專利名稱：一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法。
背景技術(shù)：
丙酮酸是酶法合成色氨酸和酪氨酸、L-多巴(醫(yī)學(xué)上用來(lái)治療帕金森氏病)，是氫化阿托酸的原料、乙烯系聚合物的起始劑、人工器官的合成原料，是合成L-半膚氨酸、L-亮氨酸、VBf^PVB12的原料。同時(shí)丙酮酸還可以用來(lái)合成系列蛋白酶抑制劑、抗病毒劑、鎮(zhèn)靜劑、消炎鎮(zhèn)痛藥、抗病毒劑藥物等。丙酮酸的另一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域就是用作減肥劑。外界補(bǔ)充丙酮酸，通過(guò)刺激
線粒體加速TCA循環(huán)，從而加速脂肪消耗達(dá)到減肥的目的。Virtual Musde雜志中提到“Pittsburgh醫(yī)學(xué)中心附屬大學(xué)的科學(xué)家們說(shuō)明飲食中添加含有丙酮酸鹽(通常為鈉、鉀、鈣、鎂鹽)的補(bǔ)充劑，不僅可以增加脂肪的代謝高達(dá)48%，而且可以減少因低脂飲食造成的蛋白質(zhì)流失”。近年來(lái)國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家利用丙酮酸這一特性，以其鈣鹽作為減肥保健藥品。國(guó)外有關(guān)媒體己經(jīng)報(bào)道，含有丙酮酸鈣的減肥藥已經(jīng)風(fēng)靡全球，成為減肥藥市場(chǎng)上的新寵。丙酮酸乙酯是農(nóng)藥合成中難以替代的原料和中間體，它被廣泛應(yīng)用于殺菌劑和除草劑的合成。溴代丙酮酸乙酯是高效殺菌劑噻菌靈的主要中間體，噻菌靈是一種高效廣譜的內(nèi)吸式殺菌劑，對(duì)植物有保護(hù)和治療作用，還可以控制倉(cāng)儲(chǔ)水果、蔬菜的病害，廣泛用于柑橘、香蕉等多種水果蔬菜的防腐保鮮，我國(guó)衛(wèi)生部也準(zhǔn)許其作為食品添加劑使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法，通過(guò)對(duì)菌株培養(yǎng)條件的研究，確定了菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件選擇種齡19 h的種子液，12%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，CaCO3添加時(shí)間為9 h，500 mL三角瓶中裝液量以50 mL最佳。I. 一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法，通過(guò)對(duì)菌株培養(yǎng)條件的研究，確定了菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件。具體包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸步驟。2.步驟I所述的種子培養(yǎng)基為30 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，，10 mL/L玉米漿，2 g/L KH2PO4,10 mg/L煙酸，15 μ g/L鹽酸硫胺素，2 mg/L鹽酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH為5. 6，30°C培養(yǎng)。3.步驟I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為80 g/L葡萄糖，3 g/L蛋白胨，5. 9 g/L硫酸銨，Ig/L KH2PO4,0. 5 g/L MgSO4 · 7H20,8 mg/L 煙酸，15 μ g/L 鹽酸硫胺素，2 mg/L 鹽酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH為5.6，30°C培養(yǎng)。4.步驟I所述的最佳種齡為19 h。5.步驟I所述的最佳接種量為12%。6.步驟I所述的最佳CaCO3添加時(shí)間為9 h。
7.步驟I所述的裝液量500 mL三角瓶以50 mL最佳。本發(fā)明使用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸，通過(guò)對(duì)菌株培養(yǎng)條件的研究，確定菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件，提高光滑球擬酵母菌生產(chǎn)丙酮酸能力。


圖I種齡對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響。圖2接種量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響。圖3 CaCO3添加時(shí)間對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響。 圖4裝液量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。本專利所用的菌株為光滑球擬酵母菌(CCTCC M202019)，購(gòu)買于CCTCC。
實(shí)施例I
本實(shí)施案例說(shuō)明種齡對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，為探討不同種齡對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，選擇不同種齡進(jìn)行丙酮酸發(fā)酵，結(jié)果如圖I所示。結(jié)果見(jiàn)圖1，在添加有玉米漿的種子培養(yǎng)基中菌體在18-21 h之間達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體量基本上不再有所增加，一般來(lái)說(shuō)此時(shí)的菌體活力強(qiáng)，代謝速度快，適于接入發(fā)酵。選擇種齡分別為15 h、19 h、23 h，27 h的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，種齡為19 h和23 h的種子對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響不大；種齡為27 h的種子發(fā)酵丙酮酸能力下降較快，推測(cè)是菌體衰老造成的；15 h的種子丙酮酸產(chǎn)量低，可能是種子幼嫩造成的。因此選擇種齡為19 h的種子接入發(fā)酵。實(shí)施例2
本實(shí)施案例說(shuō)明接種量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，為探討不同接種量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，選擇不同接種量進(jìn)行丙酮酸發(fā)酵，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果見(jiàn)圖2，為了考查接種量對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響，進(jìn)行了不同接種量實(shí)驗(yàn)。向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入4%、6%、8%、10%、12%、14% (體積比)的種子(菌齡19 h)，調(diào)整最終裝液量一定，菌體濃度隨著接種量的增加而增加，而殘留葡萄糖濃度隨著接種量的增加逐漸下降。在4%-12%的范圍內(nèi)，隨著接種量的增加丙酮酸產(chǎn)量上升，在12%的接種量時(shí)達(dá)最高，隨后丙酮酸產(chǎn)量下降。分析可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)旺；種子培養(yǎng)基中帶來(lái)過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)成分(尤其是維生素等生長(zhǎng)因子)，造成流向TCA循環(huán)的通量增加，降低了丙酮酸產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果12%的接種量最佳。實(shí)施例3
本實(shí)施案例說(shuō)明CaCO3添加時(shí)間對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，為探討不同CaCO3添加時(shí)間對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，選擇不同CaCO3添加時(shí)間進(jìn)行丙酮酸發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果見(jiàn)圖3，發(fā)酵前添加CaCO3雖然有利于菌體生長(zhǎng)，丙酮酸產(chǎn)量也較高，但是殘?zhí)呛扛?，其原因還有待于進(jìn)一步研究。9 h添加CaCO3有利于菌體生長(zhǎng)和葡萄糖消耗，丙酮酸產(chǎn)量也最高。9 h后添加CaCO3丙酮酸產(chǎn)量下降、殘?zhí)歉撸茰y(cè)可能是因?yàn)椴焕母咚嵝原h(huán)境導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受限，菌體增長(zhǎng)緩慢，菌體活力降低。實(shí)施例4
本實(shí)施案例說(shuō)明裝液量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，為探討不同裝液量對(duì)光滑球擬酵母菌產(chǎn)丙酮酸的影響，選擇不同裝液量進(jìn)行丙酮酸發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果見(jiàn)圖4，丙酮酸發(fā)酵屬于好氧型發(fā)酵，通氣量對(duì)于丙酮酸發(fā)酵具有重要影響。測(cè)定溶氧量的最佳方法是直接測(cè)定發(fā)酵液的溶氧系數(shù)，但是對(duì)于搖瓶發(fā)酵，此法操作煩瑣。固定搖瓶轉(zhuǎn)速一定，通過(guò)調(diào)節(jié)裝液量能初步得出發(fā)酵時(shí)菌體需氧情況。在體積為500 mL搖瓶中，不同裝液量對(duì)丙酮酸發(fā)酵是有影響的。裝液量太大，通氣效果差，結(jié)果丙酮酸產(chǎn)量低，原因是發(fā)酵液溶氧量低，丙酮酸生成乙醛氧化過(guò)多的NADH，即丙酮酸向下代謝通量大，丙酮酸產(chǎn)量降低；裝液量太小，溶氧量過(guò)大，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的大量NADH通過(guò)呼吸鏈氧化生成ATP，大量的ATP抑制了糖酵解，流向丙酮酸的代謝通量降低，也降低了丙酮酸產(chǎn)量。結(jié)果 500 mL三角瓶中裝液量以50 mL最好。
權(quán)利要求
1.一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸步驟，其特征在于，種子培養(yǎng)基為30 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，10 mL/L玉米漿，2 g/L KH2PO4,10 mg/L煙酸，15 μ g/L鹽酸硫胺素，2 mg/L鹽酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH為5. 6，30°C培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為80g/L葡萄糖，3 g/L蛋白胨，5. 9 g/L 硫酸銨，I g/L KH2PO4,0. 5 g/L MgSO4 · 7H20,8 mg/L 煙酸，15 μ g/L 鹽酸硫胺素，2 mg/L鹽酸吡哆醇，9 μ g/L生物素，pH為5.6，30°C培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，種齡為19h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，接種量為12%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，CaCO3添加時(shí)間為9h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，裝液量500mL三角瓶裝液50 mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用光滑球擬酵母菌高效制備丙酮酸的方法，通過(guò)對(duì)菌株培養(yǎng)條件的研究，確定了菌株最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件選擇種齡19h的種子液，12%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，CaCO3添加時(shí)間為9h，500mL三角瓶中裝液量以50mL最佳。
文檔編號(hào)C12R1/88GK102864179SQ201210311839
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者金雅新 申請(qǐng)人:太倉(cāng)市茂通化建有限公司