一種固定化谷胱甘肽合成酶及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固定化谷胱甘肽合成酶及其制備和應(yīng)用。具體地，將谷胱甘肽合成酶與載體進(jìn)行固定化之后，得到穩(wěn)定性和反應(yīng)性大大提高的固定化谷胱甘肽合成酶；特別地，固定化載體與谷胱甘肽合成酶之間較長的連接元件可以獲得特別好的固定化效果。本發(fā)明的固定化谷胱甘肽合成酶半衰期長，使得單位酶的生產(chǎn)力得到有效提高。用本發(fā)明的固定化谷胱甘肽合成酶作為GSH生物合成系統(tǒng)，生產(chǎn)過程簡化、生產(chǎn)效率提高，簡化了提純工藝。
【專利說明】一種固定化谷胱甘肽合成酶及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；具體地，本發(fā)明涉及一種固定化谷胱甘肽合成酶及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽(簡稱GSH)，又名Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是一種廣泛存在于動物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的一種小分子巰基化合物，具有維持胞內(nèi)氧化還原平衡的功能。GSH重要的生理功能使其在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等方面具有廣泛的應(yīng)用價值[MeisterA and Anderson M.E., Glutathione.Annu Rev Biochem, 1983.52:p.711-760; Wuj G.,.Fang Y.Z, Yang S., Lupton J.R., and Turner N.D.Glutathione Metabolism and ItsImplications for Health.J.Nutr.，2004.134:p.489-492.] 0
[0003]目前GSH的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法和生物法。雖然化學(xué)合成法和從富含胞內(nèi)GSH的酵母細(xì)胞中提取GSH已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但是兩者都存在一定的不足之處。化學(xué)合成法較早應(yīng)用于GSH的生產(chǎn)，但具有復(fù)雜、耗時等不足[吳堅平，林建平，岑沛霖.谷胱甘肽的生物合成.1999.]。GSH在生物體內(nèi)是由Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )在ATP存在的條件下，催化L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)合成。生物法生產(chǎn)谷胱甘肽主要包括酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法兩種方式，兩者均通過利用細(xì)胞中的高活性酶系在溫和的條件下實(shí)現(xiàn)GSH的合成；其最主要的區(qū)別則在于酶轉(zhuǎn)化法需提供ATP，而發(fā)酵法則可利用細(xì)胞自身代謝，無需額外提供ATP。目前發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的產(chǎn)量不高，且分離純化工藝復(fù)雜，原料成本和能耗等成本都比較高；相對于發(fā)酵法，酶法反應(yīng)時間短，反應(yīng)簡 單，能夠達(dá)到更高濃度和純化收率等優(yōu)點(diǎn)，是規(guī)?；a(chǎn)GSH工藝研究的方向。
[0004]酶法合成GSH，高活性的谷胱甘肽合成酶是獲得高濃度產(chǎn)物的關(guān)鍵之一。在已報道的谷胱甘肽合成酶中，除了上述常見的GSH I和GSH II，還發(fā)現(xiàn)了具有高活性的谷胱甘肽雙功能合成酶，例如來源于無乳鏈球菌的谷胱甘肽雙功能合成酶，以及來自嗜熱鏈球菌的谷胱甘肽雙功能酶，嗜熱鏈球菌的谷胱甘肽雙功能酶12h即可產(chǎn)生10.4g/L GSH, L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%。這些酶的發(fā)現(xiàn)，為酶法合成GSH的規(guī)模化生產(chǎn)提供了可能。
[0005]GSH的合成伴隨著ATP的消耗(合成IM GSH需消耗2M ATP)，由于ATP價格昂貴，直接添加ATP顯著增加了酶法合成GSH的成本，并且高濃度的ATP及其代謝產(chǎn)物ADP的存在還會強(qiáng)烈抑制GSH合成酶的活性，因此目前酶法生產(chǎn)GSH都采用ATP再生，主要采用酵母細(xì)胞再生的方式。目前酵母細(xì)胞再生ATP已發(fā)展到采用固定化酵母細(xì)胞再生的技術(shù)水平，從而實(shí)現(xiàn)再生系統(tǒng)的重復(fù)使用。這就為GSH合成酶的重復(fù)利用提出了相應(yīng)的要求。
[0006]固定化酶(immobilized enzyme)是一種將酶固定于載體上的技術(shù)。一般地,經(jīng)過固定化的酶本身還是溶于水的，只是用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在其中，使得酶的流動性降低。目前固定后的酶雖然穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，便于運(yùn)輸和貯存，但是活性降低(一般僅為游離酶的30%以下，甚至于僅為10%以下)。
[0007]目前也存在利用固定化細(xì)胞制備GSH的工藝，但是由于細(xì)胞本身需要能量的消耗，以及生長周期的限制，因此不能長時間的反復(fù)利用，酶活也較低。此外，在體外利用L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)合成對酶的活性提出了很高的要求。由于上述原因，目前本領(lǐng)域還沒有一種固定化谷胱甘肽合成酶，因此迫切需要突破酶法生產(chǎn)GSH的瓶頸，開發(fā)相應(yīng)的固定化酶用于工業(yè)生產(chǎn)GSH。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是提供一種固定化谷胱甘肽合成酶及其制備和應(yīng)用。 [0009]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種固定化的谷胱甘肽合成酶，所述的固定化的谷胱甘肽合成酶包括:
[0010](I)固定化載體；和
[0011](2)固定于所述載體的谷胱甘肽合成酶。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶通過選自下組的方式固定于固定化載體:吸附、包埋、共價結(jié)合、交聯(lián)、或其組合。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的固定化載體與所述的谷胱甘肽合成酶的質(zhì)量比例為:I: 1—100:1 (較佳地為 10:1 — 50:1)。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的固定化載體包括固定化載體的基質(zhì)，以及與所述基質(zhì)連接的連接元件。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的固定化載體的基質(zhì)為微球或高分子聚合物。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述固定化的谷胱甘肽合成酶的結(jié)構(gòu)如下:
[0017]Z- (L-E) n
[0018]式中，
[0019]Z表不固定化載體基質(zhì)；
[0020]E表示谷胱甘肽合成酶；
[0021 ] L表示位于E和Z之間的連接元件；
[0022]n為大于或等于I的正整數(shù)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，n為選自1-100000的正整數(shù)。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述連接元件的主鏈具有4-50個選自C、N或0的原子。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述連接元件的主鏈具有5-30個(優(yōu)選4-20個，優(yōu)選4_10個)選自C、N或0的原子。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述連接元件的主鏈由或基本上由以下基團(tuán)構(gòu)成:-CH2-、-C(R)H-、-CO-、-NH-> -NR-> -0-,其中R表不支鏈基團(tuán)，如0H、氛基、C1-C4烷基、鹵素。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述固定化的谷胱甘肽合成酶具有以下特性:
[0028](a)酶活性> 0.5U/g固定化的谷胱甘肽合成酶，優(yōu)選> 2U/g固定化的谷胱甘肽合成酶；
[0029](b)半衰期特性≥10天，優(yōu)選≥15天，更優(yōu)選≥20天。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的固定化載體為有機(jī)載體。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的有機(jī)載體選自下組:酯基固定化載體、氨基固定化載體、羧基固定化載體、氰基固定化載體、或其組合。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的有機(jī)載體為氨基固定化載體或環(huán)氧基固定化載體。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶通過以共價結(jié)合的方式固定于氨基固定化載體。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶通過以共價結(jié)合的方式固定于環(huán)氧基固定化載體。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的氨基固定化載體選自下組:SEPABEADSUEC系列的EC-HA 或 EC-EA、Seplite LX-1000HA、或 Relizyme? 系列的 HA403 或 EA403 ;優(yōu)選 EC-HA 和HA403。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)氧基固定化載體選自下組:SEPABEADSWEC系列的EC-EP 或 EC-HFA、S印Iite LX-1000EP、或 Relizyme? 系列的 EP403 或 HFA403 ;優(yōu)選 EC-HFA和 HFA403。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶選自下組:Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )、GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )、或谷胱甘肽雙功能合成酶、或其組合。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶為Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )與 GSH 合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的組合。
[0039]在另一優(yōu)選例中，Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )與GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II)的比例為 1:1~5:1。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II )來源于大腸桿菌(Escherichia coli)。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶為谷胱甘肽雙功能合成酶。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽雙功能合成酶為來源于無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)或嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的谷胱甘妝雙功能合成酶。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的谷胱甘肽合成酶為谷胱甘肽雙功能合成酶與Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )的組合；或谷胱甘肽合成酶為谷胱甘肽雙功能合成酶與GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的組合。在另一優(yōu)選例中，谷胱甘肽雙功能合成酶與Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )的比例為1:1~1:3。
[0044]在另一優(yōu)選例中，谷胱甘肽雙功能合成酶與GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )的比例為1:1~4:1。
[0045]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶的方法，包括步驟:將谷胱 甘肽合成酶固定于所述的固定化載體上，從而形成固定化的谷胱甘肽合成酶。
[0046]在另一優(yōu)選例中，將谷胱甘肽合成酶固定于所述的載體上之前，還包括對載體進(jìn)行活化的步驟。
[0047]在本發(fā)明的第三方面，提供了第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶的用途，它被用于生產(chǎn)谷胱甘肽GSH。
[0048]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)谷胱甘肽GSH的方法，包括步驟:[0049](I)將第一方面所述固定化的谷胱甘肽合成酶與反應(yīng)底物接觸，獲得含有GSH的反應(yīng)混合液；
[0050](2)從⑴中的反應(yīng)混合液中分離GSH。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)底物包括甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸。
[0052]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】[0053]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0054]圖1為固定化載體的結(jié)構(gòu)示意圖；A為長側(cè)鏈載體EC_HFA、B為長側(cè)鏈載體EC-HA，C為短側(cè)鏈載體EC-EP。
[0055]圖2為固定化酶EC-HA-SaGSH的穩(wěn)定性曲線圖。
[0056]圖3為固定化酶EC-EP-STH的穩(wěn)定性曲線圖。
[0057]圖4為谷胱甘肽雙功能酶(Sa-GSH)與不同固定化載體固定化的比較。
[0058]圖5為谷胱甘肽雙功能酶(Sa-GSH)溶液酶的穩(wěn)定性曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，將谷胱甘肽合成酶與載體進(jìn)行固定化之后，得到穩(wěn)定性大大提高的固定化谷胱甘肽合成酶；特別地，固定化載體與谷胱甘肽合成酶之間較長的連接元件可以獲得特別好的固定化效果。本發(fā)明的固定化谷胱甘肽合成酶半衰期長，使得單位酶的生產(chǎn)力得到有效提高。用本發(fā)明的固定化谷胱甘肽合成酶作為GSH生物合成系統(tǒng)，生產(chǎn)過程簡化、生產(chǎn)效率提高，簡化了提純工藝。
[0060]GSH
[0061]如本文所用，術(shù)語“GSH”、或“谷胱甘肽”、或“ Y -L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸”，都可以互換使用。GSH是一種廣泛存在于動物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的一種小分子巰基化合物，具有維持胞內(nèi)氧化還原平衡的功能。
[0062]GSH的主要生理功能是清除自由基、抗氧化、抗衰老等。機(jī)體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的許多自由基會損傷細(xì)胞膜，侵襲生命大分子，促進(jìn)機(jī)體衰老，并誘發(fā)腫瘤或動脈粥樣硬化的產(chǎn)生，GSH可消除自由基，能起到強(qiáng)有力的保護(hù)作用。GSH的結(jié)構(gòu)中含有一個活潑的巰基-SH易被氧化脫氧，這一特異結(jié)構(gòu)便使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑。GSH不僅清除人體自由基，還可以提高人體免疫力，增進(jìn)血球制造保護(hù)物質(zhì)的功能，保護(hù)物質(zhì)指能保護(hù)身體免受感染的物質(zhì)，降低體內(nèi)發(fā)炎物質(zhì)的總含量。
[0063]谷胱甘肽合成酶
[0064]如本文所用，術(shù)語“谷胱甘肽合成酶”、“GSH合成酶”或“ Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶”都可以互換使用，都是指合成GSH的酶蛋白。
[0065]谷胱甘肽合成酶主要包括單功能酶和雙功能酶。在生物體內(nèi)，GSH是由Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2, GSH I )和GSH合成酶(EC6.3.2.3, GSH II )在ATP存在的條件下，催化L-谷氨酸，L-半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)合成的。
[0066]除了 GSH I和GSH II，高活性的谷胱甘肽雙功能合成酶，包括(但不限于):來源于無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的谷胱甘肽雙功能合成酶，以及來自嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)的谷胱甘肽雙功能酶等。
[0067]在一個優(yōu)選例中，生產(chǎn)谷胱甘肽雙功能合成酶的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)包括(但不限于):糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、瘤胃甲燒短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
[0068]在一個優(yōu)選例中，生產(chǎn)谷胱甘肽雙功能合成酶的嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)包括(但不限于):幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus plutonius)、瘤胃甲燒短桿菌(Methanobrevibacter ruminantium)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)或單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。
[0069]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)方法制備谷胱甘肽合成酶，如市售購買、從菌株中分離、全化學(xué)合成、或者通過分子生物學(xué)體外合成。
[0070]從菌株(優(yōu)選無乳鏈球菌和嗜熱鏈球菌)中分離谷胱甘肽合成酶以及所述菌株的培養(yǎng)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的，除了生產(chǎn)菌不同之外，其他條件與現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵生產(chǎn)以及提純蛋白的方法基本相同。本發(fā)明菌株的發(fā)酵條件與一般的菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培 養(yǎng)基中，在PH5.0-9.0 (較佳地pH7.0-7.5)和20-45°C (較佳地25-400C )發(fā)酵。在本發(fā)明中，“菌絲體”、“發(fā)酵液”或“培養(yǎng)液”可通過在適合生長的條件下培養(yǎng)本發(fā)明菌株，使其生長至一定的菌絲體濃度來獲得。用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源沒有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)來選擇合適的碳源、氮源和其他營養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黃豆餅粉、肉膏、蛋白粉、麥皮、米糖、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其他有機(jī)物或無機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基中還可適當(dāng)加入一些無機(jī)鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等)、硫酸錳、硫酸銨、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等對本菌株進(jìn)行斜面固體培養(yǎng)并在4°C環(huán)境下進(jìn)行初步保藏。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng)基配方。
[0071]通過分子生物學(xué)體外合成和分離谷胱甘肽合成酶是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明以對不同來源的谷胱甘肽合成酶基因進(jìn)行基因工程菌構(gòu)建，利用不同的固定化載體進(jìn)行固定化，或?qū)﹄p酶進(jìn)行共固定。
[0072]根據(jù)谷胱甘肽合成酶基因序列，本【技術(shù)領(lǐng)域】人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過PCR方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。
[0073]包含編碼谷胱甘肽合成酶基因序列可以表達(dá)調(diào)控序列可操作性相連。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0074]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細(xì)胞來選擇合適的表達(dá)載體，用于表達(dá)谷胱甘肽合成酶。根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將谷胱甘肽合成酶基因序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得重組表達(dá)載體。
[0075]將所述編碼谷胱甘肽合成酶基因序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見Olander RM Dev BiolStand 1996;86:338?？赏ㄟ^離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘洛,收集清液?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定。
[0076]可將上述制備獲得的酶蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。
[0077]固定化載體
[0078]本發(fā)明涉及一種特別適合用于固定谷胱甘肽合成酶的固定化載體，所述的固定化載體包括固定化載體的基質(zhì)，以及與所述基質(zhì)連接的連接元件。
[0079]用于固定谷胱甘肽合成酶的載體優(yōu)選有機(jī)載體。所述的有機(jī)載體選自下組:酯基固定化載體、氨基固定化載體、羧基固定化載體、氰基固定化載體。
`[0080]優(yōu)選地，所述連接元件的主鏈具有4-50個選自C、N或0的原子。
[0081]在另一優(yōu)選例中，所述連接元件的主鏈具有5-30個選自C、N或0的原子。
[0082]在另一優(yōu)選例中，所述連接元件的主鏈由或基本上由以下基團(tuán)構(gòu)成:-CH2-、-C(R)H-、-CO-、-NH-> -NR-> -0-,其中R表不支鏈基團(tuán)，如0H、氛基、C1-C4烷基、鹵素。
[0083]在本發(fā)明中，所述的酯基固定化載體是指與谷胱甘肽合成酶固定的活性基團(tuán)為酯基。
[0084]在本發(fā)明中，所述的氨基固定化載體是指與谷胱甘肽合成酶固定的活性基團(tuán)為氨基。
[0085]在本發(fā)明中，所述的氰基固定化載體是指與谷胱甘肽合成酶固定的活性基團(tuán)為氰基。
[0086]在本發(fā)明中，所述的羧基固定化載體是指與谷胱甘肽合成酶固定的活性基團(tuán)為羧基。
[0087]有機(jī)載體優(yōu)選氨基固定化載體或環(huán)氧基固定化載體。所述的氨基固定化載體選自下組:SEPABEADSR EC 系列的 EC-HA 或 EC-EA、Seplite LX-1000HA、或 Relizyme? 系列的HA403或EA403。所述的環(huán)氧基固定化載體選自下組:SEPABEADSR EC系列的EC-EP或 EC-HFA、Seplite LX-1000EP、或 Relizyme? 系列的 EP403 或 HFA403。[0088]本發(fā)明特別優(yōu)選SEP ABEADS?EC系列的載體。此類載體的基質(zhì)為高度多孔聚甲基丙烯酸球狀，具有穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且在高濃度溶液和通常溶劑中的膨脹率低，具有優(yōu)異的機(jī)械滲透穩(wěn)定性。SEPABEADS?EC系列的幾種載體的結(jié)構(gòu)見表1。
[0089]表1
【權(quán)利要求】
1.一種固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述的固定化的谷胱甘肽合成酶包括: (1)固定化載體；和 (2)固定于所述載體的谷胱甘肽合成酶。
2.如權(quán)利要求1所述的固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述的固定化載體包括固定化載體的基質(zhì)，以及與所述基質(zhì)連接的連接元件。
3.如權(quán)利要求2所述的固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述固定化的谷胱甘肽合成酶的結(jié)構(gòu)如下:
Z_(L-E)n
式中， Z表不固定化載體基質(zhì)； E表不谷胱甘肽合成酶； L表示位于E和Z之間的連接元件； n為大于或等于I的正整數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述連接元件的主鏈具有4-50個選自C、N或O的原子。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述固定化的谷胱甘肽合成酶具有以下特性: (a)酶活性>0.5U/g固定化的谷胱甘肽合成酶，優(yōu)選> 2U/g固定化的谷胱甘肽合成酶； (b)半衰期特性>10天，優(yōu)選> 15天，更優(yōu)選> 20天。
6.如權(quán)利要求1所述的固定化的谷胱甘肽合成酶，其特征在于，所述的谷胱甘肽合成酶選自下組:Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC6.3.2.2，GSH I )、GSH合成酶(EC6.3.2.3，GSH II )、或谷胱甘肽雙功能合成酶、或其組合。
7.一種制備權(quán)利要求1所述固定化的谷胱甘肽合成酶的方法，其特征在于，包括步驟:將谷胱甘肽合成酶固定于所述的固定化載體上，從而形成固定化的谷胱甘肽合成酶。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將谷胱甘肽合成酶固定于所述的載體上之前，還包括對載體進(jìn)行活化的步驟。
9.權(quán)利要求1所述固定化的谷胱甘肽合成酶的用途，其特征在于，它被用于生產(chǎn)谷胱甘肽GSH。
10.一種生產(chǎn)谷胱甘肽GSH的方法，其特征在于，包括步驟: (1)將權(quán)利要求1所述固定化的谷胱甘肽合成酶與反應(yīng)底物接觸，獲得含有GSH的反應(yīng)混合液； (2)從(I)中的反應(yīng)混合液中分離GSH。
【文檔編號】C12P21/02GK103627691SQ201210306568
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月24日
【發(fā)明者】楊晟, 陶榮盛, 洪秀娟, 沈正權(quán), 朱傅赟, 孫梁棟, 陳成, 沈青, 鄭云 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心