專利名稱：一種可布置不同細(xì)胞密度的微流控芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微觀結(jié)構(gòu)技術(shù)和微生物學(xué)裝置結(jié)合的領(lǐng)域，具體涉及一種可布置不同細(xì)胞密度的微流控芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的多種生理機(jī)能的實現(xiàn)，都受其周圍微環(huán)境中很多因素調(diào)節(jié)，如營養(yǎng)、生長因子、氣體分子及細(xì)胞間相互作用等等；而不同密度的細(xì)胞群落其調(diào)節(jié)因素的作用強(qiáng)度存在差異。為了更好的研究細(xì)胞周圍調(diào)控因子對細(xì)胞的作用，及細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用等問題，有效的富集一定密度的細(xì)胞群落具有非常重要的意義。以往，人們大多通過在培養(yǎng)皿上播種不同密度的細(xì)胞來實現(xiàn)不同密度細(xì)胞的富集，不僅消耗試劑較多，費(fèi)時費(fèi)力，而且對細(xì)胞密度的控制也不夠精準(zhǔn)。
微流控技術(shù)是近幾年飛速發(fā)展的前沿學(xué)科，憑借其多元化、分析快、用量少、高通量和實時觀測等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為生物細(xì)胞分析領(lǐng)域中一個強(qiáng)有力的研究手段。近來，Luo 等人(Chunxiong Luo, Xuejun Zhu, Tao Yu, et al. , A fast cell loading andhigh-throughput microfluidic system for long-term cell culture in zero-flowenvironments, Biotechnology and Bioengineering, 2008,101, 190-195.)開發(fā)了一種可布置并長期培養(yǎng)細(xì)胞的高通量微流裝置，且已被用于對酵母生長的研究，Wang等人(LiWang, Xiao Fang Ni, ChunXiong Luo, et al. , Self-loading and cell culture in onelayer microf luidic devices, Biomedical Microdevices, 2009,11，679-684.)對海拉細(xì)胞進(jìn)行了生長的研究。但是，該裝置需要人工更換不同密度的細(xì)胞溶液來獲得不同密度的細(xì)胞群落。能夠自動得到不同細(xì)胞密度的溶液，將對細(xì)胞的研究工作提供很大的便利。

發(fā)明內(nèi)容
針對研究細(xì)胞領(lǐng)域的不足之處，本發(fā)明提出一種可以布置不同細(xì)胞密度的微流控
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心/T O本發(fā)明另一目的是提出制備所述微流控芯片的方法。本發(fā)明的第三個目的是提出所述微流控芯片的應(yīng)用的方法。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案為一種可布置不同細(xì)胞密度的微流控芯片，其由多個細(xì)胞密度布置單元組成，每個細(xì)胞密度布置單元包括連接通道、細(xì)胞布置腔室、液體吸收腔室、柵欄通道，所述連接通道與細(xì)胞布置腔室連接，所述柵欄通道連接細(xì)胞布置腔室和液體吸收腔室。其中，所述柵欄通道的高度和/或?qū)挾葹镺. 5-10 μ m。該高度和寬度中至少一個小于細(xì)胞的線度，保證細(xì)胞不會被流體帶著通過柵欄通道。其中，所述細(xì)胞布置腔室的面積為2. 5 X IO3-I X IO5Um2,細(xì)胞布置腔室的高度為1-40 μ m。細(xì)胞布置腔室的高度不超過細(xì)胞線度的兩倍，細(xì)胞為單層生長，有利于顯微觀察。其中，所述液體吸收腔室的面積為I X IO5-IXlOVm2,其高度為20-200 μ m。
其中，所述細(xì)胞密度布置單元有1-100個，各個細(xì)胞密度布置單元中細(xì)胞布置腔室和液體吸收腔室的體積之和不相同、相同或不完全相同。其細(xì)胞布置腔室，液體吸收腔室和柵欄通道的大小可在上述的不同面積中任意組合。細(xì)胞布置腔室的體積相同、但液體吸收腔室的體積不同，則各個細(xì)胞密度布置單元內(nèi)細(xì)胞密度不同。當(dāng)液體吸收腔室的體積的比值為一定比例時，細(xì)胞密度布置單元內(nèi)細(xì)胞密度也成同樣比例關(guān)系。同樣，液體吸收腔室體積均相同，但細(xì)胞布置腔室體積不同，各個細(xì)胞密度布置單元內(nèi)的細(xì)胞密度不同。本發(fā)明提出的微流控芯片的制備及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用的方法，包括步驟I)用計算機(jī)輔助設(shè)計的方法繪制微流控芯片圖形，將繪制的圖形打印在膠片或光學(xué)掩膜上，套刻在涂有光刻膠的硅片上制成模具，然后用聚二甲基硅氧烷在模具上復(fù)制微流控芯片圖形，加熱固化，切下后使用；2)將所述微流控芯片固定于細(xì)胞培養(yǎng)裝置上，然后使微流控芯片處于真空狀態(tài)； 其真空狀態(tài)優(yōu)選真空度為5至IOOPa的狀態(tài)；3)將含有細(xì)胞的溶液加在所述連接通道周圍，含有細(xì)胞的溶液被吸入微流控芯片內(nèi)部。其中，還包括當(dāng)含有細(xì)胞的溶液進(jìn)入微流控芯片內(nèi)部后，將微流控芯片外部的殘留的含有細(xì)胞的溶液更替的步驟。其中，所述溶液更替是先去除殘留的溶液再換成不含有細(xì)胞的溶液，所述溶液優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)液。其中，所述步驟3)還包括覆蓋所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置的步驟。蓋上透明的上蓋可防止液體蒸發(fā)，并在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行顯微觀測。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提出了一種能夠?qū)崿F(xiàn)不同細(xì)胞密度自動分布功能的微流控芯片。該裝置可以實現(xiàn)向體系內(nèi)加入相同密度的細(xì)胞溶液，在細(xì)胞腔室得到自動布置的不同密度的細(xì)胞群落，數(shù)量范圍從單細(xì)胞、數(shù)個細(xì)胞到數(shù)十個細(xì)胞。并且，細(xì)胞在本微流控芯片上處在相對密閉的腔室中，裝置外的液體流動并不會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。另外，該裝置儲存的細(xì)胞培養(yǎng)液較多，可以為細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)，適用于長期培養(yǎng)和觀察。


圖I是本發(fā)明實施例I計算機(jī)輔助繪制的微流控芯片圖形。圖2是本發(fā)明實施例I中一個細(xì)胞密度布置單元的俯視圖。圖3為實施例2得到的細(xì)胞密度實驗數(shù)值和理論數(shù)值的比較。圖中試驗數(shù)值上方線段表示十次統(tǒng)計的方差的數(shù)值。圖中，1為液體吸收腔室,2為柵欄通道,3為細(xì)胞布置腔室,4為連接通道。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中，刻制微流控芯片的方法為打印了微流控芯片圖形的光學(xué)掩膜和塑料膠片覆蓋在涂有光刻膠的硅片上，該掩膜或膠片的透明部分接受紫外線照射發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而聚合，未經(jīng)紫外線照射的部分則可以被顯影液溶解。之后硅片及其表面剩下的凸起的光刻膠成為制作微流控芯片的陽模。將PDMS預(yù)塑體(兩種不同化學(xué)官能團(tuán)的硅氧烷，A:B=10:1)澆鑄在陽模上，紫外燈下照射過夜，完成固化。其中PDMS 預(yù)塑體為 RTV615 (GE Toshiba Silicones Co. Ltd, Shizuoka, Japan)。實施例中使用的真空裝置為 TS2-60 (Longer-Pump Company , Baoding, Hebei, China)。本發(fā)明提出的微流控芯片可用于人體細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞的研究，其細(xì)胞線度為 IO-4-10-6Hi。實施例I :制備微流控芯片I)用L-Edit繪圖，做出如圖I的圖形，將其打印在塑料膠片或光學(xué)掩膜上，作為曝光掩模。設(shè)計包括三層結(jié)構(gòu)，分別為細(xì)胞布置腔室3、連接通道4、液體吸收腔室I、連接細(xì)胞布置腔室3和液體吸收腔室I但阻擋細(xì)胞通過的柵欄通道2。液體吸收腔室I、細(xì)胞布置腔 室3和連接通道4打印在塑料膠片上，柵欄通道2打印在光學(xué)掩膜上。2)利用步驟I)得到的掩模圖形，通過多層對位套刻在硅片上制備光刻膠模具，其中細(xì)胞布置腔室層高度為20 μ m,液體吸收腔室層高度為70 μ m,連接的柵欄通道層高度為5 μ m，套刻完成后其中一個單元放大俯視圖如圖2。每塊芯片包括10個獨(dú)立的細(xì)胞密度布置單元。所有單元的細(xì)胞布置腔室面積不變，為200 X 200 μ m2的正方形,高度為均為10 μ m。而液體吸收腔室的面積包含 200 X 200 μ m2、400 X 400 μ m2、600 X 600 μ m2、800 X 800 μ m2 四種情況，其高度均為30 μ m。柵欄通道由20根長度為200 μ m且寬度、高度均為5 μ m的細(xì)通道組成。3)模具制備完成后，使用5mm厚度的PDMS (A:B=10:1)復(fù)制圖形，在65°C固化30分鐘，切下帶有圖形的PDMS，并與培養(yǎng)皿自然粘附。將該芯片置于紫外燈下照射過夜，以備使用。實施例2 用和實施例I 一樣的步驟制備微流控芯片，每塊芯片包括100個獨(dú)立的細(xì)胞密度布置單元。所有獨(dú)立單元的細(xì)胞布置腔室面積不變，為200X200 μ m2的正方形，其高度為10 μ m,而液體吸收腔室的面積包含200X200 μ m2,200X400 μ m2,200X600 μ m2,200X800 μ m2四種情況，其高度均為20 μ m。柵欄通道由20根長度為200 μ m且寬度為5 μ m、高度為10 μ m的細(xì)通道組成。模具制備完成后，使用3mm厚度的TOMS (A:B=10:1)復(fù)制圖形，在75°C固化30分鐘，切下帶有圖形的PDMS，并與培養(yǎng)皿自然粘附。將該芯片置于紫外燈下照射12h，以備使用。實施例3 用和實施例I 一樣的步驟制備微流控芯片，每塊芯片包括20個獨(dú)立的細(xì)胞密度布置單元。各單元的細(xì)胞布置腔室面積包括100Χ200μπι2、200Χ200μπι2、200Χ300μπι2的正方形和長方形，不同面積的細(xì)胞布置腔室各5個。而液體吸收腔室的面積均為200 X 200 μ m2，其高度均為20 μ m。柵欄通道由20根長度為200 μ m且寬度為10 μ m、高度為5 μ m的細(xì)通道組成。模具制備完成后，使用6mm厚度的TOMS (A:B=10:1)復(fù)制圖形，在80°C固化30分鐘，切下帶有圖形的PDMS，并與培養(yǎng)皿自然粘附。將該芯片置于紫外燈下照射10h，以備使用。實施例4 :應(yīng)用實施例I的微流控芯片實現(xiàn)在培養(yǎng)腔室中得到不同的腫瘤細(xì)胞密度。I)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞，用含有10%血清(胎牛血清，F(xiàn)BS)和1%盤尼西林-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(含氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)液，Gibco)，在37°C和5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。解離細(xì)胞使用O. 25%的Trypsin-EDTA (胰酶細(xì)胞消化液)溶液處理3_4分鐘，再加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中和，3000rpm離心，棄去上清液。使用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，離心后重懸，獲得含有的細(xì)胞懸濁液。使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，再稀釋到需要的細(xì)胞密度(4*105/ml)。2)將裝有芯片的培養(yǎng)皿放在真空裝置中抽氣30min后，真空度為80Pa，馬上加入 步驟I)制得的含有細(xì)胞的溶液，由于負(fù)壓的作用，I分鐘內(nèi)溶液會被吸入所有腔室。柵欄通道的尺寸小于細(xì)胞的尺寸，于是細(xì)胞被吸入并停留在細(xì)胞培養(yǎng)腔室。3)通過移液槍更替芯片周圍的液體，去除芯片周圍多余的細(xì)胞溶液，然后加入含有10%FBS和1%盤尼西林-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，以實現(xiàn)對細(xì)胞布置腔室內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的更替。蓋上細(xì)胞培養(yǎng)皿上蓋防止液體蒸發(fā)，并在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行顯微觀測。細(xì)胞培養(yǎng)腔室所擁有的細(xì)胞數(shù)目近似的等于所加的細(xì)胞密度乘以液體吸收腔室的體積。通過調(diào)節(jié)液體吸收腔室的體積即可以得到在細(xì)胞培養(yǎng)腔室的不同細(xì)胞密度。細(xì)胞密度試驗數(shù)值和預(yù)期布置的理論數(shù)值的比較如圖3 (細(xì)胞布置腔室的面積相對于液體吸收腔室較小，估算時忽略)。試驗數(shù)值的方差分別為I. 06458,2. 977,2. 89756,3. 38071。實施例5步驟1)、3)同實施例4，步驟2)中抽真空的時間為40min，達(dá)到真空度lOOPa。實施例6步驟1)、3)同實施例4，步驟2)中抽真空的時間為20min，達(dá)到真空度5Pa。以上的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種可布置不同細(xì)胞密度的微流控芯片，其由多個細(xì)胞密度布置單元組成，每個細(xì)胞密度布置単元包括連接通道、細(xì)胞布置腔室、液體吸收腔室、柵欄通道，所述連接通道與細(xì)胞布置腔室連接，所述柵欄通道連接細(xì)胞布置腔室和液體吸收腔室。
2.如權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述柵欄通道的高度和/或?qū)挾葹镺.5-10 μ m。
3.如權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞布置腔室的面積為 2.5 X IO3-I X IO5 μ m2，細(xì)胞布置腔室的高度為ト40 μ m。
4.如權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述液體吸收腔室的面積為I X IO4-I X IO7 μ m2，其高度為 20-200 μ m。
5.如權(quán)利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述細(xì)胞密度布置単元有1-100個。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的微流控芯片制備及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用的方法，其特征在于，包括步驟 1)用計算機(jī)輔助設(shè)計的方法繪制微流控芯片圖形，將繪制的圖形打印在膠片或光學(xué)掩膜上，套刻在涂有光刻膠的硅片上制成模具，然后用聚ニ甲基硅氧烷在模具上復(fù)制微流控芯片圖形，加熱固化，切下后使用； 2)將所述微流控芯片固定于細(xì)胞培養(yǎng)裝置上，然后使微流控芯片處于真空狀態(tài)； 3)將含有細(xì)胞的溶液加在所述連接通道周圍，含有細(xì)胞的溶液被吸入微流控芯片內(nèi)部。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，還包括當(dāng)含有細(xì)胞的溶液進(jìn)入微流控芯片內(nèi)部后，將微流控芯片外部的殘留的含有細(xì)胞的溶液更替的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述溶液更替是先去除殘留的溶液再換成不含有細(xì)胞的溶液，
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟3)還包括覆蓋所述細(xì)胞培養(yǎng)裝置的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可布置不同細(xì)胞密度的微流控芯片，其由多個細(xì)胞密度布置單元組成，每個細(xì)胞密度布置單元包括連接通道、細(xì)胞布置腔室、液體吸收腔室、柵欄通道，所述連接通道與細(xì)胞布置腔室連接，所述柵欄通道連接細(xì)胞布置腔室和液體吸收腔室。本發(fā)明提出的裝置可以實現(xiàn)向體系內(nèi)加入相同密度的細(xì)胞溶液，在細(xì)胞腔室得到自動布置的不同密度的細(xì)胞群落，數(shù)量范圍從單細(xì)胞、數(shù)個細(xì)胞到數(shù)十個細(xì)胞。并且，細(xì)胞在本微流控芯片上處在相對密閉的腔室中，裝置外的液體流動并不會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。另外，該裝置儲存的細(xì)胞培養(yǎng)液較多，可以為細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)，適用于長期培養(yǎng)和觀察。
文檔編號C12M3/00GK102796667SQ20121029960
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者羅春雄, 楊薇, 李昭君, 康顯階 申請人:北京大學(xué)