專利名稱：一株醋桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是微生物和果醋釀造技術(shù)，特別是一株醋桿菌及其在沙棘果醋生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在果醋釀造中，醋酸菌是發(fā)酵的原動力，要取得發(fā)酵的高效率，就要有優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。當前我國果醋廠家使用的菌種都是食醋菌種，其產(chǎn)酸能力，產(chǎn)酯能力都有待提高，其發(fā)酵產(chǎn)生的果醋風味一般也不佳。因此，需選育優(yōu)良的果醋專用菌種，而有關(guān)果醋專用醋酸菌的研究報道不多，并且絕大多數(shù)都是以食醋醪液為菌源，進行分離篩選，或直接將食醋菌種ASl. 41 (A. rancens L.)惡臭醋酸桿菌渾池變種和滬釀I. 01醋酸桿菌Cl Iovaniense L.)進行高酸馴化，誘變選育，轉(zhuǎn)而將它們直接應(yīng)用在果醋釀造的生產(chǎn)過程中。目前尚無沙棘果醋發(fā)酵的優(yōu)良醋酸菌，由于沙棘果酒酸度較高，在以沙棘果酒為原料進行的果醋發(fā)酵中，目前的ASl. 41和滬釀I. 01，存在著發(fā)酵不徹底，醋酸轉(zhuǎn)化率低、容易發(fā)生醋酸過氧化反應(yīng)等缺點。因此，在沙棘果醋生產(chǎn)過程中，只有重點解決優(yōu)良醋酸菌的選育、最佳發(fā)酵工藝參數(shù)的確定等技術(shù)問題，才能從根本上解決醋酸轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差的問題。這無疑會全面推動沙棘果醋深加工產(chǎn)品的開發(fā)，提高沙棘果醋及果醋飲料的生產(chǎn)水平，為沙棘果醋企業(yè)的生產(chǎn)提供巨大的原動力，會帶動和提升沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟效益、社會效益顯著，具有廣闊的市場前景和發(fā)展?jié)摿Α?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株醋桿菌，這株菌能有效適應(yīng)沙棘果醋發(fā)酵，用于克服目前果醋釀造中常用的ASl. 41和滬釀I. 01在沙棘醋發(fā)酵中醋酸轉(zhuǎn)化率低、容易發(fā)生醋酸過氧化反應(yīng)的缺陷，醋桿菌deioAacier sp. SJA-I)已于2009年10年20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3347。醋桿菌Uce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的分離源為自然發(fā)酵的沙棘醋醪；該菌在分離培養(yǎng)基(酵母膏1%，葡萄糖1%，CaC032%，瓊脂2%，無水乙醇4%(v/v)，pH5. 5)上生長良好，最適生長溫度在30°C 34°C ;菌落形態(tài)規(guī)則，呈圓形突起，顏色為乳白色，表面有光澤，平板培養(yǎng)5d，菌落直徑在O. Γ0. 2mm，透明圈直徑O. 5^1. Ocm ;革蘭氏染色呈陰性，菌體大小為(O. 6 1· O) X (I. 0" . 8) μ m,短桿狀，無芽孢；醋桿菌(JceioAaciersp. SJA-1) CGMCC No. 3347的個體形態(tài)特征及革蘭氏染色結(jié)果見說明書附圖I、圖2。使用Blast 對醋桿菌(JceioAacier sp. SJA-I )CGMCC No. 3347 的 16S rDNA基因序列，和 GenBank中已登錄細菌進行同源性比對，鑒定為醋桿菌Xceio如cier sp.。醋桿菌
sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的系統(tǒng)進化樹見說明書附圖3。本發(fā)明的另一個目的是將上述醋桿菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347，用于以沙棘酒為原料的沙棘果醋的制備，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)沙棘果醋的方法。
具體的應(yīng)用方法將醋桿菌Uce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347接種至下述種子培養(yǎng)基中葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5. O ;在接種量10%，裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，于32°C下培養(yǎng)24h ;然后以7°/Γ Ο%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度59T7% (vol，20°C)，初始pH3. 5^4. 5，裝液量 75mL/500mL 125mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速 9(Tl50r/min，于 30 34°C下發(fā)酵5d 6d。本發(fā)明具有的積極效果本發(fā)明中的醋桿菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347的分離源為自然發(fā)酵的沙棘醋醪，經(jīng)培養(yǎng)、篩選、優(yōu)化后分離得到的全新菌株，安全性優(yōu)越；該菌株能充分適應(yīng)沙棘酒較高的酸度，發(fā)酵速度快，醋酸轉(zhuǎn)化率高，不容易發(fā)生醋酸過氧化反應(yīng)。用該醋桿菌生產(chǎn)的沙棘果醋，殘?zhí)堑?，酸度高，果香濃郁，酸味突出，具有獨特的沙棘果醋風格。



圖I 為醋桿菌 Uce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347 個體形態(tài)特征(X400)； 圖2為醋桿菌Mce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的革蘭氏染色結(jié)果(X 400)； 圖3為醋桿菌Mce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的系統(tǒng)進化樹。保藏信息
菌株名稱醋桿菌 deioAacier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347 ；
保藏日期2009年10年20日；
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所菌種保藏中
心；
保藏編號CGMCC No. 3347。
具體實施例方式菌株名稱醋桿菌Uce ο如ciersp. SJA_1)CGMCC No. 3347，已經(jīng)于 2009 年 10 年20日在位于中國北京市的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，保藏號為CGMCC No. 3347。下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述。在下面的實施例中，所用的菌種均為醋桿菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347，實施例中所用的不同培養(yǎng)基配方如下
基礎(chǔ)培養(yǎng)基酵母膏1%，葡萄糖I %，pH4. 5，蒸餾水100mL。增殖培養(yǎng)基6°Bx的麥芽汁97mL，酵母膏l(xiāng)g，葡萄糖lg，KH2P04 0. 5g，pH5. 5，95%無水乙醇3mL。分離培養(yǎng)基酵母膏1%，葡萄糖1%，CaC032%,瓊脂2%，無水乙醇4mL，蒸餾水96mL。種子培養(yǎng)基葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，無水乙醇3mL，K2HPO4
0.18%, pH 5. 0，蒸餾水 97mL。斜面培養(yǎng)基酵母膏1%，葡萄糖1%，CaCO3L 5%，瓊脂2%，pH5. 5，無水乙醇4mL，蒸餾水 96mL。
斜面保藏培養(yǎng)基；酵母膏1%，葡萄糖l%，CaC03l%，瓊脂I. 8%，pH4. 5，無水乙醇3mL，蒸懼水97mL。產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4. 5,無水乙醇6mL,蒸懼水94mL。實施例I :醋桿菌deioAacier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的分離篩選與鑒定
I.菌株的分離篩選
(I)菌株分離
取IOg室溫下經(jīng)過自然酒精發(fā)酵、自然醋酸發(fā)酵后的混勻沙棘醋醪液樣品，放入裝有IOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，加入6%的無水乙醇，在120r/min，30°C的電熱氣浴搖床中增殖培養(yǎng)，每天補加1%的無水乙醇，取發(fā)酵液稀釋到10_5，10_6，10_7濃度，涂布于平板分離培養(yǎng)基上，連涂5d，每一稀釋度涂布3個平板，每個平板用O. ImL稀釋液，涂好后30°C倒置培養(yǎng)48h，挑取鈣溶解圈較大，菌落豐富，具有生長優(yōu)勢的單菌落進行純化培養(yǎng)，然后將純化后的菌株接于斜面保藏培養(yǎng)基中，編號，在30°C下培養(yǎng)24h后保藏于4°C冰箱中。(2)產(chǎn)酸定性試驗
將上述斜面菌株分別接種于產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基中，于30°C, 120r/min電熱氣浴搖床恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，取離心除去菌體的培養(yǎng)液5mL，用O. lmol/L的NaOH中和，將中和液煮沸，加入5%的氯化鐵溶液2 3滴，形成紅褐色沉淀者為產(chǎn)醋酸細菌。(3)產(chǎn)酸定量復(fù)篩試驗
取選出的菌株的斜面菌體兩環(huán)，分別接入液體種子培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱內(nèi)活化24h，再按10%的接種量轉(zhuǎn)入接種到裝有IOOmL產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于30°C、轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6d，采用堿式滴定法測定產(chǎn)酸量(以醋酸計)。每個處理設(shè)3個平行樣，取平均值進行比較，選出產(chǎn)酸量較大的菌株。(4)耐底酸性能試驗
取初選菌株的斜面菌體兩環(huán)接入含3%無水乙醇的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱內(nèi)活化24h，按10%的接種量接入裝有IOOmL底酸(乙酸)濃度分別為0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L的產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于30°C、轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)6d，測定其產(chǎn)酸量，選出耐底酸性能較強的菌株做進一步試驗。(5)遺傳穩(wěn)定性試驗
將選出的菌株在斜面上傳代10次，每代均在平板上培養(yǎng)，觀察每代的菌落形態(tài)和個體特征。同時，每代均接入產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，在相同的條件下培養(yǎng)，測每一代的產(chǎn)酸情況，判斷菌株遺傳性能的穩(wěn)定性。由上述分離篩選試驗，可以得出醋桿菌SJA-I的各方面性能優(yōu)于對照菌株ASl. 41和滬釀1.01。2.菌株的分子生物學鑒定
對SJA-I的16S rDNA部分基因序列的測定及對比分析,鑒定為醋桿菌Jceio如ciersp.，經(jīng)微生物保藏程序的鑒定和保藏，將其分類命名為醋桿菌JceioAacier sp. SJA-1,其保藏登記號為CGMCC No. 3347。醋桿菌JceioAacier 5/7. SJA-I的特征該菌株在分離培養(yǎng)基上生長良好,最適生長溫度在30°C 34°C ;菌落形態(tài)規(guī)則，呈圓形突起，顏色為乳白色，表面有光澤，平板培養(yǎng)5d，菌落直徑在O. Γ0. 2mm，透明圈直徑O. 5^1. Ocm ;革蘭氏染色呈陰性，菌體大小為(O. 6 I. O) X (I. (Tl. 8) μ m，短桿狀，無芽孢。實施例2 :醋桿菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋發(fā)酵中的應(yīng)用
將醋桿菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接種至種子培養(yǎng)基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接種量10%,裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，于32°C下培養(yǎng)24h ;然后以7%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度5% (Vol，20°C)，初始pH4. 5，裝液量75mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速90r/min，于30°C下發(fā)酵6d。在此條件下，醋酸產(chǎn)量可達4. 82g/100mL。該果醋酸味適宜，清香濃郁，果香與醋香和諧統(tǒng)一，具有鮮明的沙棘果醋特點。實施例3 :醋桿菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋發(fā)酵中的 應(yīng)用
將醋桿菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接種至種子培養(yǎng)基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接種量10%,裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，于32°C下培養(yǎng)24h ;然后以8%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度6% (VOl，20°C)，初始pH3. 5，裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速125r/min，于32°C下發(fā)酵5d。在此條件下，醋酸產(chǎn)量可達5. 67g/100mL。該果醋酸味突出，香氣濃郁協(xié)調(diào)，具有獨特的沙棘果醋風味。實施例4 :醋桿菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋發(fā)酵中的應(yīng)用
將醋桿菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接種至種子培養(yǎng)基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接種量10%,裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，于32°C下培養(yǎng)24h ;然后以9%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度6% (VOl，20°C)，初始pH4. 0，裝液量125mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速130r/min，于34°C下發(fā)酵6d。在此條件下，醋酸產(chǎn)量可達5. 88g/100mL。該果醋酸味突出，果香濃郁，具有獨特的沙棘果醋風味。實施例5 :醋桿菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋發(fā)酵中的應(yīng)用
將醋桿菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接種至種子培養(yǎng)基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接種量10%,裝液量100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min下，于32°C下培養(yǎng)24h ;然后以10%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度7% (VOl，20°C)，初始pH4. 0，裝液量125mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，于33°C下發(fā)酵5d。在此條件下，醋酸產(chǎn)量可達6. 83g/100mL。該果醋酸味突出，果香濃郁，具有獨特的沙棘果醋風格。
權(quán)利要求
1.一株醋桿菌sp. SJA_1),其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 3347。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的醋桿菌Mceio如ctersp. SJA-1) CGMCC No. 3347，其特征在于所述的醋桿菌Uceio如cter sp. SJA-I )CGMCC No. 3347，該菌株在分離培養(yǎng)基上生長良好，最適生長溫度在30°C 34°C;菌落形態(tài)規(guī)則，呈圓形突起，顏色為乳白色，表面有光澤，平板培養(yǎng)5d，菌落直徑在O. Γ0. 2_，透明圈直徑O. 5^1. Ocm ;革蘭氏染色呈陰性，菌體大小為(O. 6 I. O) X (I. (Tl. 8) μ m，短桿狀，無芽孢。
3.一種權(quán)利要求I所述的醋桿菌sp. SJA-I) CGMCC No. 3347,其特征在于該株醋桿菌用于以沙棘酒為原料的沙棘果醋的生產(chǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的醋桿菌Mceio如ctersp. SJA-I) CGMCC No. 3347，在發(fā)酵生產(chǎn)沙棘果醋中的應(yīng)用，其特征在于具體方法為將醋桿菌Uceio如cter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347接種至下述種子培養(yǎng)基中葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，pH5. O ;在接種量 10%，裝液量 100mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速 150r/min 下，于 32°C下培養(yǎng)24h ;然后以7°/Γ Ο%的接種量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度59T7% (vol,20 °C),初始 pH3. 5 4. 5，裝液量 75mL/500mL 125mL/500mL，搖床轉(zhuǎn)速 90 150r/min，于30 34°C下發(fā)酵5cT6d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株醋桿菌(Acetobactersp.SJA-1)CGMCCNo.3347及其在沙棘果醋生產(chǎn)中的應(yīng)用，涉及的是一株醋桿菌及利用該菌生產(chǎn)沙棘果醋的方法。該菌株分離源為自然發(fā)酵的沙棘醋醪，用于以沙棘酒為原料的沙棘果醋生產(chǎn)。菌落形態(tài)規(guī)則，呈圓形突起，乳白色，表面有光澤，平板培養(yǎng)5d，菌落直徑0.1~0.2mm，透明圈直徑0.5~1.0cm。革蘭氏染色呈陰性，菌體大小為(0.6~1.0)×(1.0~1.8)μm，短桿狀，無芽孢。經(jīng)分離、篩選后得到的該菌株，能充分適應(yīng)沙棘酒較高的酸度，發(fā)酵速度快，醋酸轉(zhuǎn)化率高，不容易發(fā)生醋酸過氧化反應(yīng)。用該醋桿菌生產(chǎn)的沙棘果醋，酸味突出，果香濃郁，具有獨特的沙棘果醋風格。
文檔編號C12J1/04GK102925380SQ20121030617
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者牛廣財, 朱丹, 魏文毅, 左鋒, 王憲青 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學, 牛廣財