檢測(cè)結(jié)核菌的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)結(jié)核菌的引物。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其步驟是用環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)檢體中結(jié)核菌的IS6110基因擴(kuò)增，得到大量核酸片段，再用電泳膠、焦磷酸鎂混濁法或SYBRGreen熒光法等方法檢測(cè)擴(kuò)增后的核酸片段，可正確有效的檢測(cè)出檢體是否有結(jié)核菌。本發(fā)明另外提供了一種檢測(cè)結(jié)核菌的試劑盒。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)結(jié)核菌的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌的引物，尤其是用環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病 是一個(gè)世界性關(guān)注的疾病，在1993年4月，世界衛(wèi)生組職宣布結(jié)核病為一個(gè)全球性緊急疾病，呼吁各國(guó)共同合作防治。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估計(jì)，目前全世界約有三分之一人口已經(jīng)遭受結(jié)核菌感染，全世界幾乎每一秒鐘就有一個(gè)人新發(fā)生結(jié)核病，也導(dǎo)致全世界每年將近兩百萬(wàn)人死于結(jié)核病。另外，估計(jì)今后十年還可能會(huì)有三億人受到感染，94萬(wàn)人發(fā)病，三千萬(wàn)人因此死亡。此外，臺(tái)灣衛(wèi)生署疾病管制局統(tǒng)計(jì)，2007年臺(tái)灣所有法定傳染病患病人數(shù)總計(jì)4932人，其中結(jié)核病就有1448人，約占全部的三分之一。
[0003]結(jié)核病的病原是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC),包含有 M.tuberculosis、M.bovis> M.africanum、M.microti 及 M.canetti,其中在人體中造成結(jié)核病的最主要病菌為結(jié)核分枝菌(M.tuberculosis),而遭受結(jié)核菌感染的最主要部位為肺部。然而，一般人受到感染后不一定會(huì)發(fā)病成為結(jié)核病患者，只有十分之一會(huì)發(fā)病稱初次感染(primary TB),其余的人為結(jié)核菌潛伏感染(latent tuberculosisinfection, LTBI)，這些人可能終其一生都不會(huì)發(fā)病，但是約有5%的人因免疫力的的改變而發(fā)病稱活動(dòng)性肺結(jié)核(Reactivation TB)，若能對(duì)“潛伏結(jié)核感染者”及早進(jìn)行診斷，將有效監(jiān)控、并減少結(jié)核病傳染。
[0004]目前臨床上診斷結(jié)核病的方法，主要方式包括涂片耐酸性染色鏡檢及結(jié)核菌培養(yǎng)，其中涂片鏡檢雖然簡(jiǎn)單，但是敏感度較低，只有50%至60%，通常在痰檢體中，需要至少一萬(wàn)只的結(jié)核菌，才可以在顯微鏡下被發(fā)現(xiàn)；使用結(jié)核菌培養(yǎng)法，其特異性雖然很高，但是需要六到八周的時(shí)間才能得到確定診斷，因此這些缺點(diǎn)限制了這兩種方法在診斷及治療上的時(shí)效及功效性。目前，雖有許多使用PCR方法檢測(cè)結(jié)核桿菌，但其敏感度只有60%到80%左右，且所需時(shí)間也要六至七小時(shí)，因此臨床上迫切需要一種更快、更準(zhǔn)確的診斷方法，為醫(yī)師提供早期診斷及治療的數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]從所述【背景技術(shù)】中得知，在現(xiàn)有的結(jié)核菌檢測(cè)技術(shù)中，存在操作程序復(fù)雜、診斷時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)試敏感度低等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的結(jié)核菌檢測(cè)方法。
[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)臨床檢體中結(jié)核菌的引物對(duì)，尤其是用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌的新穎的引物對(duì)，包括SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 6，此引物對(duì)可檢測(cè)檢體中單個(gè)結(jié)核菌的IS6110基因，具有高靈敏性。
[0007]本發(fā)明又提供一種快速檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其中是以細(xì)胞分解試劑處理樣品后，不進(jìn)行DNA萃取，直接進(jìn)行核酸增幅。包括下列步驟:(a)用細(xì)胞分解試劑處理樣品；
(b)將該樣品與引物混合，其中該引物包括SEQID NO: 1~ SEQ ID NO: 6的一種或幾
種；
(c)用核酸擴(kuò)增技術(shù)放大該樣品標(biāo)的DNA；
(d)檢測(cè)該標(biāo)的DNA；
其中該核酸增幅方法為環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法。
[0008]在具體實(shí)施例中，步驟(b)所使用的引物是一組外引物對(duì)，序列為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2，及一組內(nèi)引物對(duì)，序列為SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4，在較佳實(shí)施例中，步驟(b)同時(shí)加入一對(duì)環(huán)形引物，序列為SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6，用以加強(qiáng)擴(kuò)增標(biāo)的產(chǎn)物。
[0009]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)所采用的技術(shù)手段主要為利用一種細(xì)胞分解試劑處理樣品，并利用結(jié)核菌IS6110基因的引物對(duì)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核菌。
[0010]本發(fā)明另外提供一種檢測(cè)結(jié)核菌的試劑盒，包括:
(a)引物，選自:SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 5或SEQ ID NO: 6所構(gòu)成的群組；及
(b)核酸擴(kuò)增 試劑。
[0011]其中該核酸擴(kuò)增試劑是環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增劑，其中該引物是SEQ ID NO: USEQID NO: 2、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4。較佳的實(shí)施例中，該引物進(jìn)一步包括SEQ IDNO: 5 及 SEQ ID NO: 6。
[0012]本發(fā)明可帶來(lái)以下技術(shù)效果:快速、高效、準(zhǔn)確及靈敏的結(jié)核菌檢測(cè)方法。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1至圖3為檢測(cè)疑似結(jié)核病患者臨床檢體的結(jié)果，其中“一”是結(jié)核菌培養(yǎng)為陰性檢體；“ + ”是結(jié)核菌培養(yǎng)為陽(yáng)性檢體；“NC”是陰性對(duì)照組及“M”是DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
具體實(shí)施例
[0014]為了能更好的讓本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的目的、特征及優(yōu)點(diǎn)，舉出以下實(shí)施例。
[0015]用本發(fā)明的新穎的引物對(duì)來(lái)檢測(cè)結(jié)核菌的方法實(shí)際上主要包括三步驟:
〈一〉細(xì)胞分解試劑處理樣品，
〈二〉將標(biāo)的DNA用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增放大，及
〈三〉以DNA電泳膠或焦磷酸鎂混濁法或SYBR Green熒光法檢測(cè)被擴(kuò)增的DNA。
[0016]以下為具體的實(shí)施步驟。
[0017]1.檢體制備及處理
44個(gè)臨床痰液檢體樣本，將這些檢體加入等量的氫氧化鈉-檸檬鹽酸- N-乙酰-L -半胱氨酸(NaOH - citirate - Nacetyl -L- cysteine)溶液，置于室溫下15分鐘，離心之后，將沉淀物以ImL的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH.7.4)重新懸浮取100 μ I懸浮液加入400 μ I DNA細(xì)胞分解試劑(cell lysis buffer，益生生技)，加熱95°C，5分鐘，高速離心，5分鐘，取出上清液(由國(guó)泰醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供，并依臨床結(jié)核菌培養(yǎng)方法，判斷其為陽(yáng)性或陰性檢體)。
[0018]2.引物對(duì)設(shè)計(jì):
本發(fā)明使用的引物是以M.tuberculosis IS6110基因片段的序列(GenBankaccession N0.X17348)為基礎(chǔ)并以 LAMP 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)(http://primer explorer.JP/e/mdex.html) 0本發(fā)明所使用的引物及其序列如表一所示，包括FO (SEQ ID NO:1)、BO (SEQ ID NO: 2)、FI (SEQ ID NO: 3)、BI (SEQ ID NO: 4)、FL (SEQ ID NO: 5)及 FB(SEQ ID NO: 6)等引物。
[0019]表1。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)結(jié)核菌的引物，其特征在于包含下列序列:
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于進(jìn)一步包含下列序列:

3.一種用于檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其特征在于包括下列步驟: 用細(xì)胞分解試劑處理樣品； 混合該樣品與如權(quán)利要求1所述的引物； (c)用核酸擴(kuò)增法放大該樣品標(biāo)的DNA; (d)檢測(cè)該標(biāo)的DNA。
4.如權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其特征在于該步驟(c)的核酸擴(kuò)增法是環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增法。
5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其特征在于該步驟(b)所使用的引物是一對(duì)外引物對(duì)，序列為SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 2，及一對(duì)內(nèi)引物對(duì)，序列為SEQ IDNO: 3 及 SEQ ID NO: 4。
6.如權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)結(jié)核菌的方法，其特征在于該步驟(b)同時(shí)加入一對(duì)環(huán)介導(dǎo)用引物，序列為SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6，用來(lái)加強(qiáng)擴(kuò)增標(biāo)的產(chǎn)物。
7.一種用于檢測(cè)結(jié)核菌的試劑盒，其特征在于，包括: (a)引物，選自:SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ IDNO: 5或SEQ ID NO: 6中的一種或幾種； (b)核酸擴(kuò)增試劑。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，該核酸擴(kuò)增試劑是環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增劑。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，引物是SEQID NO: USEQ ID NO: 2,SEQID NO: 3 及 SEQ ID NO: 4。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于該引物進(jìn)一步包括SEQID NO: 5及SEQID NO: 6。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103667425SQ201210314495
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月30日
【發(fā)明者】陳子智, 陳文彬, 曹郁屏 申請(qǐng)人:益生生技開發(fā)股份有限公司