專利名稱：抗t-PSA單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及檢測(cè)t-PSA試劑盒的制備的制作方法
抗t-PSA單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及檢測(cè)t-PSA試劑盒的制備
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及總前列腺特異性抗原(t-PSA)單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及檢測(cè)血清中t-PSA含量的試劑盒，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。背景知識(shí)總前列腺特異抗原(Prostate specific antigen, t-PSA)是與前列腺癌相關(guān)的一種抗原，是一種由前列腺上皮細(xì)胞合成和分泌的單鏈糖蛋白，分子量34KD，由237個(gè)氨基酸殘基組成，具有絲氨酸蛋白酶活性，是診斷前列腺癌較好的腫瘤標(biāo)記物，其特異性達(dá)到85%-90%。前列腺癌是50歲以上的男性常見的癌癥，發(fā)展緩慢，隨年齡而增長(zhǎng)，在我國(guó)，隨著居民生活的日益改善、環(huán)境污染的嚴(yán)重以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率逐漸上升；在美國(guó)，已經(jīng)將t-PSA的檢測(cè)作為男性的普查指標(biāo)。t-PSA的檢測(cè)有利于前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、 監(jiān)視病情的進(jìn)展、治療效果檢測(cè)，同時(shí)t-PSA在原發(fā)性前列腺癌和繼發(fā)性前列腺癌的鑒別診斷中起著重要的作用。前列腺特異抗原是前列腺疾病價(jià)值很高的腫瘤標(biāo)志，在臨床上被廣泛應(yīng)用，t-PSA主要用在前列腺癌的診斷及分期，還可以追蹤治療效果。前列腺特異抗原并不是前列腺癌所特有的，許多前列腺肥大癥或前列腺發(fā)炎也會(huì)使t-PSA上升，因此，判斷是否患有前列腺癌十分的重要，需要做進(jìn)一步的檢查，比如做前列腺切片，以證實(shí)患有前列腺癌。目前還沒有發(fā)現(xiàn)前列腺癌晚期的治療方法，減少前列腺癌的死亡率，唯有依賴早期的診斷發(fā)現(xiàn)并給與適當(dāng)治療，從而減少前列腺癌的死亡率。目的在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PSA的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標(biāo)記，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜昂貴，其放射性元素的半衰期短，不能長(zhǎng)期保存，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，同時(shí)存在放射性污染也給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來了傷害；酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。本發(fā)明采用的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA)靈敏度比較高，可以達(dá)到10-18mol/L，快速，發(fā)光信號(hào)在幾秒鐘就能產(chǎn)生，操作方便，且不使用有害的試劑，與國(guó)內(nèi)的同類試劑相比，具有靈敏度很高，操作簡(jiǎn)便，更重要的是其需要的血清量少、檢測(cè)范圍廣、發(fā)光液持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，更能滿足臨床的需要，本發(fā)明的試劑與國(guó)外同類試劑相比，達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品水平。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抗前列腺特異性抗原單克隆抗體以及建立一種簡(jiǎn)單且具高靈敏度的檢測(cè)t-PSA的方法，并將該方法應(yīng)用于前列腺癌的檢測(cè)。以解決現(xiàn)有的單克隆抗體檢測(cè)t-PSA的靈敏度不夠或價(jià)格昂貴，不適合臨床大規(guī)模的應(yīng)用的缺點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒以及該試劑盒的制備方法。利用該試劑盒分析檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明獲得了能夠產(chǎn)生特異性識(shí)別t-PSA的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株
3-20-1與雜交瘤細(xì)胞株3-26-1，該細(xì)胞株已于2012年3月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC C201202與CCTCCC201208。此外，經(jīng)過鑒定，兩株單克隆抗體分別識(shí)別t-PSA的兩個(gè)不同表位，通過3-20-1與
3-26-1的結(jié)合建立了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法，其是一種高靈敏度及高通量的檢測(cè)系統(tǒng)。因此，本發(fā)明提供了下面所述的⑴至⑶的內(nèi)容I.抗前列腺特異性抗原的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)分別為CCTCC C201202和CCTCCC201208。2.抗前列腺特異性抗原的單克隆抗體，分別由保藏號(hào)CCTCC C201202和CCTCCC201208雜交瘤細(xì)胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為3_20_1和3_26_1。3.如權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于將Balb/c小鼠免疫3次后,在細(xì)胞融合前3天作最后一次加強(qiáng)免疫,采用ELISA法分2步進(jìn)行篩選融合細(xì)胞第一步采用間接ELISA法篩選出抗前列腺特異性抗原PSA的陽性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，選擇吸光度和靈敏度較高的陽性孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)3次后，最后篩選出2株雜交瘤細(xì)胞系。4.如權(quán)利要求2所述的抗前列腺特異性抗原單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)t-PSA，夾心法兩兩配對(duì)的抗體來源于細(xì)胞株3-20-1和3-26-1，其步驟包括(I)以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體之一包被；·
(2)加入待測(cè)樣品孵育；(3)以所述的兩兩配對(duì)的HRP標(biāo)記的另一株單克隆抗體作為二抗，加入反應(yīng)體系；(4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值；(5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高。5. 一種檢測(cè)血清中t-PSA含量的試劑盒，包括包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品；酶標(biāo)記的前列腺特異性抗原另一株單克隆抗體；上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物A液和B液以及洗滌液。6，如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被單克隆抗體，包被液是磷酸鹽緩沖液中；另一株前列腺特異性抗原單克隆抗體和辣根過氧化酶偶聯(lián)形成酶標(biāo)記抗體，采用的是改良的過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品以小牛血清為基質(zhì)，加入前列腺特異性抗原純品配置而成；發(fā)光底物A、B為HRP-Luminol發(fā)光體系。7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記抗體所用的標(biāo)記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標(biāo)記抗體最佳的工作濃度是I : 2000;包被有抗前列腺抗原抗體的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；發(fā)光液A液用硼砂7. 99g，硼酸3. 46g，魯米諾O. 28g，對(duì)碘苯酚O. 07g，加工藝用水定容至700mL，避光保存；發(fā)光底物B液由下列成分組成硼砂7. 99g,硼酸3. 46g,過氧化脲O. 07g加工藝用水定容至700mL。8.如權(quán)利要求5-7所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟(I)標(biāo)準(zhǔn)品的配制和濃度的校正將總前列腺特異性抗原t-PSA純品，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，配制一高濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成0、2. 5、5、15、45、100ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)校正。(2)包被采用O. 5mol/L，pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液與適當(dāng)濃度的前列腺特異性抗原單抗混合成抗體濃度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過夜；(3)洗板用PBS-T洗液洗板孔2次；(4)封閉 封閉液包含NaCl 8g, KCl O. 2g, Na2HP04. 12H20 2. 9g, KH2P04 0. 2g,蔗糖20. 00g,proclin300 I. 00ml,BSA 20. 00g，封閉液的 PH值為 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封閉，濕盒孵育2h ；(5)干燥去除封閉液，過夜干燥。(6)組裝為成品將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。上述的抗前列腺特異性抗原的單克隆抗體，是由下列的方法所制備，步驟包括(I)用蛋白量為50ug的前列腺特異性抗原與弗氏完全佐劑混合；經(jīng)15天后進(jìn)行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進(jìn)行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測(cè)血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強(qiáng)免疫；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合；(2)將免疫小白鼠脾細(xì)胞與小白鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 I的比例，用50% PEG作為融合劑融合；(3)用含HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的無血清培養(yǎng)基，在37°C ,5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔；(4)篩選出的特異性強(qiáng)陽性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲得單抗細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)；(5)收集培養(yǎng)上清液，親和層析法純化單克隆抗體，即為可前列腺特異性抗原單克隆抗體；(6)檢測(cè)單克隆抗體的滴度，選取較好的一株進(jìn)行標(biāo)記(HRP標(biāo)記)，并對(duì)標(biāo)記好的單克隆抗體進(jìn)行滴度測(cè)定；(7)標(biāo)記好的單克隆抗體與其他未標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，選取沒有競(jìng)爭(zhēng)的一株進(jìn)行夾心ELISA反應(yīng)，確定最佳條件。本發(fā)明的單克隆抗體可直接用于檢測(cè)樣品中的人t-PSA含量，通過大量培養(yǎng)單抗細(xì)胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明針對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室建立了一種既可以手工操作，又可以用于標(biāo)準(zhǔn)全自動(dòng)檢測(cè)儀器的檢測(cè)手段，建立了檢測(cè)人血清t-PSA的定量檢測(cè)方法。本發(fā)明的前列腺特異性抗原定量檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)可以專一的檢測(cè)出人血清中的PSA的含量，從而根據(jù)其含量的多少判斷前列腺癌病情的變化和治療效果。它具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的試劑盒，包被的抗體與酶標(biāo)記的抗體及被測(cè)樣品中的前列腺特異性抗原形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu)，所以本發(fā)明采用的是“雙抗夾心一步法”的反應(yīng)模式。利用辣根過氧化酶催化發(fā)光底物，發(fā)光底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)釋放大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可以發(fā)射出光子，利用發(fā)光儀器測(cè)量光量子的產(chǎn)額，該光量子的產(chǎn)額和樣品中的檢測(cè)無助的量成正比，由此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。試劑盒檢測(cè)方法具有靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，操作方便、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員無傷害，同時(shí)生產(chǎn)成本低，減輕了醫(yī)患雙方的負(fù)擔(dān)，因此更有利于前列腺癌臨床診斷的推廣使用。

圖I顯示的是用間接ELISA方法測(cè)血清滴度(細(xì)胞融合前)；圖2顯示的是本發(fā)明中的雜交瘤所產(chǎn)生的抗t-PSA單克隆抗體在ELISA方法中滴度測(cè)量結(jié)果； 圖3顯示的是標(biāo)記HRP的抗t-PSA單克隆抗體滴度測(cè)量結(jié)果；圖4顯示的是夾心法ELISA (S-ELISA)系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度；圖5顯示的是所制備的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品線形圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在闡述了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣是本申請(qǐng)中權(quán)利要求書中所限定的范圍。實(shí)施例I :動(dòng)物免疫選擇與所用的骨髓瘤細(xì)胞同源的8周齡左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量為IOOug的前列腺特異性抗原與弗氏完全佐劑、PBS混合，完全乳化后，IOOug每只每次，采取背部多點(diǎn)，及腋下、腹股溝免疫。免疫程序經(jīng)15天后進(jìn)行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進(jìn)行第三次相同劑量與福氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測(cè)血清滴度(見附圖I)，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強(qiáng)免疫；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。表I :第三次用t-PSA免疫之后小鼠血清中的抗體滴度
第三次免疫t-PSA后ELISA檢測(cè)小鼠血清中的抗體滴度
_±11___抗體滴度_
_#1__32000_
_#2__53000_
正常小鼠(陰性 )< 1000實(shí)施例2 :雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建I、骨髓瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)及制備(I)本發(fā)明采用的是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，倍增時(shí)間為10-12h。融合時(shí)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞在融合前應(yīng)先在培養(yǎng)基上作適應(yīng)培養(yǎng)，使細(xì)胞生長(zhǎng)到最佳的狀態(tài)(即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)；(2)將培養(yǎng)的SP2/0吸至50mL的管中，離心，棄上清，懸起，加IOmL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計(jì)數(shù)。2、脾細(xì)胞的制備(I)將小鼠放在密封袋中，充C02待其窒息死亡；(2)將小鼠消毒固定在解剖板上，在超凈工作臺(tái)中取脾，放在12mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剝掉粘連組織，研磨脾臟，直至剩白色組織為止，吸管全部吸起，再緩慢打出使組織塊粘連的管壁上，離心，棄上清，加IOmL的紅細(xì)胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培養(yǎng)基終止其反應(yīng)，離心后，棄上清，加IOmL的培養(yǎng)基，吸取少量10倍稀釋計(jì)數(shù)。 3、細(xì)胞融合加強(qiáng)免疫后3天做細(xì)胞融合。細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞I : 10混和，通過聚乙二醇(PEG)法以獲得雜交瘤細(xì)胞，命名為3-20-1和3-26-1。所獲得的雜交瘤細(xì)胞懸浮在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)12天；實(shí)施例3 :單克隆抗體的制備及篩選I、單克隆抗體的制備從實(shí)施例二中所獲得的雜交瘤細(xì)胞的孔格中回收培養(yǎng)基的上清液，選取在ELISA方法中與抗原多肽反應(yīng)的單克隆抗體。2、單克隆抗體的篩選(I)將IOOuL濃度為O. 2ug/ml的t_PSA到96孔板的每個(gè)孔格中，于4°C過夜后使
其固定于固相；(2)用150uL濃度為I %的牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)；(3)將IOOuL雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液加入到每個(gè)孔格中，于37°C反應(yīng)2小時(shí)，然后加入稀釋IOK倍的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠抗體于37°C反應(yīng)I小時(shí)；(4)使用四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(TMB)作為底物進(jìn)行顯色20min ；(5)添加50uL濃度為O. 2N的硫酸終止反應(yīng)后，測(cè)量450nm的吸光度；(6)選出吸光度大約為3的3-20-1和3_26_1，并通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。3、單克隆抗體的大量制備及和純化將亞克隆后的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，約20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)進(jìn)行親和層析純化。得到的單克隆抗體分別命名為3_20_1與
3-26-1。4、單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定所篩選出的2種mAb的效價(jià)通過ELISA方法來測(cè)定。分別加入3-20-1、
3-26-1 (10ug/mL)，在反應(yīng)后，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-小鼠抗體與TMB進(jìn)行顯色，結(jié)果如圖2所示兩種mAb效價(jià)達(dá)到1(Γ9以上。實(shí)施例4 :單克隆抗體的標(biāo)記及滴度的測(cè)定將純化出得各抗體按常規(guī)方法進(jìn)行HRP標(biāo)記，標(biāo)記好的單克隆抗體的滴度通過下面的方法測(cè)定，將濃度為O. 2ug/ml的t-PSA固定在96孔微板上(IOOuL/孔)。使用I %的牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)，加標(biāo)記的單克隆抗體(第一孔稀釋100倍)，從第二孔開始做4倍稀釋，于室溫下反應(yīng)2小時(shí)。添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘，用O. 2N的硫酸中止反應(yīng)。測(cè)量在450nm的吸光度，按實(shí)施例三中的方式獲得針對(duì)固定在固相中的抗原的滴度。結(jié)果表明具有有效的滴度(結(jié)果如圖3)。實(shí)施例5 :雙抗體夾心ELISA檢測(cè)t_PSA方法的建立(I)、以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體之一包被，O. 5ug/ml的單克隆抗體以IOOuL/孔的量加到微孔板土,于4°C孵育24小時(shí)固定于固相；(2)、孔格使用含有 0.1% Tween20 的 pH 值為 7. 4 的 20mM PBS (PBST)以 200uL/ 孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉2小時(shí)。 (3)、孔格用PBST以200uL/孔的量洗4次，加入由起始濃度10ug/ml連續(xù)4倍稀釋t-PSA,于室溫溫育2小時(shí),然后加入標(biāo)記HRP的一株抗體(I 4K ；100uL/孔)并于室溫溫育2小時(shí)。(4)、添加TMB后，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘，加入O. 2N的硫酸來中止反應(yīng)并測(cè)量450nm的吸光度。(5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高。(見附圖4所示)實(shí)施例6 :制備本發(fā)明的前列腺特異性抗原定量測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)(一 )高碘酸鈉氧化法標(biāo)記辣根過氧化酶(I)酶的氧化(全過程避光)稱取3-5mg HRP 溶解于 600 μ L ddH202 中；b、加入新鮮配制的 150uL O. IM 高碘酸鈉(NaI04) (MW :213. 89g/mol，取 O. 22g 溶解于IOmL IOmM pH7. O磷酸鈉緩沖液中)；C、混勻，室溫,避光孵育20min ;d、將溶液用透析管透析,3000rpm/min,4°C, 20min,溶液為I. OmM pH4. O醋酸鈉緩沖液，換3-4次；e、最后透析至800 μ L,至EP管中；(2)抗體的準(zhǔn)備和標(biāo)記(避光)a、取準(zhǔn)備好的3mg單抗，用離心管濃縮成500 μ L-1000 μ L體積，吸出于新的15mL離心管中；b、加入500 μ L O. 2M ρΗ9· 5碳酸鹽緩沖液，混勻，檢測(cè)pH值在9. O 9. 5 ;C、立即將透析好的HRP溶液與單抗溶液混合，室溫?fù)u晃2h，避光；d、加入 80 μ L 新鮮配制的 NaBH4 (4. Omg/mL,取 40mg 溶解于 IOmL ddH202 中);e、混勻(避光)，4°C孵育 I. 5h ；f、用PBS透析至體積為2mL ；g、加入等體積甘油，ImL/管，-20C保存( 二)酶標(biāo)抗體工作液的配制(I)酶標(biāo)稀釋液的配制
權(quán)利要求
1.抗前列腺特異性抗原的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)分別為CCTCCC201202和CCTCCC201208。
2.抗前列腺特異性抗原的單克隆抗體，分別由保藏號(hào)為CCTCCC201202和CCTCCC201208的雜交瘤細(xì)胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為3-20-1和3_26_1。
3.如權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于將Balb/c小鼠免疫3次后，在細(xì)胞融合前3天作最后一次加強(qiáng)免疫,采用ELISA法分2步進(jìn)行篩選融合細(xì)胞第一步采用間接ELISA法篩選出抗前列腺特異性抗原PSA的陽性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，選擇吸光度和靈敏度較高的陽性孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)3次后，最后篩選出2株雜交瘤細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求2所述的抗前列腺特異性抗原單克隆抗體的應(yīng)用，即利用所述的單克隆抗體的雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)t-PSA，夾心法兩兩配對(duì)的抗體來源于細(xì)胞株3-26-1和3-20-1，其步驟包括 (1)以所述的兩兩配對(duì)的單克隆抗體之一包被； (2)加入待測(cè)樣品孵育； (3)以所述的兩兩配對(duì)的HRP標(biāo)記的另一株單克隆抗體作為二抗，加入反應(yīng)體系； (4)洗滌后加入酶反應(yīng)底物，以450nm讀取OD值； (5)結(jié)果表明檢測(cè)的靈敏度很高。
5.一種檢測(cè)血清中t-PSA含量的試劑盒，包括包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品；酶標(biāo)記的前列腺特異性抗原另一株單克隆抗體；上述酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物A液和B液以及洗滌液。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被單克隆抗體，包被液是磷酸鹽緩沖液中；另一株前列腺特異性抗原單克隆抗體和辣根過氧化酶偶聯(lián)形成酶標(biāo)記抗體，采用的是改良的過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品以小牛血清為基質(zhì)，加入前列腺特異性抗原純品配置而成；發(fā)光底物A、B為HRP-Luminol發(fā)光體系。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于標(biāo)記抗體所用的標(biāo)記酶是辣根過氧化酶，用的是高碘酸鈉氧化法，所得酶標(biāo)記抗體最佳的工作濃度是I : 2000 ;包被有抗前列腺抗原抗體的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；發(fā)光液A液用硼砂7. 99g，硼酸3.46g，魯米諾O. 28g，對(duì)碘苯酚O. 07g,加工藝用水定容至700mL，避光保存；發(fā)光底物B液由下列成分組成硼砂7. 99g,硼酸3. 46g,過氧化脲O. 07g加工藝用水定容至700mL。
8.如權(quán)利要求5-7所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟 (1)標(biāo)準(zhǔn)品的配制和濃度的校正 將前列腺特異性抗原t-PSA純品，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，配制一高濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成0、2. 5、5、15、45、100ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)校正。
(2)包被 采用O. 5mol/L, pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液與適當(dāng)濃度的前列腺特異性抗原單抗混合成抗體濃度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過夜； (3)洗板 用PBS-T洗液洗板孔2次； (4)封閉封閉液包含 NaCl 8g, KCl O. 2g, Na2HP04. 12H20 2. 9g, KH2P04 0. 2g,蔗糖 20. OOg,proclin300 1.00ml, BSA 20. 00g，封閉液的 PH 值為 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封閉，濕盒孵育2h ； (5)干燥 去除封閉液，過夜干燥。
(6)組裝為成品 將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。
全文摘要
抗t-PSA單克隆抗體產(chǎn)生的雜交瘤及檢測(cè)t-PSA試劑盒的制備，屬于免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種特異性識(shí)別t-PSA的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測(cè)t-PSA的高靈敏度的方法；還提供了前列腺特異性抗原t-PSA化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒及其制備方法，該試劑盒包括t-PSA檢測(cè)反應(yīng)板、酶結(jié)合物、發(fā)光底物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、濃縮洗滌液。本發(fā)明用細(xì)胞融合和雜交瘤技術(shù)研發(fā)出靈敏度高、特異性好的抗體；同時(shí)用自主研發(fā)抗體將免疫學(xué)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，研制出檢測(cè)范圍寬、靈敏度高、操作方便、生產(chǎn)成本低的試劑盒。臨床檢測(cè)人血清中t-PSA的含量，用于前列腺癌早期篩查、制定治療方案和評(píng)估預(yù)后提供重要參考依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102925413SQ20121031030
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日 公開號(hào)201210310304.9
發(fā)明者藍(lán)興國(guó), 李玉花, 魏德強(qiáng), 趙洪梅, 曹領(lǐng)改 申請(qǐng)人:大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司, 東北林業(yè)大學(xué)大慶生物技術(shù)研究院, 李玉花