)于基因的結(jié)構(gòu)和功能、它編碼的蛋白、它與其它基因和蛋白的關(guān)系的有價值的信息。RNA在結(jié)構(gòu)上和化學上與DNA有關(guān)，但是，RNA的糖組分是核糖(與DNA不同，后者是脫氧核糖)，且堿基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，特定的DNA序列和某些疾病狀態(tài)之間存在直接的關(guān)系。該事實已經(jīng)促使許多制藥公司大量地投入到基因組研究領(lǐng)域，希望發(fā)現(xiàn)這些疾病潛在的遺傳性質(zhì)。序列信息重要的另一個原因是，期望的基于他或她的遺傳學序列確定個體對特定疾病的易感性的能力。遺傳診斷學領(lǐng)域致力于鑒別其在基因組中的存在與特定障礙或特征的發(fā)生有關(guān)的核苷酸序列元件。可得到的關(guān)于在人群中觀察到的基因組序列元件的信息越多，該領(lǐng)域變得越有力。而且，越迅速地測試關(guān)于序列元件在總體人群中的流行率和外顯率的信息，以及這樣的元件在特定個體的基因組中的存在，分析變得越有效。序列信息有價值的另一個原因是，許多制藥公司試圖開發(fā)針對個體的遺傳學特征定制的藥物。目的是提供靶向的有效藥物，可能使用與施用該藥物的特定個體的遺傳特性相適應(yīng)的降低的劑量水平。大多數(shù)目前可得到的核苷酸測序技術(shù)如下確定給定多核苷酸鏈的核苷酸序列建立不同長度的互補鏈的集合，使得該集合包括在目標序列的每個堿基處終止、且大小范圍從僅幾個核苷酸至目標分子全長的分子。然后，通過分析截短的互補鏈，并確定4種DNA核·苷酸中的每一種終止了哪些鏈，確定目標分子的序列。通過按長度順序排列截短的分子，構(gòu)建"梯子"，并讀出每個梯級的末端殘基，以提供目標多核苷酸序列的互補物。
目前可得到的DNA測序系統(tǒng)非常有力。但是，它們受到它們的速度、它們的復(fù)雜性和它們的成本的限制。目前可得到的自動測序儀的速度受到機器不能一次分析序列中超過數(shù)百(典型地，約600)核苷酸的限制?？紤]到將小于1000堿基長度的鏈正確地拼接到一起所需的重疊，標準的測序過程必須進行多達7000萬次，以便確定人基因組序列(Technology Review 102(2) :64-68 1999 Mar/Apr ;在本文中引作參考)。甚至以每天 I億堿基的理論速度，將人基因組測序一次也需要至少一年。利用這些技術(shù)，大規(guī)模測序不會變成臨床工具。為了使遺傳診斷學可在臨床環(huán)境中實踐，測序速度必須提高至少3至5個數(shù)量級?，F(xiàn)有的測序技術(shù)的復(fù)雜性源自擴增和修飾待測序的遺傳分子的需要?；瘜W地或酶促地進行該修飾，通過許多加熱和冷卻的循環(huán)實現(xiàn)擴增。擴增和修飾待測序的DNA的更為流行的方式之一是，使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。PCR包含變性、退火和使用DNA聚合酶延伸的連續(xù)循環(huán)，并導(dǎo)致DNA的起始鏈的指數(shù)擴增。與循環(huán)的每個部分有關(guān)的時間長度，取決于液體體積和待擴增的DNA的長度。典型的時間是下述量級變性步驟10-30秒，退火步驟5-30秒，和延伸步驟1-4分鐘。該循環(huán)通常進行15至30次。因此，根據(jù)待擴增的DNA的長 度，常見的PCR時間是I至3小時。限制變性、退火和標記的根本物理過程是需要的可檢測鏈的數(shù)目，進行該過程所需的時間，和酶的持續(xù)合成能力。這整個過程耗時，且需要遵循有關(guān)操作。目前，需要更有效的對多核苷酸測序的方法。本發(fā)明提供了這樣的方法。簡述本發(fā)明指向分析聚合物分子的方法。這些方法用于以單分子靈敏度高處理量讀出DNA和RNA分子。本發(fā)明的方法包括=(I)DNA(或RNA)雙鏈的電控制的解鏈，⑵使用一種或多種分子信號檢測，讀出分子的身份(或密碼)，和(3)借助于核酸和雜交探針之間的分子相互作用，有控制地減緩納米孔穿線(threading)過程(例如，強相互作用探針會導(dǎo)致轉(zhuǎn)移(translocation)速度的進一步降低)。本發(fā)明指向一種測序方法，其包含目標多核苷酸(例如DNA)向設(shè)計的多核苷酸聚合物(或簡稱"設(shè)計聚合物")的轉(zhuǎn)化。該設(shè)計聚合物由二進制碼編碼，后者由檢測器讀出，從而提供反映原始目標多核苷酸的序列信息。在本發(fā)明的一個實施方案中，將目標雙鏈多核苷酸轉(zhuǎn)化成設(shè)計聚合物。在一個方面，加工目標的單鏈。轉(zhuǎn)化包含用2個設(shè)計單體替換目標多核苷酸的每個核苷酸堿基，從而將堿基表達為二進制碼。例如，堿基腺嘌呤可以表示為0+0，堿基胞嘧啶可以表示為0+1，堿基鳥嘌呤可以表示為1+0，且堿基胸腺嘧啶可以表示為1+1。在一個特定的方面，每個設(shè)計單體是雙鏈多核苷酸序列。每個設(shè)計單體代表著"O"或"I"。因此，對于目標多核苷酸的每一個堿基，存在2個對應(yīng)的雙鏈設(shè)計單體。在一個方面，以能反映目標多核苷酸的核苷酸序列的方式連接設(shè)計單體，從而形成設(shè)計聚合物。在一個方面，將雙鏈設(shè)計聚合物轉(zhuǎn)化成單鏈分子。單鏈設(shè)計聚合物與適當?shù)姆肿有艠穗s交，其中每個分子信標包含一個或多個信號分子和一個或多個淬滅分子。在本發(fā)明的一個方面，設(shè)計聚合物僅包含2組設(shè)計單體(I) 一組設(shè)計單體編碼"O"，且(2)另一組設(shè)計單體編碼"I"。在本發(fā)明的一個特定方面，僅使用2組分子信標。一組分子信標與代表"O"的設(shè)計單體雜交，而第二組分子信標與代表"I"的設(shè)計單體雜交。在一個方面，兩組分子信標包含獨特的信號分子，使得與"O"設(shè)計單體雜交的分子信標具有不同于與"I"設(shè)計單體雜交的分子信標的信號分子。分子信標與設(shè)計聚合物的單個設(shè)計單體的雜交，形成信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物(或簡稱"BDP復(fù)合物")。
在本發(fā)明的一個方面，分子信標包含合適的熒光團作為信號分子。在另一個方面，分子信標不僅包含突光團，還包含淬滅劑。在一個特定的方面，突光團位于信標的5'端,而淬滅劑位于它的V端。本發(fā)明的方法采用雙螺旋核酸的電驅(qū)動解鏈。通過使用電驅(qū)動的納米孔解鏈方法，可以維持對解鏈時間的控制，允許使用例如自淬滅的熒光探針，例如廣泛使用的分子信標。有利地，可以使用不同的測量方案，其中淬滅熒光探針，直到通過解鏈事件設(shè)定的它們的讀出時刻。本發(fā)明的一個實施方案指向納米孔系統(tǒng)。在一個方面，納米孔包含α -溶血素?？梢允褂帽景l(fā)明的納米孔，得到多核苷酸的序列信息?？梢詫DP復(fù)合物引入本發(fā)明的納米孔。在一個方面，存在引入本發(fā)明的納米孔的(BDP復(fù)合物的)設(shè)計聚合物的3'突出。該3'突出序列可以穿過納米孔，直到BDP復(fù)合物的雙鏈部分與入口孔對合。納米孔的尺寸是這樣的，僅僅單鏈多核苷酸可以穿過，從而使雙鏈BDP復(fù)合物不能進入?？梢詫㈦妷簯?yīng)用于納米孔兩端，以解鏈雙鏈BDP復(fù)合物。雙鏈的這種解鏈，有助于從設(shè)計聚合物去除分子信標，從而允許信號分子(例如，熒光團)發(fā)出它的信號，例如發(fā)光。另外，解鏈允許單鏈設(shè)計聚合物進入和通過納米孔?？梢酝ㄟ^合適的檢測器檢測信號。適當?shù)臅r間后，釋放的分子信標會自雜交，從而淬滅它自己的信號。這是一個反覆的過程，施加的電壓繼續(xù)使解鏈的單鏈設(shè)計聚合物轉(zhuǎn)移通過孔，直到單鏈設(shè)計聚合物的下一部分完全通過，由此發(fā)出來自序列中的下一個分子信標的后續(xù)信號，由合適的檢測器記錄另一個信號，然后當從BDP復(fù)合物釋放時自淬滅。以此方式，可以讀出整個設(shè)計聚合物。本發(fā)明還涉及可以用于單分子檢測的光學系統(tǒng)。該光學系統(tǒng)可以與一個或多個納米孔系統(tǒng)聯(lián)合使用。本光學系統(tǒng)包含定制的流動單元，后者具有納米孔支持物和2個電極。電極用于施加解鏈過程所需的電場，而支持物能實現(xiàn)玻璃蓋玻片附近的磷脂雙層的懸浮，從而能使用高倍顯微鏡物鏡對該雙層成像。流動單元固定在倒置顯微鏡的XYZ納米定位器上，且可以使用平移臺移動，以與光軸精確對準。在下面對某些實施方案的描述中，參考形成本文的一部分的附圖，且其中借助對可以實踐本發(fā)明的特定實施方案的解釋進行顯示。應(yīng)當理解，可以使用其它實施方案，且可以進行結(jié)構(gòu)變化，而不脫離本發(fā)明的范圍。應(yīng)當理解，在任何結(jié)構(gòu)的情況下，這些圖有些簡化，因為它們沒有顯示所繪結(jié)構(gòu)的所有常規(guī)細節(jié)，而僅僅顯示相關(guān)元件。另外，盡管在這里顯示了特定實施方案，這無意進行限制。附圖簡述圖I是目標多核苷酸向設(shè)計聚合物的轉(zhuǎn)化的圖示，其中(a)是目標多核苷酸，(b)是分離的目標部分，且(C)是得到的設(shè)計聚合物；圖2是參與目標多核苷酸向設(shè)計聚合物的轉(zhuǎn)化的循環(huán)的圖示，其中(a)是2個設(shè)計單體，(b)是設(shè)計聚合物，且(C)解釋了參與轉(zhuǎn)化目標的循環(huán)。圖3是分子信標的圖示，其中(a)是信標的線性化表示，且(b)表示自雜交的信標；圖4是信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物的圖示；圖5是信標-設(shè) 計聚合物與納米孔的轉(zhuǎn)移過程的圖示，其中(a)顯示了參與該轉(zhuǎn)移過程的初始步驟，且(b)解釋了該過程的后期階段；圖6中的圖顯示了使用主動控制解鏈IOb P發(fā)夾DNA的結(jié)果，其中(a)顯示了施加的電壓和時間(以毫秒計)的關(guān)系，且(b)顯示了測得的通過孔的離子電流；圖7描述了㈧、⑶、(C)和⑶所示的4個不同的步驟，其發(fā)生在樣品多核苷酸的典型分析中，其中上圖顯示了設(shè)計聚合物轉(zhuǎn)移進入和通過納米孔系統(tǒng)的示意圖，中圖描繪了光子計數(shù)/ms和時間的關(guān)系，下圖描繪了記錄的電壓。圖8是與納米孔系統(tǒng)聯(lián)合使用的光學系統(tǒng)的示意圖；圖9是圖8所示的光學系統(tǒng)的放大部分；

圖10是制配在特氟隆薄膜中的約30 μ m孔的SEM圖像；圖11中的圖顯示了以恒定力進行的典型解鏈事件的前幾毫秒(ms)。其中上圖顯示了施加在孔兩端的有控制的電壓，而下圖顯示了由施加的電壓引起的孔電流。在t = O時，DNA進入孔內(nèi)；圖12中的直方圖顯示了在V = 120mV和15°C測得的單鏈DNA(聚(dA)90)的轉(zhuǎn)移時間分布。從約1，500個單個的事件，構(gòu)建直方圖。tT>tP = 0. 5ms (最可能的轉(zhuǎn)移時間)后，通過單指數(shù)擬合分布，時間常數(shù)O. 32ms。圖13中的圖顯示了恒定電壓實驗的典型解鏈事件。上圖顯示了施加的電壓模式，下圖是得到的孔電流，而插圖顯示了在t = 5ms從約1000個獨立的解鏈事件測得的孔電流的典型分布。圖14中的圖顯示了對于HPl的不同解鏈電壓水平，解鏈可能性P解鏈作為t的函數(shù)。使用的電壓水平(圓圈)30mV，(正方形)60mV，(三角形)90mV，(倒三角形)120mV和(菱形)150mV ；圖15中的圖描繪了 HPl (實心圓圈)、HP2(三角形)和HP3 (正方形)τ 對解鏈電壓的依賴性。從Ρ 的指數(shù)擬合得到的特征時間量程(圖4)作為VU的函數(shù)；圖16中的圖顯示了在4. 5V/s的恒定加載速度下進行的恒定加載速度下的典型解鏈事件，其中上圖顯示了在時間t = O時施加的電壓，它表示DNA進入孔的觸發(fā)，而下圖顯示了在控制的電壓變動(ramp)過程中的孔電流；且圖17中的圖顯示了約1500個解鏈事件的集合(象在圖6中)可以用于得到VU的分布和最可能的解鏈電壓VC。主圖HP1 (實心圓圈)HP2(三角形)和HP3(正方形)的作為變動V&函數(shù)的VC的半對數(shù)圖。詳細描述本發(fā)明指向分析聚合物分子的方法。這些方法用于以單分子靈敏度高處理量讀出DNA和RNA分子。本發(fā)明的方法包括=(I)DNA(或RNA)雙鏈的電控制的解鏈，⑵使用一種或多種分子信號檢測，讀出分子的身份(或密碼)，和(3)借助于核酸和雜交探針之間的分子相互作用，有控制地減緩納米孔穿線過程(例如，強相互作用探針會導(dǎo)致轉(zhuǎn)移速度的進一步降低)。本文描述了兩種單分子檢測方法的使用(I)納米孔檢測，和(2)單分子信號探測，例如熒光探測。使用施加于納米孔的電場的主動控制，可以解鏈雙鏈多核苷酸，例如雙螺旋DNA。雙鏈多核苷酸的這種解鏈會產(chǎn)生可以通過納米孔通道的單鏈元件，而雙鏈部分被不能進入。多核苷酸的單鏈元件的進入因而有助于它的分析，例如得到序列信息。本發(fā)明的方法包含目標多核苷酸分子向二進制碼設(shè)計聚合物的轉(zhuǎn)化。目標多核苷酸可以從任何來源得到。在一個方面，目標多核苷酸可以是雙鏈多核苷酸分子，例如雙螺旋DNA。其它多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括但不限于RNA和PNA分子。目標多核苷酸可以是單鏈的。目標分子可以包含天然的和修飾的核苷酸堿基。靶物可以是任何來源。例如，靶物可以是cDNA或gDNA或用于編碼超高密度格式的任何信息的人造(合成的)序列。目標多核苷酸可以是部分地或完全地合成的。靶物可以包含天然來源(包括植物和動物)的核苷酸。目標多核苷酸可以是任何長度。例如，大小范圍可以從約10個核苷酸堿基至約10萬或更多個核苷酸堿基。 參考圖1，得到目標多核苷酸10(圖la)。將該目標多核苷酸10進行生化轉(zhuǎn)化。參見，Lexow的美國專利號6，723，513，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。例如，為了說明目的，已經(jīng)從目標多核苷酸分離了 3個核苷酸(圖lb)。這3個核苷酸是"G"、" T"和"A"(分別是鳥嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤)。將僅使用這3個核苷酸描述轉(zhuǎn)化過程。在該轉(zhuǎn)化過程中，使用"I"和"O"，通過二進制碼表示每個核苷酸。所以，例如，鳥嘌呤(G)可以用二進制碼"1+0"表示，胸腺嘧啶(T)可以表示為"1+1"，腺嘌呤㈧可以表示為"0+0"，和胞嘧啶(C)可以表示為"0+1"。二進制碼的"I"和"O"由它們自己的獨特的多核苷酸(稱作"設(shè)計單體"12)表示。參見，圖lb。圖Ib提供了這樣的設(shè)計單體12的實例。圖Ib描繪了" O"的設(shè)計單體12'和"I"的設(shè)計單體12"(設(shè)計單體的準確多核苷酸序列可以由操作人員確定)。因此，由于設(shè)計聚合物12包含二進制碼，存在2個設(shè)計單體12'和12"，它們各自代表著"I"或"O"，但不同時代表"I"和"O"。在圖I提供的實施例中，有"O"的設(shè)計單體12'和"I"的設(shè)計單體12"。由于每個核苷酸用二進制碼表示，要求每個核苷酸用2個設(shè)計單體表示。例如，鳥嘌呤用二進制碼"1+0"表示，因此，鳥嘌呤表示為"I"的設(shè)計單體12"和"O"的設(shè)計單體12'。但是，設(shè)計單體必須以適當?shù)捻樞?，以便反映它們代表的特定核苷酸。因此對于鳥嘌呤，設(shè)計單體12" " I"后面必須是設(shè)計單體12' " O"(使用5' ->3'的常規(guī)作圖排布)。設(shè)計聚合物14包含以特定順序排列的設(shè)計單體12'和12"。參見，圖lc。設(shè)計聚合物14的序列反映了原始目標多核苷酸10的核苷酸序列，因為設(shè)計單體12'和12"以與在原始目標多核苷酸10中的其同源核苷酸相同的順序從5'至3'排列。對于整個多核苷酸分子，可以重復(fù)圖I所示的過程。為了方便，可以操縱目標多核苷酸的大小，但是，原理是相同的。本發(fā)明的設(shè)計單體包含多核苷酸分子。可以改變設(shè)計單體的大小。在一個方面，設(shè)計單體的大小范圍可從約十(10)個核苷酸至約一百(100)個核苷酸。在另一個方面，設(shè)計單體是雙鏈多核苷酸。多核苷酸可以是DNA，RNA或PNA。設(shè)計單體的核苷酸組分可以是天然的、修飾的或其組合。它們可以選自腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶，其修飾形式等?；诮o定方案的參數(shù)，操作人員可以構(gòu)建設(shè)計單體。關(guān)鍵是，應(yīng)當構(gòu)建至少2個不同的設(shè)計單體，以便實現(xiàn)本發(fā)明的二進制碼特征。
本發(fā)明的設(shè)計聚合物包含多個設(shè)計單體。設(shè)計聚合物代表生化轉(zhuǎn)化的目標多核苷酸。設(shè)計聚合物和原始目標多核苷酸之間的關(guān)系是這樣的，操作人員可以僅使用設(shè)計聚合物確定原始目標多核苷酸的核苷酸序列。將設(shè)計聚合物的設(shè)計單體連接到一起，例如，共價連接，形成多核苷酸分 子。同樣，連接設(shè)計單體的順序是這樣的，它們的連接順序反映了靶物中的核苷酸的原始順序。雜合體系統(tǒng)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，如果目標多核苷酸是RNA分子，用于構(gòu)建二進制碼的設(shè)計單體可以包含脫氧核糖核苷酸。反之同樣有效。如果操作人員需要，可以有雜合體構(gòu)建體。例如，設(shè)計單體可以包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的雜合體。各種雜合體排列變換都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。參考圖2，可以根據(jù)上述方法，加工多核苷酸和寡核苷酸(僅僅大小不同)。圖I所述的方法可以是反覆的過程，從而允許寡聚體經(jīng)歷向設(shè)計聚合物的轉(zhuǎn)化。圖2描繪了這樣的方案。對于該實施例，使用21個堿基對的寡聚體16來解釋該方法。不同大小的寡聚體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以加工從約10個核苷酸至約5000個核苷酸的寡核苷酸。如前所述，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法，消化相當大長度的多核苷酸，形成更短的寡核苷酸。圖2a描繪了 2個設(shè)計單體，一個12'代表"O"，且另一個12"代表"I"。在仔細檢查后，可以發(fā)現(xiàn)2個設(shè)計單體12'和12"包含不同的核苷酸序列。在該特定實施例中，每個設(shè)計單體包含10個堿基對?，F(xiàn)在，這2個設(shè)計單體12'和12"可以用于通過二進制碼表示目標核苷酸16序列。圖2b解釋了二進制碼分配，圖2b還描繪了通過將設(shè)計單體12'和12"連接到一起形成的設(shè)計聚合物14。設(shè)計單體12'和12"的長度和序列是靈活的，這允許定制所得到的設(shè)計聚合物14。圖2c解釋了靶物向設(shè)計聚合物的轉(zhuǎn)化循環(huán)。目標多核苷酸16可以通過3個酶促步驟A，B，和C循環(huán)。在該圖解中，每個循環(huán)轉(zhuǎn)化3個目標堿基。在該圖解中的目標多核苷酸16包含21個堿基對，因此，完全轉(zhuǎn)化靶物需要共7個循環(huán)。在圖2c中，在該圖解中轉(zhuǎn)化上鏈(粗體)。酶促步驟A包含用至少2種IIs限制酶(例如NlaIII)消化靶物16，以便產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化和設(shè)計聚合物連接的突出。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易認識到，使用本領(lǐng)域已知的其它限制酶，可以完成目標多核苷酸的消化。步驟B是連接步驟，其中將二元設(shè)計聚合物序列特異性地結(jié)合到目標片段的3'端，所述目標片段在5'端具有對應(yīng)序列。該步驟包含將目標片段分入單獨的孔中，其中孔的數(shù)目與被轉(zhuǎn)化的堿基的排列變換數(shù)相當(例如，3個堿基的轉(zhuǎn)化需要64個孔)。在每個孔中，存在設(shè)計聚合物序列和與應(yīng)在該特定孔中轉(zhuǎn)化的序列相對應(yīng)的特異性的適體(未顯示)(即，存在設(shè)計聚合物向每個片段的3'端的非特異性結(jié)合，和適體向正確片段的5'端的特異性連接)。連接后，將孔合并到一個容器中。步驟C是擴增步驟。進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)步驟來擴增和選擇已經(jīng)成功地結(jié)合到設(shè)計聚合物和特異性的適體上的那些片段。可以大量平行地進行該轉(zhuǎn)化方法，其中在同一個反應(yīng)中轉(zhuǎn)化數(shù)十億不同的目標分子。參見，美國專利號6，723，513。一旦形成設(shè)計聚合物，將一個或多個信號分子與設(shè)計聚合物相結(jié)合。在一個方面，信號分子是分子信標。通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方式，得到單鏈設(shè)計聚合物。在適合雜交的條件(例如，通過在下述緩沖液中的緩慢溫度淬滅=IOOmM KCiamM MgCl2, IOmMTris-Hcl, pH 8.0)下，將單鏈設(shè)計聚合物與分子信標相混合，形成信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物(BDP復(fù)合物)。圖3不意地描繪了典型的分子信標18 (參見,Tyagi S, Kramer FR. 1996 Molecularbeacons Probes that fluoresce uponhybridization.Nature Biotech. 14 :303-8 ;Bonnet G, Tyagi S, Libchaber A,和 Kramer FR. 1999. Thermodynamic basis of theenhanced specificity of structured DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 96 :6171-76)。分子信標(或簡稱"信標")是寡核苷酸， 其在寡核苷酸的一個位置(例如，5'端)具有熒光團("F" )20，且在寡核苷酸的另一個位置(例如，3'端)具有淬滅劑("Q" )22。參見，圖3a。如圖3a所示，熒光團20可以發(fā)出熒光信號，因為它未受到淬滅劑22的妨礙。但是，因為具有互補的堿基，信標18的5'端和3'端可以自雜交。參見，圖3b。當5'和
端雜交或鄰近時，淬滅劑22會淬滅熒光團20，從而阻止發(fā)出信號。在本發(fā)明的方法中，使用至少2種不同的分子信標。一種分子信標會與代表"O"的設(shè)計單體雜交，而另一種分子信標會與代表"I"的設(shè)計單體雜交。與設(shè)計單體"O"雜交的分子信標包含不同于與設(shè)計單體"I"雜交的分子信標的信號，例如熒光團。例如，分子信標"O"(即，與設(shè)計單體"O"雜交的分子信標)可以具有熒光團"H)"，且分子信標"I"可以具有熒光團"Fl"，二者發(fā)射不同的且可辨別的信號。在一個方面，信標和設(shè)計單體之間的雜交百分比是約90%或更大。在另一個方面，信標與設(shè)計單體的雜交百分比是約80%至約90%。在另一個方面，信標與設(shè)計單體的雜交百分比是約70%至約80%。在另一個方面，信標與設(shè)計單體的雜交百分比是約60%至約70%。圖4描繪了用分子信標"Ml" 18"或"MO" 18'雜交單鏈設(shè)計聚合物24，形成BDP復(fù)合物24。在該BDP復(fù)合物24中，Ml分子信標18"與設(shè)計單體"I" 12"雜交，而MO分子信標18'與設(shè)計單體"O" 12'雜交。如圖4所示，Ml分子信標18"具有熒光團"Fl"，而MO分子信標18'具有熒光團"H)"。這2種熒光團發(fā)射不同波長信號，例如，F(xiàn)l可以發(fā)射藍光，而H)可以發(fā)射橙光。因為本發(fā)明的方法包含目標多核苷酸向基于二進制碼的聚合物(即，設(shè)計聚合物)的轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的方法只需要2種熒光團。一種熒光團代表二進制碼"O" +" I"的"O"，且另一種熒光團代表"I"。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白，可以使用與本文已經(jīng)描述的內(nèi)容一致的其它信號分子?，F(xiàn)在，可以將信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物引入納米孔系統(tǒng)?？梢允褂帽景l(fā)明的納米孔系統(tǒng)，例如，蛋白通道例如細菌α-溶血素(a-HL)，來得到關(guān)于多核苷酸的長度和序列的信息，并檢測不同分析物向孔的修飾部分的推測結(jié)合動力學。參見,Kasianowicz, J.等，1996，PNAS USA, 93,13770-3 ；Akeson, Μ.，等，1999，Biophys. J.，77，3227-33 ；Meller, A.，等，2001，PNAS USA, 97,1079-1084 jPMeller，A.，等，2001，Phys. Rev. Lett，86，3435-38，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。在一個方面，多核苷酸是單鏈分子，例如單鏈設(shè)計聚合物。重要的是注意到可以使用多個納米孔，從而允許分析許多設(shè)計聚合物，因此分析許多目標多核苷酸。在一個方面，在納米孔系統(tǒng)中使用的孔的數(shù)目范圍從5至約10。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白，可以使用更多的孔。納米孔系統(tǒng)可以容納設(shè)計聚合物，并基于給定的方案分析它們。納米孔系統(tǒng)可以包含多種本領(lǐng)域熟知的裝置(包括檢測器)。納米孔系統(tǒng)可以與分子(例如受體等)相偶聯(lián)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白，使用本領(lǐng)域熟知的方法，使用化學試劑(或肽)例如制霉菌素；離子載體例如A23187(卡西霉素)，ETH 5234，ETH 157 (所有化學試劑都可從Fluka, Ronkonkoma, N. Y.得到)；肽通道例如丙甲菌素等，可以在脂雙層中形成化學通道或孔。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的納米孔系統(tǒng)包括在美國專利號5，795，782，美國專利號6，015，714，WO 01/81896A1，和WO 01/81908A1中描述的那些，其教導(dǎo)在本文中引作參考。本發(fā)明的納米孔系統(tǒng)可以具有孔分子，例如λ噬菌體(LamB)的受體或α -溶血 素。用于納米孔系統(tǒng)的裝置包括(a)離子傳導(dǎo)孔或通道；(b)設(shè)計聚合物表征所必需的試齊IJ;和(C)記錄裝置，用于檢測隨著設(shè)計聚合物進入孔和通過孔繼續(xù)前進，跨孔的離子電導(dǎo)的變化?？梢缘玫皆S多種其靈敏度足以進行本發(fā)明使用的測量的電子裝置，且計算機采集速度和儲存容量適合序列數(shù)據(jù)積累的快速速度。其它孔形成蛋白包括短桿菌肽(例如，來自短芽孢桿菌的短桿菌肽A，B，C，D，或S ;可從Fluka, Ronkonkoma, N. Y.得到)；纟顏氨霉素(來自極暗黃鏈霉菌；可從Fluka得到)，OmpF, OmpC，或PhoE (來自大腸桿菌、志賀氏菌屬和其它腸桿菌科)，Tsx, F菌毛，和線粒體孔蛋白(VDAC)。在本發(fā)明中使用的通道和孔可以改變(例如，最小孔徑約2_9nm)。聚合物能從其中拉過的孔徑可以是，例如，對于單鏈DNA，約O. 5-2. Onm。可以存在嵌入同一膜中的多個孔。嵌入同一膜中的許多孔(例如，納米孔)的組合，或"納米孔陣列"，本發(fā)明所述的光學讀出平臺能實現(xiàn)相當平行的信號讀出。最近，研究人員已經(jīng)證實，使用現(xiàn)有的ElectronMultiplying (XD照相機,他們可以以> 200巾貞/秒的幀速，實現(xiàn)256x256象素區(qū)域的讀出。重要的是，已經(jīng)證實，可以在該幀速分辨從單個熒光團發(fā)出的光。這表明，可以實現(xiàn)高度平行的讀出。原則上，使用單個的CCD照相機，可以對制配在固態(tài)膜中的100x100孔的陣列成像。因而，與單個納米孔處理量相比，讀出處理量可以提高約4個量級。人基因組含有約3xl09堿基對。能實現(xiàn)快速且廉價的基因組測序的方法必須是高度平行的。在一個方面，本發(fā)明的500堿基/秒/納米孔的讀出速度，會在含有100x100孔的單個芯片中產(chǎn)生5xl06核苷酸/秒的總讀出。這總計將在約10分鐘內(nèi)單次讀出整個人基因組，比現(xiàn)有方法提高了 4-5個數(shù)量級。改進的電壓-門控通道也可以用于本發(fā)明(天然地或在去除失活的改進后)，且具有適合例如聚合酶結(jié)合(重組的融合蛋白)的物理參數(shù)，或具有適合聚合物通過的孔徑。改變電壓門控通道的失活特征的方法，是本領(lǐng)域熟知的(參見,例如，Pattern，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10905-09 (1992) ；ffest,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 :10910-14(1992) ;Auld 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87 :323-27 (1990) ；Lopez,等，Neuron, 7 :327-36(1991) ；Hoshi,等，Neuron, 7 :547-56(1991) ；Hoshi,等，Science, 250 533-38(1990)，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考)。
在本方法的一個方面，納米孔是a -HL。參見，美國專利號6，528，258，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。Ci-HL孔由2個主要部分組成約2.5nm直徑的洞("孔腔")和約1.5nm直徑的通道("莖干")，后者穿過細胞膜。雙鏈多核苷酸域可以進入2. 5nm孔腔部分，但是它們不能進入I. 5nm通道(dsDNA的直徑是約2. 2nm)。近來已經(jīng)證實,使用納米孔,通過使發(fā)夾進入α-HL孔腔，并檢測它們的熱激活打開所需的時間，可以直接測量短平端DNA發(fā)夾(3至8個堿基對)的關(guān)閉-打開動力學。發(fā)夾的自發(fā)打開后，單鏈DNA進入I. 5nm通道，造成短暫的(但是可辨認的)流過孔的離子電流的阻斷，從而允許檢測從發(fā)夾(或雙鏈多核苷酸)進入到它的首次打開的時間間隔。參考圖5，將信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物24'引入納米孔系統(tǒng)26。如圖所示，設(shè)計聚合物16"的單鏈28穿過納米孔系統(tǒng)26的孔30。在一個方面，單鏈部分是設(shè)計聚合物16"的3'端。設(shè)計聚合物16"的單鏈28移動的驅(qū)動力，由跨納米孔26建立的電場提供。通過使用2個電極，施加電場，并用于"解鏈"雙鏈信標-設(shè)計聚合物復(fù)合物24'。該電場也提供供所得到的單鏈設(shè)計聚合物16"進入納米孔的驅(qū)動力。隨著解鏈的發(fā)生，分子信標部分32、34在系統(tǒng)26本身的通道30處或附近脫離它們與設(shè)計聚合物16"的相互作用。隨著第一個前導(dǎo)信標從BDP復(fù)合物24'去除，隨后的熒光團從第一個信標的淬滅劑釋放，從而該熒光團可以發(fā)光，并被適當?shù)臋z測器檢測到。例如，圖5中的分子信標32具有淬滅劑22"，它會淬滅位于分子信標34上的熒光團F2 20"的信號。當?shù)谝粋€分子信標32被解鏈并從B-D復(fù)合物去除時，熒光團F2 20"會免受淬滅劑22"的影響，從而它可以發(fā)出它的信號。參見，圖5b。第一個分子信標32會自雜交，因此它的淬滅劑22"部分會淬滅它的熒光團Fl 20'。該自淬滅機理會使背景噪音最小化?？梢灾貜?fù)該過程，直到已經(jīng)分析完整個設(shè)計聚合物16"?？傊斒┘与妷鹤儎觼韽脑O(shè)計聚合物解鏈(或融解)雜交的信標時，同時檢測和記錄(與設(shè)計聚合物)雜交的分子信標的最前面的熒光團。如上面所討論的，在電壓變動開始后大約10ms，發(fā)生解鏈，提供足夠記錄熒光團的時間。解鏈導(dǎo)致第一個信標的釋放和與設(shè)計聚合物雜交的下一個熒光團的立即暴露(解淬滅)。釋放的信標會立即自雜交，自淬滅它自己的熒光團。檢測到(兩種顏色中的任一種的)熒光強度的變化，并觸發(fā)下一次電壓變動的應(yīng)用。重復(fù)該循環(huán)，直到讀出整個設(shè)計聚合物。在一個方面，設(shè)計聚合物具有發(fā)夾。 最終的發(fā)夾置于設(shè)計聚合物的5'端，以迫使分子僅以一個方向(即，單鏈3'端)進入納米孔系統(tǒng)。完成設(shè)計聚合物進入和通過納米孔系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移后，光學系統(tǒng)(在下面討論)會感知到聚合物讀出已經(jīng)結(jié)束(即DNA穿過了孔)，此時離子電流升高到開孔水平。使用a -HL孔，已經(jīng)證實了 DNA的更長雙鏈螺旋域(50bp)的力-誘導(dǎo)的解鏈。參見，Sauer-Budge, A. F.，等，2003，Phys. Rev. Lett.，90，238101，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。發(fā)現(xiàn)分子的特征通過時間，這包括單鏈通過孔滑動加上它們的解鏈時間，遵循對施加的電壓(范圍為140-180mV)的指數(shù)依賴性。因而，在本發(fā)明中施加用于解鏈信標的電壓，可以用作靈敏的控制參數(shù)，以確定(沿著DNA的連續(xù)信標的)每個解鏈步驟之間的時間延遲。我們最近的數(shù)據(jù)詳細說明了這一點(圖10-15)。電壓控制的解鏈記載在BiophysicalJournal Mathe J.等.2004 Biophys. J. 87,3205-12，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。該文章證實，與長互補單鏈DNA雜交的短寡核苷酸(約10個堿基)，可以以電壓控制的方式在納米孔內(nèi)解鏈，且解鏈過程的特征時間尺度強烈依賴于電壓，而且，可以選擇在I-IOms的范圍內(nèi)。該時間尺度是非常重要的，它證實(a)可以調(diào)節(jié)DNA在孔中的轉(zhuǎn)移速度，更具體地，通過DNA探針的解鏈，可以使它減速。轉(zhuǎn)移減速的量，指數(shù)式地依賴于DNA和雜交的探針之間的相互作用強度以及施加的電壓。因而，通過選擇探針的序列，可以實現(xiàn)不同水平的“減速”。還證實，施加的電壓可以用于調(diào)節(jié)解鏈，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移速度。DNA轉(zhuǎn)移的減速已經(jīng)成為該領(lǐng)域長期存在的問題；和(b)研究人員能將轉(zhuǎn)移減速到與單個熒光團光學檢測相容的速度范圍(O. l-50ms/堿基)。沒有該減速，光子噪音會在讀出中占優(yōu)勢，其中使用現(xiàn)有的技術(shù)不能實現(xiàn)單個熒光團讀出。根據(jù)本發(fā)明使用的光學試劑包含，例如，當與淬滅劑分子鄰近時會被淬滅的熒光分子?？梢缘玫矫枋鰺晒夂捅憩F(xiàn)出該行為以及這些化合物的特定性質(zhì)(例如，熒光衰減時間，吸收光譜，發(fā)射光譜，耐光性，和量子效率)的其它類型的化合物的廣泛文獻(參見，例如，Gilbert 等，Essentials of Molecular Photochemistry, CRC Press,1991 ；Laxowicz,JR, Principles of Fluorescence Spectroscopy(第 2 版)，Kluwer academic 1999 ；其所有教導(dǎo)在本文中引作參考)?？梢缘玫綗晒獯銣绲脑敿毭枋?，例如，Kavarno s等， Chem. Rev. 86 :401,1986 ；ffagoner, Methods EnzymoI. 246 :362,1995 ；Millar, Curr. Opin.Struct. Biol. 6 637,1996 ；Petit 等，Biol. Cell 78 1,1993 ;其所有教導(dǎo)在本文中引作參考。近年來，單個熒光分子的檢測已經(jīng)取得很多進展(參見，例如，Mathis等.，Bioimaging 5 :116-128，1997 ;Ha 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :6264-6268, June1996 ；Goodwin 等，Ace. Chem. Res. 29 :607,1996 ；Muller 等·，Chem. Phy s. Lett. 262 :716,1996 ；Sauer等，Chem. Phys. Lett. 254 223,1996 ;其整個教導(dǎo)在本文中引作參考)。這樣的分子具有對分子的電環(huán)境敏感的特征熒光衰減時間，因此可以通過與改變環(huán)境的聚合物的結(jié)合來淬滅。可以用于本發(fā)明的熒光團的實例包括TMR和Cy5?？梢允褂玫钠渌愋偷臒晒夥肿邮荂PM，來自Molecular Probes, Inc.的Alexa系列熒光標記，羅丹明家族，和德克薩斯紅。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它信號分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明中可以使用許多其它熒光團，包括在美國專利號6，528，258中列出的那些，其所有教導(dǎo)在本文中引作參考?？梢栽诒景l(fā)明中使用的淬滅分子包括Dabcyl, Dabsyl,甲基紅和Elle淬滅劑 。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它淬滅劑分子也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明中使用的檢測系統(tǒng)取決于使用的光學試劑。檢測系統(tǒng)必須能以與本文所述的測序方法有關(guān)的時間尺度，檢測光學試劑的光學性質(zhì)的變化。在一個方面，使用熒光團作為光學試劑。因此，合適的熒光檢測器是適當?shù)?。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知熒光檢測器。參考圖6，圖(a)顯示了施加的電壓和時間(以毫秒計)的關(guān)系。在對隨著單鏈多核苷酸進入孔，流過單個納米孔通道的離子電流的實時分析中，觸發(fā)納米孔系統(tǒng)的電壓變動。在單鏈多核苷酸進入納米孔后約O. Ims (如孔電流的突然下降所指示的)，電壓降低至"保持"水平，然后它以恒定速度增加。圖6b顯示了測得的通過孔的離子電流。分子的單鏈部分進入通道后，孔電流降低至它的封閉水平(開孔電流的約10%，或約IOpA)。當電壓變動開始時，電流最初停留在它的封閉水平，但是在t約IOms時，電流突然升高至開孔水平，因為雙鏈多核苷酸解鏈，并迅速穿過孔(孔的穿過持續(xù)小于O. 05ms)?？梢匀菀椎販y量解鏈電壓(虛線)。參考圖7，顯示了(A)、(B)、(C)和⑶所示的4個不同的步驟，它們發(fā)生在樣品多核苷酸的典型分析中?？梢灾貜?fù)這些步驟，直到完成測序。上圖描繪了 BDP復(fù)合物24"進入和轉(zhuǎn)換通過納米孔通道30。中圖描繪了光子計數(shù)/ms和時間的關(guān)系。下圖描繪了記錄的電壓。在步驟(A)，當設(shè)計聚合物28'的單鏈突出隨著電場的牽引進入孔30'時，開始讀出。由設(shè)計聚合物28'的進入導(dǎo)致的流過孔30'的離子電流的突然降低，通過下述方式 觸發(fā)讀出1)使電壓從"驅(qū)動"水平降低至"保持"水平，并開始第一次電壓變動；和2)接通例如用于熒光分析的激光。因為與設(shè)計聚合物雜交的第一個信標未被淬滅，會立即產(chǎn)生它的相應(yīng)熒光水平的升高(顯示為中圖的光痕跡)。注意到，典型的解鏈時間是約10ms。在該時刻，從第一個未淬滅的熒光團發(fā)出的光子會被適當?shù)臋z測器記錄下來。在第一個信標32'被解鏈后，立即開始步驟(B)。分子信標32'的解鏈會允許單鏈設(shè)計聚合物16"，進一步移動進納米孔26內(nèi)。該解鏈過程通過釋放分子信標，導(dǎo)致隨后的熒光團解除淬滅。由于熱力學力，釋放的信標會自動地自雜交，因而信標自己的熒光團會被淬滅。自雜交的信標最終擴散開。有利地，該特征會有助于避免背景噪音或使其最小化。得到的熒光信號(中圖)表現(xiàn)出與熒光團34相對應(yīng)的紅色(深色)發(fā)射的增加，和與分子信標32'的丟失和自雜交相對應(yīng)的橙色(淺色)發(fā)射的減少。由于信標進行自淬滅的有限時間，第一個信標32'的淬滅中存在小(約50ys)的延遲。在這小的延遲時間中，存在來自熒光團32'和34的熒光強度，其可以用于定位轉(zhuǎn)換，用于觸發(fā)電壓變動。在步驟(C)中，存在與第一個信標32'類似的讀出，如更淺線所示。注意到，在步驟(C)和(D)之間(讀出相同類型的兩個信標時)，存在橙色強度的尖峰(淺灰色)。這是因為如上所述的兩個熒光團的貢獻。以此方式，系統(tǒng)會讀出整個設(shè)計聚合物。為了阻止設(shè)計聚合物16"'從它的5'(而不是3')進入孔，可以在設(shè)計聚合物16"'的轉(zhuǎn)化過程中，添加7個堿基的發(fā)夾26。該發(fā)夾26最終被解鏈，允許設(shè)計聚合物16"'完全轉(zhuǎn)移進納米孔系統(tǒng)26的內(nèi)部或其孔腔中。本發(fā)明還涉及用于確定多核苷酸的序列的裝置。本文描述了光學系統(tǒng)300，其用于檢測來自在膜嵌入的納米孔內(nèi)穿過的單個DNA分子的熒光信號。圖8是可以與本發(fā)明的測序方法聯(lián)合使用的光學系統(tǒng)300的示意圖，其中系統(tǒng)300包含檢測光學信號所需的元件。更具體地，圖8解釋了使用一個或多個雙分子層膜，光學檢測單分子的光學裝備。本發(fā)明的光學系統(tǒng)300包含定制的流動單元(flow cell) 302，后者包含納米孔支持物304和2個電極306和308。電極306和308用于施加解鏈過程所需的電場，而支持物304能實現(xiàn)玻璃蓋玻片312附近的磷脂雙層310的懸浮，從而能使用高倍顯微鏡物鏡314對雙分子層310成像。流動單元302固定在定制的倒置顯微鏡的XYZ納米定位器316中，且可以使用平移臺移動，以與光軸208精確對準。從二極管激光器318發(fā)出進入光學系統(tǒng)300的光可以激發(fā)突光團。激光器318可以是 532nm 固態(tài)激光器(例如，New Focus3951_20 或 Point Source iFLEX 2000)，且連有單模式、保持極化的光學纖維320。通過鏡子321引導(dǎo)激光束，并使用自制可調(diào)節(jié)的射束放大器(5x) 322放大，并使用鏡子324和326和二色鏡328 (Chroma z532 rdc)，引向物鏡314的背光圈(aperture)。激光束在物鏡314的焦點處稍微放大，以允許更大的照明區(qū)域。通過使入射放大激光束在顯微鏡物鏡314的入口處稍微散開，實現(xiàn)光束的放大。通過使射束放大器322上的鏡頭之一相對于另一個移動，使光束在物鏡314的焦點處輕微散焦，并實現(xiàn)更大的照明區(qū)域(約ΙΟμπι)。使用相同的物鏡314，收集熒光發(fā)射，并使用長通道濾光器330(Chix)mahq560 Ip)過濾。然后，通過支架轉(zhuǎn)移背部照明的冷卻的CXD照相機332，或通過首先將光線聚焦到針孔334上，并使針孔成像到用于快速檢測的2個雪崩光電二極管點檢測器336和338 (Perkin Elmer SPCM AQR-14)上，使光線成像。光學系統(tǒng)300 (不包括激發(fā)和發(fā)射路徑)完全包含在屏蔽的銅盒(未顯示)中，以減少電磁噪音拾波。通過使用CCD照相機332，可以使幾個孔同時成像，從而倍增檢測系統(tǒng)300的處理量。使用儀器控制和數(shù)據(jù)獲取軟件來控制單個分子的自動定位和成像，并用于實時納米孔力光譜學。熒光和電流數(shù)據(jù)獲取的主觸發(fā)器是進入納米孔302的單個分子的封閉的電流信號。硬件電子設(shè)備包含3個PC板用于與PZT控制器接口的快速的數(shù)字I/O (PhysikInstrumente PI-E710),光子計數(shù)器板(National Instruments PCI-6602),和快速的 A/D板(例如,National Instruments PCI-6052E),后者對離子電流取樣,并生成跨孔的可編程的電壓梯度。儀器包含定制的微流體單元，后者用于水平地支持約20 μ m磷脂雙層，并更換緩沖溶液。參考圖9，描述了微流體單元402，其包括(a)石英基片404，(b)定制的聚四氟乙烯(PTFE)膜406，(c)由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的室408，(d)外殼410，和(e)電極412和414。通過機械刻印，將20-30 μ m光圈(aperture) 416制配在PTFE膜406中。插圖416解釋了膜418和含有RNA分子422的a -HL孔420，其中膜418由光圈(aperture) 416支持。圖10顯示了制配在PTFE膜406中的約30 μ m光圈416的SEM圖像。膜418懸浮在12 μ m厚特氟隆膜406內(nèi)的圓形光圈416中，在玻璃蓋玻片424上面約100 μ m。這能使·用60x/l. 2N. A.水浸顯微鏡物鏡426 (Olympus UPLAP060XW)，實現(xiàn)膜418的高分辨率熒光成像。這不同于使用油浸的現(xiàn)有設(shè)計。使用水浸物鏡426 (高NA)而不是油浸物鏡，會提供更長的工作距離(約250 μ m)。特氟隆膜406隔開兩個小室428和430 (各自約50 μ I)，通過特殊的管道，可以進入它們進行流體更換。2個Ag/Ag-Cl電極412和414與流體室428和430接觸，并連接到用于施加跨膜電壓的高分辨率膜片箝頭段放大器(未顯示)(例如AxonInstruments 200U)。返回圖9,使用文獻所述的方法(參見,例如，Meller, A.,等· (2000)Proc. Natl.Aca d. Sci. U. S. A. 97，1079-1084 ；Meller,A.，等· (2001) Phys. Rev. Lett. 86，3435-3438，都引作參考)，將納米孔(例如，a -HL孔420)嵌入膜418，并使用膜片箝放大器測量流過孔420的離子電流，并實時分析。如上所述，單元402固定在XYZ納米定位器(例如，PolytecΡΙ-Ρ527. 3CL)上，以允許在物鏡的視野內(nèi)精確對準單元402和納米孔420，并基于對信號的實時分析，側(cè)面地跟蹤熒光標記的納米孔420。存在至少兩種在本發(fā)明的范圍內(nèi)的不同的膜單元實施方案。通過將特氟隆膜嵌入定制的具有上流體室和下流體室的PDMS襯墊中，可以制備膜單元。PDMS襯墊容納在支持塑料帽中。單元是約25mm寬和約3mm厚。它包括可使用管道進入的下室(約10 μ I)。下室的Ag/AgCl電極和特氟隆膜嵌入PDMS襯墊。單元從底面覆蓋著玻璃蓋玻片，透過它可以成像?；蛘?，膜單元可以由2個同心圓筒(上室和下室)組成，它們可以彼此相對地滑動幾微米。在上室的底面，通過加熱熔合特氟隆膜。上室可以在下室內(nèi)自由地下滑，直到特氟隆膜靠近蓋玻片，且可以用顯微鏡從下面顯像。使用用于支持脂雙層的特氟隆膜，可以制配約20 μ m圓形光圈。下室是約20mm寬的室(6mm高)，并支持著置于它的底面上的薄玻璃蓋玻片。該單元連接到流體管道和2個電極。本發(fā)明的一個實施方案指向確定給定的樣品基質(zhì)中的聚合物的數(shù)目或量。例如，聚合物可以是多核苷酸。在一個方面，預(yù)定的聚合物推定地存在于樣品中。在這方面，已知該序列的至少某些部分。該部分的范圍可以從約5至約50個或更多個核苷酸。使用本發(fā) 明的方法，可以設(shè)計用于與目標多核苷酸雜交的設(shè)計單體，且使用本文所述的納米孔系統(tǒng)，可以檢測和測量目標多核苷酸。本發(fā)明的另一個實施方案指向檢測樣品基質(zhì)中的多核苷酸?？梢詷?gòu)建對預(yù)定的核苷酸序列特異性的設(shè)計單體?？梢詫⑦@些設(shè)計單體引入含有多核苷酸的樣品中。樣品可以是異源的或同源的樣品。在本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的適合雜交的條件下，將設(shè)計單體引入樣品中。然后可以使用本發(fā)明的方法，分離和/或加工與預(yù)定的設(shè)計單體雜交的那些多核苷酸。通過本發(fā)明的方法，可以實現(xiàn)對特定多核苷酸序列的檢測。例如，在PCR中使用的聚合酶的保真度不是100%，因此必須監(jiān)測使用PCR產(chǎn)生的多核苷酸的序列保真度。使用本文所述的方法，操作人員可以驗證聚合酶和整個PCR過程的保真度?？梢詷?gòu)建預(yù)定的設(shè)計單體，反映目標多核苷酸的一部分，形成可以隨后使用本方法測序的設(shè)計聚合物。一個實施方案指向檢測給定的多核苷酸序列中的單個或多個突變。假定目標序列部分地或整個地已知，可以構(gòu)建設(shè)計單體，從而可完成多核苷酸序列的檢查?？梢栽谶m合雜交的條件下，將設(shè)計單體引入具有推定目標多核苷酸的樣品基質(zhì)中，形成設(shè)計聚合物。然后，可以對該構(gòu)建體進行本發(fā)明的測序方法。突變可以反映為一個或多個設(shè)計單體錯配。本發(fā)明的一個實施方案指向信息儲存。鑒于本發(fā)明對任何多核苷酸序列使用二進制碼，可以僅使用二進制碼儲存核苷酸序列。在一個方面，可以設(shè)計編碼數(shù)字("O"和"I")序列的設(shè)計聚合物，正如計算機文件一樣。在某種意義上，可以將DNA視作靜態(tài)的、超密的儲存介質(zhì)。本發(fā)明的納米孔系統(tǒng)是取出(讀出)序列中編碼的信息的有效工具。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，本文所述的方法具有許多實踐應(yīng)用，它們不脫離本發(fā)明的范圍。實施例使用a -HL,納米孔解鏈單個DNA發(fā)夾分子為了實現(xiàn)用時間依賴性的電場(例如用測序方法)進行納米孔測量，已經(jīng)開發(fā)了解鏈方法。本解鏈方法使用高電壓來優(yōu)化進入孔的速度，而解鏈電壓保持可變。從而，可以在短時間段(幾分鐘)內(nèi)探測數(shù)百個單獨的分子。該方法允許操作人員在多核苷酸通過的過程中快速地改變跨納米孔施加的電場。該解鏈方法可特別有利地用于研究單個DNA發(fā)夾分子的解鏈動力學，經(jīng)30mV至150mV的寬電壓范圍，以不同的加載速度(O. 5V/s-100V/s)。而且，該方法允許動態(tài)力測量，其中施加恒定加載速度而不是恒定力。這兩種互補的測量，允許DNA發(fā)夾的微小焓變化分辨低至 lkcal/mol。DNA發(fā)夾的納米孔解鏈過程中，存在3個連續(xù)的步驟㈧單鏈DNA突出(50nt)的進入和滑動，直到雙鏈(螺旋)部分自己進入a -HL的2. 5nm孔腔；(B)螺旋部分的解鏈；和(C)解鏈的單鏈部分通過孔的轉(zhuǎn)移。參考圖11-17，表征了這些步驟，以便分辨它們在不同電壓的典型時間尺度。通過使用主動電壓控制方法，可以將突出進入(A部分)與其它步驟解偶聯(lián)，解開的鏈的轉(zhuǎn)移時間(C部分)遠遠短于典型的解鏈時間，因而可以忽略。首先，通過證實解鏈IObp發(fā)夾的典型時間尺度實質(zhì)上比ssDNA的穿過時間長，實 驗表征了隨著電壓而變化的與單鏈DMA(" ssDNA")穿過孔有關(guān)的時間尺度。接著，顯示了 30-150mV范圍內(nèi)的穩(wěn)定(或階躍函數(shù))電壓的解鏈動力學信息，以確定孔內(nèi)的DNA鏈上的有效電荷。最后，實驗證實了解鏈動力學對加載速度的依賴性。使用與為其它單個分子("SM")解結(jié)合實驗開發(fā)的模型相類似的簡單理論模型，解釋了數(shù)據(jù)。材料和方法將PAGE-純化的 ssDNA 和 DNA 發(fā)夾(Burogentec, San Diego, CA)緩沖在 IOmMTrisUmM EDTA、pH 8. 5溶液中，且在測量之前，加熱到75°C 10分鐘，然后冷浸至4°C。發(fā)夾分子由3'單鏈突出(50聚體聚-dA)和10堿基對螺旋部分組成，后者含有間插的6堿基環(huán)，其具有下面的序列(自互補的部分標有下劃線)HPl 5/ -GCTCTGTTGCTCTCTCGCAACAGAGC(A) .n ； (SEQ ID NO. I)另外，還制備了在從5'端起第5個堿基具有單個(TT)錯配的類似發(fā)夾(HP2)，其具有下面的序列HP2 5/ -GCTCTGTTGCTCTCTCGCAACTGAGC (A) .n ； (SEQ ID NO. 2)以及7堿基對螺旋發(fā)夾(HP3)，其具有下面的序列HP3 5/ -GTCGAACTTTTGTTCGAC(A) 50 ； (SEQ ID NO. 3)(用于重構(gòu)在水平支持的平面脂雙層中的a-HL通道的基本裝置和實驗方法如上所述。)使用定制的單元設(shè)計，將系統(tǒng)的溫度維持在15.0±0. 1°C。緩沖溶液是IM KCl,IOmM Tris-Hcl，pH8. 5。在這些條件下，a-HL開孔電導(dǎo)率是正向偏壓O. 82pS。使用膜片箝放大器(Axopatch 200B, Axon Instruments, Union City, CA)測量離子電流，使用 IOOkHz低通4-極Butterworth濾波器(Krohn Hite3302, Avon, MA)過濾信號。使用DAQ標度盤，以1ΜΗζ/22比特將信號數(shù)字化。使用National Instruments' LabView,編寫所有控制和獲取軟件。裝置配備有反饋回路，用于控制施加的跨膜電壓。膜電勢對控制電壓的步長的反應(yīng)時間是4± I μ S。在(在電壓或電壓變動設(shè)定的給定條件下進行的)每個實驗中，典型地收集1，000個解鏈事件的數(shù)據(jù)。軟件和硬件組合允許高處理量的自動數(shù)據(jù)獲取，所以每個實驗的總獲取時間是約10分鐘。每個解鏈事件由三部分組成1)單鏈突出穿過和滑動，直到螺旋部分進入a -HL的孔腔內(nèi)部；2)在低電壓，將發(fā)夾維持在孔內(nèi)部；和3)雙鏈DNA的解鏈。第一和第二部分被設(shè)計用于制備第三部分的系統(tǒng)，所以解鏈總是在分子相對于孔的特定的構(gòu)型開始。如同任何單分子實驗，分子或事件之間的變異是不可避免的。存在一組控制測量(下面描述)，且重復(fù)解鏈實驗多次，以便減少數(shù)據(jù)分散。解鏈部分由2種類型的測量組成在穩(wěn)定力下的解鏈，和以固定的加載速度的解鏈。在“結(jié)果”部分描述了這些實驗。在所有實驗中，為前兩個部分(滑動和維持)選擇的電壓和時間不變。圖11顯示在恒定力下進行的典型解鏈事件的前幾毫秒(ms)。上圖顯示了施加的隨時間而變化的電壓，下圖是得到的孔電流。該事件從單鏈聚(dA)端在孔內(nèi)穿過開始。通過開孔電流的突然降低，檢測到多核苷酸進入通道，這引起獲取系統(tǒng)的觸發(fā)，并定義t = 0點(虛線)。在V =220mV,分子被拉入通道持續(xù)時間td = 300 μ S。選擇該時間略微大于40聚體DNA的最可能的轉(zhuǎn)移時間tp，如結(jié)果所示。因此，在t = td，預(yù)期大多數(shù)DNA發(fā)夾會完全進入Ci-HL孔腔。該假說得到兩個獨立的補充測量的證實在第一個實驗中，td變化從50至700 μ s，并基于在t = td時電壓向V = -120mV的反轉(zhuǎn)，測量逃脫時間的分布。對于td值為50至300 μ S，要從孔拉開分子需要的典型時間存在單調(diào)的增加。但是，對于td > 300 μ s,曲線飽和至恒定水平，表明DNA的單鏈突出穿過通道，然后在雙鏈螺旋部分進入孔腔時停止。其它證據(jù)來自^過程中封閉的離子電流水平的分析。更具體地，平均電流(對于td = 300 μ s)表現(xiàn)出兩個清楚的峰值在約6pA處的主要低電流峰，和在正常的聚(dA)封閉水平(約IlpA)的第二個峰。低電流峰歸因于占據(jù)a-HL孔腔的發(fā)夾的螺旋部分對孔的額外封閉。 在t = td = 300 μ s時,解鏈的發(fā)夾的分數(shù)非常少。通過測量在V = 120mV時發(fā)夾分子的轉(zhuǎn)移可能性分布，定量該分數(shù)(未顯示數(shù)據(jù))。從該分布估計出，在t = td = 300 μ s時，解鏈的發(fā)夾的分數(shù)小于0.5%。DNA開始滑動后，在t = td，將電壓降低至低"維持"電勢(20mV)持續(xù)時間tH = 500 μ S0發(fā)現(xiàn)該電壓大得足以將發(fā)夾維持在孔腔內(nèi)，但是太小而不能誘發(fā)顯著的解鏈，如下面顯示的數(shù)據(jù)所證實的。為了方便，選擇500μ s(在分開組的實驗中，將發(fā)夾維持在孔中長達5秒)。在維持階段的末尾時，施加解鏈電壓Vu (或加載速度)V = dV/dt。結(jié)果ssDNA的轉(zhuǎn)移時間分布將每個單個的DNA的轉(zhuǎn)移時間(tT)定義為，從DNA分子的前幾個堿基進入a -HL孔的通道部分的內(nèi)部至該分子從該通道的另一側(cè)離開的時間間隔。通過流過孔的離子電流突然降低至開孔電流的約10%，可以清楚地觀察到這些事件。在發(fā)夾的情況下，僅DNA的單鏈3'突出可以進入通道，因為在它的另一端的環(huán)太大，不能進入孔。在該情況下，tT是上述的3個連續(xù)過程的總和，即tT = tsl+twe+ts2,其中tsl是單鏈突出(聚(dA)5Q)的滑動時間，ts2是解鏈的發(fā)夾+環(huán)(26個堿基)的滑動時間，且是解鏈時間。圖12顯示在V = 120mV和15°C測得的單鏈DNA(聚(dA)90)的轉(zhuǎn)移時間分布。從約1，500個單個的事件,構(gòu)建直方圖。ssDNA的分布顯示了在tP = O. 5ms的突出峰,其用于表征該過程。tT > tP = O. 5ms (最可能的轉(zhuǎn)移時間)后，通過單指數(shù)擬合分布，時間常數(shù)為0.32ms。以前的研究證實，tP隨堿基的數(shù)目線性升高(對于22-聚體和以上)。因此，從聚(dA)90的轉(zhuǎn)移分布,可以估計出tsl O. 5ms X 50/90 O. 28ms。注意至[I,該時間遠遠小于以類似方式測得的DNA發(fā)夾的特征tT(約2-lOms)(未顯示數(shù)據(jù))。然而，如下所述，可以從解鏈過程解偶聯(lián)起始滑動，從而完全消除tsl。從研究隨V而變的聚(dA)的轉(zhuǎn)移時間，可以估計ts2對解鏈過程的貢獻?；谶@些測量，估計對于26個核苷酸，ts2在30mV約660 μ s，且在150mV約100 μ S?？梢詮脑诿總€事件中測得的總解鏈時間中減去隨電壓而變的ts2的估計值，得到更精確的估計值。該修正較小(見下文)，且不會影響結(jié)果。ts2的測量也會給出每個核苷酸的平均滑動時間的信息(例如，在100mV，6y s)。如下文所示，該時間尺度對于闡明孔內(nèi)的解鏈機理是重要的。當發(fā)夾進入孔中時，它的解鏈動力學會受到重新成鏈和滑動過程之間的競爭的影響(解鏈的核苷酸可以重新結(jié)合發(fā)夾或沿著通道滑動，從而阻止重新成鏈)。如果滑動時間比重新成鏈時間短，會抑制重新成鏈。相反地，如果滑動時間長，發(fā)夾會在完全解鏈前經(jīng)歷許多打開-關(guān)閉轉(zhuǎn)換。I.在恒定力下的解鏈動力學研究了在穩(wěn)定電壓(或力)下的DNA發(fā)夾的解鏈。將電壓的突然變化施加于納米孔，并測量解鏈動力學。在該實驗中使用的典型電壓和電流跟蹤如圖13所示。DNA在時間t = O進入通道。如圖10所解釋的，短暫地將分子拉入并維持在孔中。在t = O. 8ms，施加解鏈電壓(90mV)，但是封閉電流(低水平)，直到在t = tU = 70ms發(fā)生解鏈，如電流的突 然增加所指示的。應(yīng)用解鏈電壓Vu后，電流輕微地升高到它的適當?shù)姆忾]孔水平(參見圖11對孔電流的放大)，并保持在該封閉水平，直到t約70ms (從應(yīng)用解鏈電壓起測量)。在該時刻，電流突然升高到與該電壓相對應(yīng)的開孔電流水平。由于解鏈的發(fā)夾的滑動時間太短，不能在圖13的時間尺度上分辨，該轉(zhuǎn)換指示著發(fā)夾的解鏈時刻。使用自動化的方法重復(fù)解鏈過程，其每分鐘積累約100個單獨的解鏈事件。通過計算在時間間隔[Ο-t]中解鏈事件已經(jīng)發(fā)生的可能性，分析數(shù)據(jù)，其中將t =O定義為應(yīng)用Vu的時刻。為了該計算，獲取約1000個解鏈事件，并繪制在以時間t為中心的50 μ s時間窗中測得的平均孔電流。電流的分布表現(xiàn)出分別與封閉孔和空孔狀態(tài)有關(guān)的2個相當分離的峰(圖13中的插圖)。通過計算"空孔"(高電流)事件數(shù)與事件總數(shù)的比例，得到在時間t積累的解鏈可能性。使用的電壓水平是(圓圈)30mV，(正方形)60mV，(三角形)90mV，(倒三角形)220mV和(菱形)150mV。對不同的V 值(30，60，90，220，和150mV)，重復(fù)上述的測量，并應(yīng)用類似的分析方法。圖14顯示了說明隨探測時間而變的解鏈11發(fā)夾的可能性的數(shù)據(jù)。對于每個探測時間，將P解鏈計算為在高電流峰下的事件的數(shù)目與事件的總數(shù)目的比例(參見圖13中的插圖)。在短時間(即t < Ims)，解鏈可能性非常小，無論Vu的幅度。在t約10ms，在小和大Vu值下的解鏈可能性之間存在顯著的差異。因為解鏈后緊跟著26核苷酸(單鏈)通過孔的轉(zhuǎn)移，測量的解鏈時間包括2項真實的解鏈時間和26-聚體的滑動時間(ts2)。通過如前所述估計ts2，校正測量。但是，因為校正遠遠小于解鏈時間(約1% )，它對結(jié)果具有非常小的影響。通過單指數(shù)函數(shù)，擬合圖14所示的解鏈可能性分布，產(chǎn)生在不同電壓水平的特征解鏈時間τ 。在圖15中，分別針對HPl(實心圓圈)、ΗΡ2(三角形)和HP 3(正方形)繪制了 τ 對解鏈電壓Vu的依賴性。注意到，從直線擬合可以看出，1 指數(shù)式地依賴于V 。從修改的Kramers速度模型，可以預(yù)期該依賴性(24) τ (V ) = τ Qe(_Vu/ve)，其中τ。= AetEWkBT)是0電壓轉(zhuǎn)換時間，Eb是發(fā)夾離解的能量屏障，且Ve =kBT/QeffO圖11中的直線斜率給出了 Ve = 22±2mV的單個值，其可以用于估計有效的DNA電荷Qeff I. 13±O. IOe。該電荷與跨a-HL通道的約22個核苷酸有關(guān)，因此，每個核苷酸的有效電荷是1· 13/12 = 0.094e。從擬合與垂直軸相交的截距，可以推斷τ (0)(在O力時)的值。實驗結(jié)果證實，HPl的τ (O) = 2. 1±0· 2s，對ΗΡ2為I. 2±0· ls，且對HP 3為O. 34±0· 05s。2.在恒定加載速度下的解鏈動力學利用主動控制方法，可以施加任意的時間-依賴性的電壓V(t)，以測量鍵斷裂的動力學。更具體地，典型地在恒定加載速度或變動f=dV/dt下進行力光譜學測量。在下面的段落中，首先顯示了對于任何給定的V，解鏈電壓的預(yù)期分布的衍生結(jié)果，和臨界電壓(或最可能的解鏈電壓)對的依賴性。分析遵循適合納米孔情況的Evans和Ritchie的方法。結(jié)果對于大加載速度與該簡化模型一致，但是在低速度偏離該模型。假定理想化的沿著施加的力的方向的ID能量分布，具有單一能量屏障。在平衡時(沒有施加力)，將關(guān)閉的發(fā)夾狀態(tài)表示為能量分布的深的最小值，通過能量屏障Eb與打開狀態(tài)分開。為了使發(fā)夾解鏈，分子必須跨越該能量屏障。在有偏電壓(或力)存在下，屏障降低，并根據(jù)τ (V) = τ0β(-ν/ve)修改Kramers時間(τ。)，其中如前面所定義。在這里，V = V(t)是時間依賴
/ e, df \ 性的。每單位時間內(nèi)在t和t+dt之間已經(jīng)發(fā)生解鏈的可能性，由⑴
給出。該公式可以表達為V(ij = ，給出解鏈電壓的分布 ^(V) - iexpff -縣邛⑷ - 1I (l)
νβ T0V ^ \νβ) j將臨界解鏈電壓Vc定義為該分布的最大值，它是Κ-νβΙηψ-(2)圖16顯示了在4. 5V/s的恒定加載速度下進行的典型解鏈事件。上圖描繪了施加的電壓，下圖顯示了孔電流。通過電壓變動過程中電流的跳越，從封閉孔電流水平至開孔電流水平，可以容易地觀察到解鏈。從每個事件直接得到解鏈電壓VU。象在前面的實驗中一樣，使DNA開始進入孔(B卩，滑動O. 3ms，且將分子維持在孔內(nèi)O. 5ms)。應(yīng)用電壓變動后，電流維持在封閉水平，但是在t約22ms (從開始變動時測量)，解開的鏈迅速地滑過孔，存在孔電流的急劇增加。從曲線中，可以直接測量解鏈電壓V (在該情況下，130mV)?；瑒訒r間(ts2)使得表觀解鏈時間(并從而使V )稍微更長。但是，如上面所討論的，這是非常小的影響在這里所示的情況下，ts2是約O. 12ms,因此而校正是O. 12/22 = O. 005，觀察時間的小分數(shù)。為了得到足夠的統(tǒng)計量,對于任何給定的變動值,重復(fù)解鏈實驗至少1，000次。圖17的插圖給出了測量的Vu值的典型分布。分布與方程I (插圖中的實線)非常接近。分布的峰是最可能的解鏈力(或臨界電壓，Vc)。重復(fù)測量，以得到對于HP1，對于HP2(含有單個錯配的發(fā)夾)和對于HP3 (7堿基對螺旋)，Vc對O. 5-lOOV/s范圍內(nèi)的電壓變動的依賴性。在圖14的半對數(shù)圖中顯示了數(shù)據(jù)(對于HP1，HP2和HP3，分別是圓圈，三角形和正方形)。在中和高電壓變動(5-lOOV/s)，Vc遵循方程2預(yù)測的對\>的對數(shù)依賴性。根據(jù)方程2，圖17中的直線的斜率簡單地是Ve.。從該對數(shù)擬合，HPl的Ve . = 24. 7± I. OmV, HP2的是22. 5± I. lmV，且HP3的是23. 3±1.9mV，與上述的恒定電壓測量非常一致。如從Ve僅僅依賴于孔內(nèi)的DNA的有效電荷的事實所預(yù)期的，所有分子產(chǎn)生幾乎相同的斜率。注意到，在更低的變動方案中，數(shù)據(jù)偏離方程2預(yù)測的簡單對數(shù)依賴性。下面討論了該偏離。將數(shù)據(jù)(對于變動> 1.6V/s)與方程2擬合，產(chǎn)生HPl和HP2各自的τ (O) = O. 72s和O. 49s，這些值小于使用恒定電壓方法得到的值。以前的研究已經(jīng)證實，可以將進入2. 4nm a -HL孔腔的短平端DNA發(fā)夾的關(guān)閉-打開動力學描述為單步驟過程，產(chǎn)生與跳過接近于計算的整個發(fā)夾的自由焓的能量屏障相對應(yīng)的時間尺度。在這些實驗中，幾乎沒有或根本沒有施加力來使分子變性，因為平端DNA不能進入a-HL通道部分。在電流實驗中，從DNA發(fā)夾的一端伸出的單鏈突出在通道內(nèi)穿過，從而偏離發(fā)夾的動力學，推測是由于在該鏈上施加力。主動控制方法已經(jīng)允許將在220mV或以上進行的解鏈測量延伸至更小的電壓，從而填充O力和強力極限之間的間隙。在任何給定的電壓V，可以通過QrffV/d估計施加在該DNA鏈上的力，其中Qeff是通道內(nèi)的ssDNA的有效電荷，且d約5nm是通道長度。注意到，甚至在相對小的電壓(小偏壓力)，在孔內(nèi)未配對的鏈幾乎同樣快速的前進，會阻止熱“熔化·的”堿基對的快速重退火。從轉(zhuǎn)移實驗估計特征ssDNA滑動時間。該"棘輪"機理可以將整個發(fā)夾的解鏈分成幾個連續(xù)步驟。因而，預(yù)期在該情況下15總解鏈時間顯著短于O偏壓動力學。實驗證實，在恒定力下測得的特征解鏈時間(τ J隨解鏈電壓水平久指數(shù)式地衰退。發(fā)現(xiàn)直線擬合的斜率獨立于發(fā)夾序列(并從而獨立于它們的焓)，允許估計通道內(nèi)的ssDNA片段上的有效電荷。指數(shù)擬合在Vu = O的截距，提供τ (O)的估計值。有趣地將這些值與發(fā)夾的完全封閉到完全變性轉(zhuǎn)換相關(guān)的計算的平衡時間尺度進行對比。在IM Na+使用 mf old server,對于 HPl 得到 AG。=-16. 4kcal/mol,對于 HP2 得到-12. 2kcal/mol,產(chǎn)生以小時計的近似(完全封閉至打開)時間尺度。相反地，估計產(chǎn)生τ (0)約ls，短幾個數(shù)量級。時間尺度的這種差異，與上述的"棘輪"構(gòu)思相一致。更具體地，如果通過2個(而不是I個)熱激活步驟(每個約5個堿基)發(fā)生納米孔解鏈，總時間會減少至秒級。通過2個獨立的方案，恒定力或固定的加載速度，估計I. 5nm a -HL通道內(nèi)的ssDNA上的有效電荷。兩種方法都產(chǎn)生對于孔內(nèi)的鏈I. 13e或每個核苷酸O. 094e的有效電荷,表明通道中的DNA的負電荷被帶正電荷的鉀離子的"縮合"和a-HL通道內(nèi)壁上極性基團的存在有效地平衡，這與以前的結(jié)果一致。該有效電荷可以用于計算在任何給定V的力。動態(tài)力測量與上述的圖象一致。在高加載速度(變動> 2V/s)，通過力導(dǎo)致的勢壘高度的快速變化，確定解鏈時間(并從而確定Vc)。在該限度中，系統(tǒng)不會經(jīng)歷許多打開-關(guān)閉轉(zhuǎn)換，且Vc與log(〗>)成正比。對于小 值，存在向另一個方案的軟交叉，其特征在于臨界電壓對加載速度的弱依賴性。在該方案中，電壓保持足夠低足夠長的時間，以允許系統(tǒng)在關(guān)閉和打開狀態(tài)之間變動，直到最后的解鏈。圖17中的對數(shù)曲線的斜率，給出了如方程2所定義的Ve。擬合參數(shù)與使用恒定力方法得到的值非常一致。另外，將擬合向1/_ = 1V/S (即，k)g(P>0)的外推，可以用于估計所述2個發(fā)夾的τ (0)。從動力學測量得到的值始終小于在恒定力得到的外推值(大約差2倍)。注意到，與HPl和ΗΡ2相對應(yīng)的曲線移位大約20mV。使用測得的在DNA上的有效電荷，可以將該變化解釋為約lkBT(約O. 6kcal/mol)的能量差。盡管已經(jīng)參考不同的實施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當認識到，在所附權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明也存在許多種類的進一步的和其它的實施方案。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方式I.分析一種或多種目標多核苷酸分子的方法,包括(a)使用所述目標多核苷酸作為模板，設(shè)計一種或多種設(shè)計單體，其中單個設(shè)計單體進一步與"O"或"I"相對應(yīng)，其中2個單獨的設(shè)計單體與預(yù)定的核苷酸堿基相對應(yīng)，且其中所述單個設(shè)計單體具有一個或多個信號分子；(b)通過連接多個所述的設(shè)計單體，形成一種或多種設(shè)計聚合物；(c)重復(fù)步驟(a)和(b)，直到構(gòu)建出一種或多種預(yù)定的設(shè)計聚合物；(d)通過在適合雜交的條件下，混合所述設(shè)計聚合物和信號分子，形成設(shè)計聚合 物-信號復(fù)合物；和(e)對⑷所述的復(fù)合物進行分析。2.項目I的方法，其中所述目標多核苷酸選自DNA，RNA和PNA。3.項目2的方法，其中所述目標多核苷酸是DNA。4.項目3的方法，其中所述DNA是cDNA或gDNA。5.項目2的方法，其中所述目標多核苷酸選自單鏈，雙鏈，或二者的組合。6.項目I的方法，其中所述目標多核苷酸可以是真核生物的或原核生物的。7.項目I的方法，其中所述目標多核苷酸是植物的或動物的。8.項目I的方法，其中所述目標多核苷酸可以具有約10個核苷酸堿基至約100，000個核苷酸堿基的大小。9.項目I的方法,其中所述設(shè)計單體包含一個或多個核苷酸堿基。10.項目9的方法，其中所述設(shè)計單體的核苷酸堿基的范圍從約I個核苷酸堿基至約100個核苷酸堿基。11.項目9的方法，其中所述設(shè)計單體的核苷酸堿基的范圍從約5個核苷酸堿基至約10個核苷酸堿基。12.項目9的方法，其中所述設(shè)計單體可以包含DNA，RNA或PNA。13.項目I的方法，其中將所述目標多核苷酸的每個單獨的單元用二進制碼表示。14.項目13的方法，其中所述單獨的單元選自腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶及其修飾形式。15.項目13的方法，其中所述二進制碼包含"O"和"I"，其中所述"O"和"I"的特定排列與所述單個單元相對應(yīng)。16.項目I的方法，其中所述設(shè)計聚合物包含以與所述目標多核苷酸相對應(yīng)的特定順序排列的一個或多個設(shè)計單體。17.項目I的方法，其中所述信號分子與所述設(shè)計單體雜交。18.項目17的方法，其中所述信號分子和所述設(shè)計單體之間的雜交百分比是約90%或更大。19.項目17的方法，其中所述信號分子和所述設(shè)計單體之間的雜交百分比是約80%至約 90%。20.項目17的方法，其中所述信號分子和所述設(shè)計單體之間的雜交百分比是約70%至約 80%。21.項目17的方法，其中所述信號分子和所述設(shè)計單體之間的雜交百分比是約60%至約 70%。22.項目I的方法，其中所述信號分子是分子信標。23.項目22的方法，其中所述分子信標包含一個或多個熒光團和一個或多個淬滅劑。24.項目23的方法，其中所述信標的5'端的核苷酸序列與所述信標的3'端的核苷酸序列互補。25.項目I的方法，其中存在2個分子信標，其中每個信標與特定的設(shè)計單體相對應(yīng)。26.項目25的方法，其中第一個分子信標與第一個設(shè)計單體相對應(yīng)，且其中第二 個分子信標與第二個設(shè)計單體相對應(yīng)。27.項目I的方法，其中步驟(a)和(b)形成產(chǎn)生所述設(shè)計聚合物的循環(huán)。28.項目27的方法，其中所述設(shè)計聚合物在I個循環(huán)后包含6個設(shè)計單體，從而在完成每個循環(huán)后，所述設(shè)計聚合物延伸至少6個設(shè)計單體。29.項目28的方法，其中所述設(shè)計單體在所述設(shè)計聚合物中彼此共價連接。30.項目I的方法，其中步驟(b)中所述的設(shè)計聚合物是雙鏈多核苷酸分子。31.項目I的方法，其中步驟(d)中所述的設(shè)計聚合物是部分地或完全地單鏈的。32.項目I的方法，其中步驟(e)還包括，將所述設(shè)計聚合物-信號復(fù)合物引入納米孔系統(tǒng)。33.項目32的方法，其中所述納米孔系統(tǒng)包含多個納米孔和一個或多個檢測系統(tǒng)。34.項目33的方法，其中所述納米孔包含一個或多個通道和脂雙層。35.項目34的方法，其中所述納米孔選自α-溶血素，λ噬菌體的受體，短桿菌肽，纈氨霉素，大腸桿菌，志賀氏菌屬，Tsx，F(xiàn)菌毛，線粒體孔蛋白。36.項目35的方法，其中所述納米孔是α -溶血素。37.項目36的方法，其中所述α -溶血素包含孔腔和通道。38.項目37的方法，其中所述孔腔的直徑是約2. 5nm。39.項目37的方法，其中所述通道具有約I. 5nm直徑。40.項目34的方法，其中所述通道具有約O. 5nm至約2. Onm的孔徑。41.項目32的方法，還包括使所述設(shè)計聚合物-信號復(fù)合物解鏈，從而使所述設(shè)計聚合物的單鏈部分進入并通過所述納米孔系統(tǒng)的通道。42.項目41的方法，其中所述解鏈是跨所述納米孔系統(tǒng)建立的電場的結(jié)果。43.項目41的方法，其中跨所述納米孔系統(tǒng)的電場促進所述單鏈設(shè)計聚合物移動進入并通過所述通道。44.項目41的方法，其中解鏈過程導(dǎo)致一個或多個信號分子的釋放。45.項目44的方法，其中所述釋放的信號分子包含能發(fā)射出可檢測能量的分子和淬滅分子，其中所述釋放的信號分子自雜交，從而淬滅所述發(fā)射分子。46.項目45的方法，其中所述發(fā)射分子是熒光團。47.項目46的方法，其中所述熒光團選自TMR，Cy5，CPM等。48.項目46的方法,其中所述淬滅分子選自Dabcyl,Dabsyl,甲基紅,Elle淬滅劑坐寸O49.項目I的方法，其中步驟(e)所述的分析包括檢測來自所述信號分子的能量。50.項目49的方法，其中所述檢測包括熒光檢測。51.項目33的方法，其中所述檢測系統(tǒng)是光學檢測系統(tǒng)。52.項目51的方法，其中所述光學檢測系統(tǒng)是熒光檢測器。53.分析一種或多種目標多核苷酸分子的方法,包括(a)使用所述目標多核苷酸作為模板，設(shè)計一種或多種設(shè)計單體，其中單個設(shè)計單體進一步與"O"或"I"相對應(yīng)，其中2個單獨的設(shè)計單體與預(yù)定的核苷酸堿基相對應(yīng)， 且其中所述單個設(shè)計單體具有一個或多個信號分子；(b)通過連接多個所述的設(shè)計單體，形成一種或多種設(shè)計聚合物；(c)重復(fù)步驟(a)和(b)，直到構(gòu)建出一種或多種預(yù)定的設(shè)計聚合物；(d)通過在適合雜交的條件下，混合所述設(shè)計聚合物和信號分子，形成設(shè)計聚合物-信號復(fù)合物；(e)將(d)所述的復(fù)合物引入納米孔系統(tǒng)，在其中所述復(fù)合物解鏈，且其中所述設(shè)計聚合物的單鏈部分進入并通過所述納米孔系統(tǒng)；和(f)分析(e)所述的單鏈設(shè)計聚合物。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含 可雜交探針聚合物，包括以對應(yīng)于目標多核苷酸的核苷酸序列的順序連接在一起的多個可雜交探針單體，其中所述可雜交探針聚合物中的一個或多個可雜交探針單體與所述目標多核苷酸的一個或多個預(yù)訂的核苷酸堿基相對應(yīng)； 多個可淬滅熒光探針，每個可淬滅熒光探針包含核苷酸序列、熒光團和淬滅劑，其中每個可淬滅熒光探針與可雜交探針聚合物中的一個可雜交探針單體雜交；并且除了末端可淬滅熒光探針之一的熒光團外，每個熒光團被臨近可淬滅熒光探針的淬滅劑所淬滅。
2.權(quán)利要求I的組合物，其中所述目標多核苷酸選自DNA和RNA。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述目標多核苷酸是DNA。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述DNA是cDNA或gDNA。
5.權(quán)利要求I的組合物，其中所述可淬滅熒光探針中的核酸包括DNA，RNA和/或PNA。
6.權(quán)利要求I的組合物，其中所述可雜交探針單體包括DNA，RNA和/或PNA。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述可雜交探針單體的核苷酸堿基的范圍是從約5個核苷酸堿基至約20個核苷酸堿基。
8.權(quán)利要求I的組合物，其中所述目標多核苷酸中的每個核苷酸用可雜交探針單體的二進制碼表示。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述目標多核苷酸中的核苷酸選自腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶及其修飾形式。
10.權(quán)利要求I的組合物，其中所述組合物包含多個不同的可淬滅熒光探針，每個探針包含不同的熒光團，其中每個探針與不同的可雜交探針單體雜交。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述組合物包含2種不同的可淬滅熒光探針。
12.權(quán)利要求I的組合物，其中所述可淬滅熒光探針在分離中自淬滅。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述可淬滅熒光探針是分子信標。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述分子信標的5'端的核苷酸序列部分與所述分子信標的3'端的核苷酸序列部分相互補。
15.權(quán)利要求I的組合物，進一步包含納米孔系統(tǒng)。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述納米孔系統(tǒng)包含多個納米孔和一個或多個檢測系統(tǒng)。
17.權(quán)利要求15的組合物，其中所述納米孔包含在合成的有機或無機薄膜中產(chǎn)生的一個或多個納米孔。
18.權(quán)利要求15的組合物,其中所述納米孔的孔徑是約2.5nm至約9nm。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中所述納米孔系統(tǒng)包括納米孔陣列。
20.權(quán)利要求15的組合物，其中所述納米孔系統(tǒng)包括一個或多個通道和脂雙層。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中所述納米孔系統(tǒng)中的納米孔選自α-溶血素，λ噬菌體的受體，短桿菌肽，纟顏氨霉素，OmpF, OmpC, PhoE, Tsx, F菌毛,線粒體孔蛋白(VDAC)。
22.全力企業(yè)21的組合物，其中所述納米孔是α-溶血素。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述α-溶血素包含孔腔和通道。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述孔腔的直徑是約2.5nm。
25.權(quán)利要求23的組合物，其中所述通道具有約1.5nm直徑。
26.權(quán)利 要求25的組合物，其中所述通道具有約O.5nm至約2. Onm的孔徑。
全文摘要
本文描述了分析聚合物分子的方法。這些方法用于以單分子靈敏度高處理量讀出DNA和RNA分子。本發(fā)明的方法包括(1)DNA(或RNA)雙鏈的電控制的解鏈,和(2)使用一種或多種分子信號檢測，讀出分子的身份(或密碼)。本發(fā)明還提供了一種超高處理量光學-納米孔DNA讀出平臺。
文檔編號C12Q1/68GK102925549SQ20121029815
公開日2013年2月13日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者A·梅勒, J·麥瑟, J·S·埃德 申請人:哈佛學院院長等