專利名稱：黃瓜嫩果白色果皮基因w連鎖的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種，特別是黃瓜嫩果白色果皮基因w連鎖的SSR標(biāo)記及其在黃瓜種資選擇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，因其風(fēng)味清香、ロ感脆爽,深受各國消費(fèi)者的喜愛。隨著消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)黃瓜品質(zhì)的重視程度與日俱增。品質(zhì)育種也已成為黃瓜育種的重點(diǎn)之一。黃瓜果實(shí)品質(zhì)包括外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)。通常說的品質(zhì)性狀主要指商品性即外觀品質(zhì)，包括瓜色、瓜長(zhǎng)、果刺、果瘤、果色均勻度、光澤度等。嫩果果皮顔色作為重要的商品性狀，對(duì)商品銷售影響很大。研究黃瓜嫩果果皮顔色的遺傳規(guī)律及分子標(biāo)記具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。有關(guān)控制黃瓜嫩果果皮顔色的基因，已報(bào)道有w (白色果皮)、DG (深緑色果皮)、 dg (綠色果皮)、黃緑色果皮(yg)、D (暗色果皮)(Pierce and ffehner, 1990;Wehner andStaub, 1997;顧興芳等，2005)。前人對(duì)于嫩果果皮顔色的遺傳規(guī)律進(jìn)行了多項(xiàng)研究。Cochran (1938)報(bào)道嫩果果皮白色(w)隱性于綠色。Youngner (1952)認(rèn)為嫩果黃綠色果皮性狀由yg控制，yg對(duì)控制果皮呈深緑色的基因表現(xiàn)為隱性，對(duì)控制果皮顔色呈淺綠色的基因表現(xiàn)為上位性。孫曉丹等(2011)研究表明，控制嫩果白色果皮的基因(w)對(duì)控制嫩果果皮緑色的基因(yg)為隱性，且w與其它修飾基因存在互作，互作類型為隱性上位。孫曉丹等(2011)同時(shí)還研究了 w與其它性狀之間的遺傳關(guān)系,發(fā)現(xiàn)yg,w, Tu (果瘤)及Se (shapeof fruit end，暫命名)之間的遺傳關(guān)系為獨(dú)立遺傳。對(duì)于黃瓜果皮顏色分子水平的研究不多，李亞利(2008)以WD3XB-2-2構(gòu)建了F2群體，采用BSA法結(jié)合SRAP分子標(biāo)記技木，找到黃瓜果皮緑色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記ME9EM1-309和ME8EM14-425，遺傳距離分別為6cM和8. 3cM。也有研究者用AFLP分子標(biāo)記研究黃瓜嫩果白色果皮顏色遺傳規(guī)律，找到了與w連鎖的2個(gè)AFLP標(biāo)記，E43M61和E34M59，遺傳距離分別為5. 2cM和5. 6cM (孫曉丹，2011)。本試驗(yàn)以嫩果綠色果皮自交系04796 (Pl)和嫩果白色果皮自交系白葉三(P2)為親本構(gòu)建F2和回交群體，通過對(duì)6世代群體的表型鑒定，對(duì)黃瓜嫩果果皮白色基因w進(jìn)行了遺傳規(guī)律分析。以F2群體為作圖群體，利用BSA法和SSR技木，實(shí)現(xiàn)w基因的染色體定位，并獲得緊密連鎖標(biāo)記。本試驗(yàn)不僅為黃瓜嫩果果皮白色基因w的精細(xì)定位和分子克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為利用分子標(biāo)記輔助選育白色果皮黃瓜新品種提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的空白，提供了與嫩果白色果皮基因w連鎖的SSR標(biāo)記，并提供了其在選擇有白色果皮黃瓜種質(zhì)資源上的應(yīng)用，為黃瓜嫩果白色果皮基因w的精細(xì)定位和分子克隆奠定基礎(chǔ)，可以在黃瓜候選材料的任何階段對(duì)其進(jìn)行白色果皮的篩選，具有高效、限制少、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，為利用分子標(biāo)記輔助選育黃瓜白色果皮品種提供實(shí)用、高效的途徑。黃瓜嫩果白色果皮w緊密連鎖的SSR標(biāo)記，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG其擴(kuò)增的特征條帶如Seq ID No. I所示(219bp)和Seq ID No. 2所示(243bp)；與果實(shí)嫩果綠色果皮W連鎖的片段如SEQ ID No. I所示(219bp)TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCATCTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTGCAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAACTCAGGACAACCAAACACCA與果實(shí)嫩果白色果皮w連鎖的片段如SEQ ID No. 2所示(243bp) TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGGTTAGTTATTCTTCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTGGCTTTACCTTTACCTTTATACTTCATCTTTGGTTTAAAAAGTATCCATTGCAATATTATTCTTACCGTTCATAAGTATTTGTAAACTACCATTTGGAGTAGAACTCAGGACAACCAAACACCA上述SSR標(biāo)記在篩選具有嫩果白色果皮基因w的黃瓜種質(zhì)資源中的應(yīng)用，其步驟如下(I)采用上述SSR標(biāo)記為引物對(duì)待選黃瓜品種的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(2)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；(3)從檢測(cè)結(jié)果中篩選擴(kuò)增出如SEQ ID No. 2所示的片段的材料。所述PCR反應(yīng)體系為7. 5ng DNA，正向和反向引物各50ng，5 μ L Go Taq GreenMasterMix,加雙蒸水至IOul。所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4V預(yù)變性4分鐘；94V變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。所述凝膠電泳檢測(cè)指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于160V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。本試驗(yàn)以黃瓜嫩果果皮綠色自交系04796 (Pl)和嫩果果皮白色自交系白葉三(P2)為親本構(gòu)建F2和回交群體，通過對(duì)6世代群體的表型鑒定，對(duì)嫩果果皮白色基因w進(jìn)行了遺傳規(guī)律分析。再以F2群體為作圖群體，利用BSA法篩選到與w連鎖的標(biāo)記SSR06791，與w的遺傳距離為8. 6cM。通過用用不同遺傳背景的其它30份材料驗(yàn)證，標(biāo)記的準(zhǔn)確率達(dá)80%。本試驗(yàn)不僅為黃瓜嫩果果皮白色基因w的精細(xì)定位和分子克隆奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為利用分子標(biāo)記輔助選育白色果皮黃瓜新品種提供理論依據(jù)。


圖I.是SSR標(biāo)記SSR06791對(duì)黃瓜親本材料04796，白葉三，F(xiàn)l世代單株及F2群體隨機(jī)單株的檢測(cè)結(jié)果；其中=P1:04796 (果皮綠色)；P2:白葉三(果皮白色)。
具體實(shí)施例方式材料與方法
本研究所用的試驗(yàn)材料為‘04796’(P1X‘白葉三’ (P2)0‘04796’是由優(yōu)良雜交種津優(yōu)I號(hào)多代自交定向選育而成的高代自交系，果皮深緑色，刺瘤密，刺白色，果瘤小。現(xiàn)有已知品種，在顧興芳等在《中國蔬菜》2008年第6期發(fā)表的文章《耐熱黃瓜新品種中農(nóng)106號(hào)的選育》一文中也有記載，本實(shí)驗(yàn)室有保存，保證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。‘白葉三’是國內(nèi)優(yōu)良地方品種白葉三中篩選出的純系，果皮白色，刺瘤稀少，刺白色，果瘤較大?，F(xiàn)有已知品種，在張占軍在《甘肅農(nóng)業(yè)科技》2008年第12期發(fā)表的文章《9個(gè)白皮黃瓜品種在隴東的引種對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果》一文中也有記載，本實(shí)驗(yàn)室有保存，保證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。SSR引物來自國際黃瓜基因組計(jì)劃(CUGI)，共2112對(duì)(Ren et al.，2009)。詳細(xì)結(jié)果可以參見Ren等在PloS One 2009年第4期在線發(fā)表的文章《An Integrated Genetic and Cytogenetic map of the cucumber Genome》。PCR 買驗(yàn)使用 Shang hai Promega 公 ロJ的GoTaq Green Master Mix ;凝膠電泳使用盈信陽光公司的40%非變性聚丙烯酰胺,將其稀釋至6%后使用。實(shí)施例I.黃瓜果果皮白色基因w連鎖SSR標(biāo)記的篩選步驟I.黃瓜果皮顏色性狀鑒定試驗(yàn)于2008-2009年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，以04796(P1)和白葉三(P2)為父母本進(jìn)行正反交、自交、回交，獲得F1、F2及BC1P1、BC1P2群體。2009年春季在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)大棚中種植P1J2和F1,F/各10株，F(xiàn)2189株，BC1PJS株，BC1P2SO株。株距25cm，行距55cm，按常規(guī)田間管理。在開花結(jié)果期，調(diào)查六世代群體各單株上商品瓜(開花后7 10d)的果皮顔色。在種植的六世代群體中，調(diào)查果皮顏色的性狀表現(xiàn)，計(jì)算分離比，使用MicrosoftExcel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用SAS8. O對(duì)結(jié)果進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。結(jié)果顯示無論正反交后代F1果皮均表現(xiàn)為綠色；在F2群體中，緑色果皮與白色果皮植株的分離比例經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)符合3:1以04796為回交親本的回交群體全部表現(xiàn)為果皮緑色，而與另一親本白葉三回交獲得的回交群體中，果皮緑色與果皮白色的比例為1:1。由此可知，嫩果果皮白色性狀是由I對(duì)核基因控制的，并將該基因命名為w，果皮緑色(W)對(duì)果皮白色(w)為顯性。步驟2. DNA提取和SSR分析取黃瓜植株的嫩葉，用改良的CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取親本及群體各單株的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系IOyL, 3μ L DNA (2. 5ng · μ L_l)，正向和反向引物(50ng · μ L-1)各 I μ L, 5 μ L Go Taq Green Master Mix (Promega 公司產(chǎn)品)。引物使用黃瓜全基因測(cè)序開發(fā)的SSR引物(Ren et al. , 2009 ; Cavagnaro et al.,2010)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min, 16°C forever。擴(kuò)增產(chǎn)物用6. 0%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳緩沖液為
0.5 X TBE, 150V恒功率電泳分離I. 5h，電泳后銀染顯色，統(tǒng)計(jì)帶型。步驟3. SSR標(biāo)記篩選、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及連鎖圖構(gòu)建主要包括4步(1)篩選在父母本間表現(xiàn)多態(tài)的SSR標(biāo)記；(2)在F2群體中選取果皮緑色、果皮白色單株的DNA各7個(gè)，根據(jù)BSA法構(gòu)建果皮緑色，白色2個(gè)近等基因池，用池篩選多態(tài)性引物；(3)利用獲得的多態(tài)性引物分析F2群體各單株基因型；(4)利用JoinMap4. O軟件進(jìn)行連鎖圖的繪制。共顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法與母本(04796)—致的帶型記為a，與父本(白葉三)一致的帶型記為b，雜合的帶型記為h。顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法若母本為顯性標(biāo)記，則分離群體中和母本帶型一致的單株記為d，和父本帶型一致的記為b ;若父本為顯性標(biāo)記，則分離群體中和母本帶型一致的單株記為a，和父本帶型一致的記為C，未擴(kuò)增出的或模糊不清的記為U。結(jié)果顯示用2112對(duì)SSR引物對(duì)P1 (04796)和P2(白葉三)進(jìn)行篩選，其中在兩個(gè)親本間表 現(xiàn)多態(tài)的引物有211對(duì)，多態(tài)率10%。結(jié)合BSA法建池，進(jìn)ー步篩選得到了 16個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記。利用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)04796 X白葉三組合的F2群體進(jìn)行分析，結(jié)合調(diào)查性狀數(shù)據(jù)利用Joinmap4. O構(gòu)建連鎖圖。結(jié)果14個(gè)標(biāo)記和w被定位在同一連鎖群上(LOD=IO),得到與w連鎖的標(biāo)記SSR06791，遺傳距離為8.6cM。將本試驗(yàn)得到的連鎖圖與已發(fā)表的黃瓜遺傳圖譜(Ren et al. ,2009 ；Miao et al，2011)比較，發(fā)現(xiàn)本連鎖群與第3染色體上共有12個(gè)共有標(biāo)記，據(jù)此將w基因定位在第3染色體上。步驟4.標(biāo)記SSR06791PCR擴(kuò)增的差異條帶的回收純化及測(cè)序(I)目的片段的回收采用煮沸法。具體操作為先從膠上將標(biāo)記SSR06791PCR擴(kuò)增的差異條帶2條挖下來裝入I. 5mL的Eppendorf管內(nèi)，向管內(nèi)加入100 μ L超純水,加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉(zhuǎn)入95°C水浴鍋(或PCR儀)中煮30min后，5000rpm離心3min。產(chǎn)物即可取上清3 μ L做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，剰余產(chǎn)物置_20°C保存?zhèn)溆谩?2)目的片段的純化用PCR產(chǎn)物直接純化方法。在PCR產(chǎn)物中加入2倍體積的無水こ醇，_20°C過夜放置，I, 2000rpm離心5min就可以得到純化產(chǎn)物。(3)目的片段與載體的連接反應(yīng)體系為10 μ L PMD18-T Vectorl. OyL ；Ligation buffer I 5· 0 μ L ;目的片段4· 0μし在超凈工作臺(tái)上加樣，混勻反應(yīng)物，暫短離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接效率。(4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化I)取出感受態(tài)細(xì)胞，SolutionA, SolutionB，置于冰上融化；2)感受態(tài)(50 μ L) +5 μ L SolutionA+4 μ L SolutionB+46 μ L 預(yù)冷去離子水;3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到I. 5mL離心管，每管加入105 μ L，再加入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動(dòng)離心管；5)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3 5min ；6)加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基。在37°C,150rpm搖床上預(yù)培養(yǎng)Ih ；
7)將菌液涂布到含有 100 μ g ^mr1Amp,25 μ g ·ι じ1 IPTG 和 40 μ g mL^X-GAL 的 LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻涂開，置于室溫直至液體被吸收；8)倒置平板，37°C培養(yǎng)12 16h。(5)重組質(zhì)粒的藍(lán)白斑篩選經(jīng)37°C培養(yǎng)后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出現(xiàn)少量藍(lán)色菌落和較多的白色菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落涂抹在劃好方格的LB液體培養(yǎng)基中，37°C,150rpm過夜培養(yǎng)。(6)菌落PCR的檢測(cè)吸取I μ L菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取4 μ L PCR產(chǎn)物，經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與PCR Marker標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較檢測(cè)插入片段的大小，與插入目的片段大小一致的克隆即為陽性克隆。 (7)克隆后載體的測(cè)序與分析取3個(gè)陽性克隆菌液在甘油(330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液)中各保存兩份，一份_20°C保藏，ー份送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示。實(shí)施例2. w基因側(cè)翼標(biāo)記的驗(yàn)證利用30份不同果皮顏色類型的黃瓜材料對(duì)實(shí)施例I獲得的與w基因連鎖的側(cè)翼標(biāo)記SSR06791進(jìn)行驗(yàn)證，以確定標(biāo)記用于分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性這30份材料中有綠色果皮材料28份，白色果皮材料2份。經(jīng)和所選材料的田間表現(xiàn)型相比，標(biāo)記在30份材料中共有24份材料的帶型反映的表型數(shù)據(jù)與田間調(diào)查結(jié)果一致，經(jīng)計(jì)算正確率為80%。其中2份白色果皮材料均擴(kuò)增出白色果皮特征條帯。本研究中構(gòu)建了黃瓜嫩果白色果皮基因的SSR連鎖圖，所獲得的SSR標(biāo)記(SSR06791)與w的遺傳距離8. 6cM，這個(gè)與黃瓜白色果皮基因連鎖的SSR標(biāo)記為分子標(biāo)記輔助選擇育種篩選黃瓜白色果皮新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。為建立ー套快速準(zhǔn)確鑒定黃瓜嫩果白色果皮的方法提供了理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1.黃瓜嫩果白色果皮基因W連鎖的SSR標(biāo)記，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R= TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG其擴(kuò)增的特征條帶分別如Seq ID No. I、Seq ID No. 2 所示。
2.權(quán)利要求I所述的SSR標(biāo)記在篩選具有嫩果白色果皮基因w的黃瓜種質(zhì)資源中的應(yīng)用，其步驟如下(1)采用上述SSR標(biāo)記為引物對(duì)待選黃瓜品種的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(2)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；(3)從檢測(cè)結(jié)果中篩選擴(kuò)增出如SEQID No. 2所示的片段的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR反應(yīng)體系為7.5ng DNA，正向和反向引物各50ng, 5 μ L Go Taq Green Master Mix,加雙蒸水至 IOul
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4任一所述的應(yīng)用所述凝膠電泳檢測(cè)指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于160V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明“黃瓜嫩果白色果皮基因w連鎖的SSR標(biāo)記及其應(yīng)用”，涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域。黃瓜嫩果白色果皮w緊密連鎖的SSR標(biāo)記，序列如下SSR06791-F/SSR06791-R:TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG/TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG。其擴(kuò)增的特征條帶如Seq ID No.1所示(219bp)和Seq ID No.2所示(243bp)；采用本發(fā)明獲得的SSR標(biāo)記，可以在黃瓜候選材料的任何階段對(duì)其進(jìn)行嫩果白色果皮材料的篩選，具有高效、限制少的優(yōu)點(diǎn)，為選育白色果皮黃瓜提高了效率，縮短了育種周期。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102827837SQ20121029888
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者顧興芳, 張圣平, 苗晗, 王燁, 董邵云 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所