專利名稱：外源基因在沙門氏菌中表達(dá)優(yōu)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因優(yōu)化表達(dá)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及外源基因在沙門氏菌中表達(dá)優(yōu)化的方法。
背景技術(shù)：
在生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)過程中廣泛用到基因克隆、表達(dá)，而基因在異源宿主中表達(dá)量受到多方面的影響，例如啟動子、調(diào)控序列、終止子、密碼子使用頻率等等。在基因表達(dá)研究中，研究者比較注意選擇合適的表達(dá)載體和宿主系統(tǒng)，而往往忽視基因本身是否與載體和宿主系統(tǒng)為最佳匹配這樣一個實質(zhì)性問題?；虻淖罴鸦磉_(dá)可以通過對基因的重新設(shè)計和合成來實現(xiàn)，如消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子，二級結(jié)構(gòu)最小化，調(diào)整GC含
且雄里寺。遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。實際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子。重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達(dá)系統(tǒng)中)的事實并不很奇怪?；蚶玫拿?碼子可能不是你正在利用的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行高水平表達(dá)所偏愛的密碼子，這種情況是可能的。利用偏愛密碼子并避免利用率低的或稀有的密碼子可以合成基因。在同源表達(dá)系統(tǒng)中，同較低水平表達(dá)的基因相比，較高表達(dá)的基因可能有很不同的密碼子偏愛。通過對密碼子利用的歸類分析，人們可以真正預(yù)測任何基因在生物中的表達(dá)水平。在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中，密碼子的使用偏向性已經(jīng)有不少研究與報道。而在沙門氏菌是重要的致病性細(xì)菌，有關(guān)在少門氏菌表達(dá)蛋白質(zhì)的報道很少，更不用用說基因在沙門氏菌的優(yōu)化表達(dá)了。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高基因在沙門氏菌中表達(dá)量，本發(fā)明提供了異源基因在沙門氏菌中表達(dá)優(yōu)化的方法，該方法通過NCBI收集3千多條沙門氏菌基因統(tǒng)計獲得沙門氏菌密碼子使用頻率表，并且通過表達(dá)多個不同的外源基因驗證，表明如果外源基因按照本發(fā)明所公布的沙門氏菌密碼子使用頻率表選用高頻使用密碼子，在同等條件下，外源基因表達(dá)量將提高2-10倍。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:外源基因在沙門氏菌中優(yōu)化表達(dá)的方法，包括如下具體步驟:1:從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得沙門氏菌基因的開放閱讀框，把開放閱讀框轉(zhuǎn)化成為氨基酸序列，察看是否在氨基酸序中存在終止現(xiàn)象，剔出不能完成翻譯成氨基酸的核苷酸序列，然后按照三個核苷酸編碼一個氨基酸的方法，逐一統(tǒng)計每個沙門氏菌基因的開放閱讀框的每個氨基酸對應(yīng)的核苷酸，即編碼氨基酸的核苷酸密碼子，最終獲得沙門氏菌密碼子使用頻率表，如表I所示；
表1:沙門氏菌密碼子使用頻率表
權(quán)利要求
1.外源基因在沙門氏菌中優(yōu)化表達(dá)的方法，其特征在于，包括如下具體步驟: 步驟1 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得沙門氏菌基因的開放閱讀框，將開放閱讀框轉(zhuǎn)化成為氨基酸序列，然后按照三個核苷酸編碼一個氨基酸的方法，逐一統(tǒng)計每個沙門氏菌基因的開放閱讀框的每個氨基酸對應(yīng)的核苷酸，即編碼氨基酸的核苷酸密碼子，最終獲得沙門氏菌密碼子使用頻率表； 步驟2:分析沙門氏菌密碼子使用頻率表可知，其中密碼子UAA、UGA、UAG、CGA、AGA、AGG、UGU 使用的頻率最低；而 CUA、UCU、UGC、UCA、CCU、CCC、CCA、CGG、AGU、AUA、ACA、GGA、CAC和ACU密碼子使用頻率較高；其余密碼子使用頻率最高； 步驟3:克隆或者合成目的基因，并且測定其核苷酸序列，根據(jù)上述沙門氏菌密碼子使用頻率表和氨基酸密碼子對應(yīng)表，在不改變氨基酸的情況下，通過分子突變或者基因合成的方式，把所述目的基因中沙門氏菌使用頻率最低和較高的密碼子突變成為使用頻率最高的密碼子，獲得新的編碼目的基因的核苷酸片段； 步驟4:通過分子生物學(xué)方法把新的編碼目的基因的核苷酸片段插入到表達(dá)載體中，而后轉(zhuǎn)入基因工程大腸桿菌，對獲得的克隆進(jìn)行鑒定； 步驟5:將步驟4鑒定正確的含目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入沙門氏菌中，并在沙門氏菌中對目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的外源基因在沙門氏菌中優(yōu)化表達(dá)的方法，其特征在于，還包括步驟6:目的基因誘導(dǎo)表達(dá)后，通過SDS-PEGA電泳或Westen-Blot對表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明提供了外源基因在沙門氏菌中優(yōu)化表達(dá)的方法，包括如下具體步驟從NCBI數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計獲得沙門氏菌密碼子使用頻率表；分析各密碼子使用頻率克隆或者合成目的基因，并且測定其核苷酸序列，根據(jù)上述沙門氏菌密碼子使用頻率表和氨基酸密碼子對應(yīng)表，在不改變氨基酸的情況下，通過分子突變或者基因合成的方式，把所述目的基因中沙門氏菌使用頻率最低和較高的密碼子突變成為使用頻率最高的密碼子，獲得新的編碼目的基因的核苷酸片段；通過分子生物學(xué)方法把新的編碼目的基因的核苷酸片段插入到表達(dá)載體中，而后轉(zhuǎn)入基因工程大腸桿菌，對獲得的克隆進(jìn)行鑒定；將鑒定正確的含目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入沙門氏菌中。
文檔編號C12N15/74GK103074357SQ20121029872
公開日2013年5月1日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者徐家華, 陳瑞愛, 張東霞, 湯欽 申請人:廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司