專利名稱：一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體Pul324及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體Pul324及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉原料一般含有60 90%的支鏈淀粉，而支鏈淀粉所含的4 6%葡萄糖殘基以α-1,6-糖苷鍵連接。普魯蘭酶(Pullulanase，EC 3. 2. I. 41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點的α -I, 6-糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的解支酶，在改善淀粉酶對淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量及開發(fā)新產(chǎn)品方面具有相當巨大的價值，在食品、醫(yī)藥、紡織、生物能源等行業(yè)中有著非常重 要的用途及良好的市場前景，例如可利用其生產(chǎn)高純度葡萄糖和果糖、高麥芽糖漿、燃料乙醇，以及改性淀粉。近年來隨著淀粉原料深加工工業(yè)的發(fā)展，要求酶制劑工業(yè)不斷更新和完善酶的種類和性能，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。我國自從七十年代開始便對普魯蘭酶進行研究開發(fā)，但由于酶活較低而僅限于實驗室研究，目前普魯蘭酶是淀粉制糖酶系中唯一一種我國尚不能自主生產(chǎn)的產(chǎn)品。目前應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的普魯蘭酶源自丹麥Novo公司，該公司所生產(chǎn)的普魯蘭酶是由嗜酸性普魯蘭芽抱桿菌acidopullulyticus)經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生。此夕卜，國外來源于產(chǎn)氣克雷伯氏菌aerogefles)、枯草芽孢桿菌
subtil is、取Bacillus derami fi cans的普魯蘭酶也得到了商業(yè)化生產(chǎn)。因此，我國在普魯蘭酶的研究上距離發(fā)達國家有很大差距，工業(yè)普魯蘭酶完全依賴進口，定價權(quán)掌握在少數(shù)外國公司手中，壟斷的市場供應(yīng)導致了國內(nèi)普魯蘭酶高昂的銷售價格，極大的限制了國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了改變我國對進口產(chǎn)品的依賴，尋找一條國產(chǎn)化的道路，本研究使用酶工程技術(shù)開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的高性能普魯蘭酶，并利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株進行分泌表達，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)普魯蘭酶打下堅實基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體PU1324及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的新的普魯蘭酶突變體Pul324(SEQ ID NO. 2)，其是通過分子改造長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因(GenBank序列號JN872757. I)而得到的，具體是利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)缺失野生型基因上的前324個堿基，改造得到一個新的普魯蘭酶突變體Pul324。與原酶相比，這個突變體在大腸桿菌宿主中能夠有效分泌表達，發(fā)酵液上清是原酶的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了 40%，其性質(zhì)有利于降低普魯蘭酶的生產(chǎn)成本，更加適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體基因/7W324，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所
/Jn ο所述的普魯蘭酶突變體基因/7^/7324編碼的蛋白質(zhì)，由818個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
所述的普魯蘭酶突變體基因/7 7324，該突變體是通過提取長野芽孢桿菌{PullulanibadIlus naganoensis )ATCC 53909 基因組 DNA,根據(jù) Genbank 中已報道的基因序列為依據(jù)，設(shè)計以下引物來獲得缺失前324 bp堿基的突變體基因/7 7324
上游引物 Fl 為GTAfi^TTTACCTGCTGTAAGTAACGC下游引物 Rl 為GTAC7Tfi^TTTACCATCAGATGGGCT
所述的普魯蘭酶突變體基因/^/7324編碼的蛋白質(zhì)在淀粉水解過程中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明普魯蘭酶突變體Pul324的宿主。本發(fā)明所述的新的普魯蘭酶突變體Pul324，該突變體酶在淀粉水解中的具有廣泛的用途。其特殊在于與原酶相比，突變體Pul324在大腸桿菌宿主中能夠有效的分泌表達，發(fā)酵液上清的酶活提高為原來的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了 40%。突變體基因/7^/7324比野生 型基因小，有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。本發(fā)明所述的新的普魯蘭酶突變體Pul324的制備方法包括普魯蘭酶突變體基因PumA的獲得、普魯蘭酶突變體基因的表達、普魯蘭酶突變體酶活的測定等步驟，具體如下
(I)普魯蘭酶突變體基因/^/7324的獲得
根據(jù)普魯蘭酶基因序列信息，從原基因(GenBank序列號JN872757. I)的325位堿基開始設(shè)計引物來進行改造。以長野芽孢桿菌基因組DNA為模版，使用上游引物Fl :5’ -GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC - 3’(SEQ ID NO. 1，包含一個I 酶切位點)和下游引物 Rl 5’ - GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT _ 3 (SEQ ID NO. 2，包含一個ZAo I 酶切位點)，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增普魯蘭酶突變體基因。(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證
用限制性內(nèi)切酶及^7 I和通o I對普魯蘭酶突變體基因進行雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET-22b (+)連接得到pET22b-/^7324，轉(zhuǎn)化宿主疋coli DH5 a，提取重組質(zhì)粒進行酶切驗證，并進一步進行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子。(3)基因工程菌株的構(gòu)建
將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(CaCl2化學法轉(zhuǎn)化)內(nèi)，利用菌落PCR的方法驗證陽性轉(zhuǎn)化子疋coli BL21 (DE3)/ pET22b-/7y7324。經(jīng)測定，發(fā)酵液上清的粗酶液酶活力為野生型的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了 40%。本發(fā)明的突出的實質(zhì)性特點和技術(shù)效果在于本發(fā)明利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)缺失長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因上的前324個堿基，改造得到一個新的普魯蘭酶突變體Pul324。該突變體基因比野生型基因小，有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。與原酶相比，普魯蘭酶突變體Pul324在大腸桿菌宿主中能夠有效分泌表達，發(fā)酵液上清的酶活提高為原來的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了 40%，其性質(zhì)有利于降低普魯蘭酶的生產(chǎn)成本，更加適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式本發(fā)明使用的長野芽孢桿菌菌種可以從菌種保藏中心購買，也可以通過野外采集或者其他途徑獲得。本發(fā)明采用的微生物培養(yǎng)、基因克隆、表達技術(shù)和相關(guān)的技術(shù)方案是本領(lǐng)域中常用的成熟技術(shù)，涉及的專業(yè)術(shù)語也是本領(lǐng)域中常見的專業(yè)術(shù)語，因此本發(fā)明的文本對于本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是顯而易見的。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作進一步說明，該實施例是說明性的，而不是限定性的，不能被解釋為限定本發(fā)明的保護范圍。下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細描述
(I)普魯蘭酶突變體基因pul2 A和PUlH的獲得
長野芽抱桿菌iPulIulanibaciIIus naganoensis)ATCC 53909從德國微生物菌種保藏中心購買，根據(jù)該菌的普魯蘭酶基因序列信息，分別從原基因的235、325位堿基開始設(shè)計引物
上游引物 F2 :5，- GTAGAATTCCATCGATTTAAGCAAAGG _ 3，·上游引物 FI : 5 ’ - GTAGAATTCACCTGCTGTAAGTAACGC - 3 ’·
下游引物 Rl :5’ - GTACTCGAGTTTACCATCAGATGGGCT - 3’
其中上游引物包含一個及^7 I酶切位點(下劃線)，下游引物包含一個通ο I酶切位點(下劃線)。認 Pullulanibacillus naganoensis ATCC 53909 基因組為模版進行 PCR 擴增。反應(yīng)體系為ddH20 41. 5 μ L, IOXbuffer 5 μ L, dNTP (2.5 mmol/L) I yL，上下游引物(20 μπιοΙ/L)各0. 5 μ L，DNA模板I μ L，高保真DNA聚合酶0. 5 μ L0 PCR擴增條件為94° C大變性5min，94° C變性20s，61° C退火40s，72° C延伸3 min，30個循環(huán)，最后72° C延伸10 min。利用上游引物F2和下游引物Rl可擴增得到/7 7234基因，而利用上游引物Fl和下游引物Rl可擴增得到/7 7324基因。將所得到的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測到擴增產(chǎn)物大小與目的基因片段大小完全吻合。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒(天根公司)進行純化。具體步驟參考DNA產(chǎn)物純化試劑盒說明書。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I對純化的普魯蘭酶突變體基因進行雙酶切，與同樣經(jīng)過雙酶切的pET-22b (+)連接得到pET22b-pul234和pET22b-pul324，轉(zhuǎn)化宿主E. coli DH5 α，提取重組質(zhì)粒進行酶切驗證，并進一步進行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子。將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(CaCl2化學法轉(zhuǎn)化)內(nèi)，利用菌落PCR的方法驗證陽性轉(zhuǎn)化子萬.coli BL21(DE3)/pET22b-/w7234和萬.coliBL21(DE3)/ pET22b-/^7324。將構(gòu)建成功的基因工程菌株接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)，37° C培養(yǎng)10 h。取O. 5 mL的液體種子接種50 mL液體LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)，37° C培養(yǎng)2-3 h，當OD62tl為O. 4左右時，加入I mM IPTG，然后置于37° C進行誘導，時間12 h。本發(fā)明采用DNS試劑顯色法測定普魯蘭酶活力。其原理為普魯蘭酶水解普魯蘭糖底物得到還原糖，還原糖與DNS試劑所含的3，5- 二硝基水楊酸共熱后產(chǎn)生棕紅色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與還原糖的量成正比。使用分光光度法測定吸光值即可計算出普魯蘭酶的活力。酶活測定的步驟為取ImL發(fā)酵液12，000r/min離心3min得到上清酶液。于離心管中加入100 μ L濃度為l%(w/v)普魯蘭的乙酸鈉緩沖液(100mM，pH4. 75)，然后加入100 μ L上清酶液，60°C水浴中保溫15min。冰浴終止反應(yīng)，然后加入過量的DNS (300 μ L)試劑，沸水浴顯色5min，冷卻后測定OD54tl,即可計算出胞外酶活。菌體沉淀的菌體用200 μ L無菌水懸浮，加入適量Triton X-100和溶菌酶,37°C水浴30min, 12, 000r/min離心3min,取上清按上述方法分析胞內(nèi)酶活。與原酶相比，普魯蘭酶突變體Pul324在大腸桿菌宿主中能夠有效的分泌表達，發(fā)酵液上清的酶活提高為原來的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了 40%。在淀粉液化過程中，糖化酶則主要水解直鏈淀粉的a-1，4-糖苷鍵。而普魯蘭酶能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點的a -I, 6-糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉便于其它淀粉酶對淀粉的作用效果，提高淀粉水解效率、降低能耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量及開發(fā)新產(chǎn)品方面具有較高的價值。在淀粉糖化過程中，適當稀釋的糖化酶Dextrozyme DX催化反應(yīng)0. 5、I. O、I. 5和2. Oh,分別產(chǎn)生0. 758、I. 502,2. 219和2. 628g/L還原糖。當輔助加入普魯蘭酶突變體Pul324，其它條件不變的情況下，產(chǎn)生的還原糖濃度提高至I. 071,2. 307、
3.145和3. 902g/L，水解效率提高幅度均大于40%。由此可見，輔助加入普魯蘭酶突變體Pul324確實可以有效提高淀粉水解效率。該發(fā)明具有重要的經(jīng)濟效益，突變體的特殊性質(zhì)有利于降低普魯蘭酶的生產(chǎn)成 本，更加適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。應(yīng)該理解的是，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，例如，所述的野生型普魯蘭酶除了來源于長野芽孢桿菌之外，還可以來源于產(chǎn)氣克雷伯氏菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、BaciIlus deramificans、BaciIlus acidopullulyticus 等菌株。所述的載體適于在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、畢赤酵母等宿主中表達。也可通過電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等將本發(fā)明的普魯蘭酶突變體轉(zhuǎn)入原核或者真核宿主中，以實現(xiàn)普魯蘭酶突變體的表達。或者通過酶工程技術(shù)對突變體的氨基酸序列進行改造。而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
序列表
<110>廣西科學院
〈120〉一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體Pul324及其應(yīng)用 〈160〉 2
<170> PatentIn version 3.5〈210〉 I〈211〉 2457〈212〉 DNA
〈213〉長野芽抱桿菌naganoensis )
〈400〉 I
cctgctgtaa gtaacgctta tttagatgct tccaaccaag tgttggtcaa gcttagccag60
ccgtttactc ttggtgaagg ttcaagcggt tttacggttc atgatgacac agcaaataag120
gatattccag ttacatctgt tagtgatgcc aatcaggtaa cggctgtttt agcaggtact180
ttccagcata tttttggggg gagtgattgg gcaccggata atcacaatac tttactaaaa240
aaggtgaata gcaatctcta tcaattttca ggaaatcttc ctgaaggaaa ctaccaatat300
aaagtggctt taaatgatag ctggaataat ccgagctacc catctgataa cattaatttg360
acagtgccag ctggtggtgc ccatgttaca ttttcttata taccatccac ccatgctgtt420
tatgacacga ttaacaatcc taatgcggat ttacaagtag atagcagcgg tgttaagacg480
權(quán)利要求
1.一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體基因/7W324，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的普魯蘭酶突變體基因/7 7324編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，由818個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的普魯蘭酶突變體基因/^7324，其特征在于，該突變體是通過提取長野芽抱桿菌iPullulanibadIlus naganoensis) ATCC 53909基因組DNA,根據(jù)Genbank中已報道的基因序列為依據(jù)，設(shè)計以下引物來獲得缺失前324 bp堿基的突變體基因/^"324 上游引物 Fl 為GTAG^77TACCTGCTGTAAGTAACGC 下游引物 Rl 為GTAC7TG^TTTACCATCAGATGGGCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的普魯蘭酶突變體基因/7 7324編碼的蛋白質(zhì)在淀粉水解過程中的應(yīng)用。
全文摘要
一種長野芽孢桿菌普魯蘭酶突變體Pul324，其獲得方法是利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)對來源于長野芽孢桿菌(Pullulanibacillusnaganoensis)普魯蘭酶氨基酸序列進行分子改造，通過PCR方法缺失原酶上的前108個氨基酸殘基，獲得在大腸桿菌宿主中能夠有效分泌表達的突變體Pul324。將其插入pET-22b(+)中構(gòu)建重組載體，導入大腸桿菌宿主進行分泌表達。該突變體基因比野生型基因小，有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。與原酶相比，突變體Pul324在大腸桿菌宿主中能夠有效分泌表達，發(fā)酵液上清的酶活提高為原來的24倍，胞內(nèi)酶活則提高了40%。采用本發(fā)明能夠提高宿主的普魯蘭酶分泌表達量，表達產(chǎn)物能夠提高淀粉的水解效率。
文檔編號C12N15/56GK102796751SQ20121029849
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者謝能中, 黃日波, 王青艷, 秦艷, 米慧芝, 朱綺霞, 申乃坤, 朱婧, 陸艷, 曹薇, 黎貞崇, 陳東 申請人:廣西科學院