專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，目前全球約有三分之一人口感染MTB，每年新發(fā)患者1000萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)300萬(wàn)?？ń槊?BCG)作為預(yù)防結(jié)核病的疫苗自1921年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直受到人們的關(guān)注，曾經(jīng)視為戰(zhàn)勝結(jié)核病的希望，但是經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的研究和應(yīng)用，BCG雖然能在新生兒中阻止結(jié)核的播散，但卻不能對(duì)抗最普遍的成人肺結(jié)核病，而在天然感染結(jié)核的人中也不能抵御再次感染。因此，亟需有效的疫苗來(lái)控制TB的傳播與蔓延。亞單位疫苗是一種新型結(jié)核疫苗，其使免疫應(yīng)答集中于在免疫保護(hù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的抗原 蛋白。對(duì)結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)抗原的研究可用于發(fā)展更好的疫苗。以往結(jié)核亞單位疫苗研究主要選擇生長(zhǎng)早期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)的抗原，而忽略了休眠期細(xì)菌特有的抗原。當(dāng)卡介苗(BCG)免疫機(jī)體后，由于休眠期抗原表達(dá)量低，不能針對(duì)休眠期細(xì)菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對(duì)休眠狀態(tài)結(jié)核桿菌沒(méi)有免疫保護(hù)作用，而休眠狀態(tài)的結(jié)核桿菌潛伏感染是成人肺結(jié)核復(fù)發(fā)的主要來(lái)源。隨著人們對(duì)潛伏感染的認(rèn)識(shí)，休眠期結(jié)核桿菌表達(dá)的抗原物質(zhì)開(kāi)始受到重視。其中，HspX是最早發(fā)現(xiàn)的與結(jié)核桿菌休眠狀態(tài)有關(guān)的基因，HspX抗原與可以被致敏的T細(xì)胞識(shí)別，刺激T細(xì)胞分泌IFN- Y，具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性。在健康的與肺結(jié)核患者密切接觸的家人(80%)和醫(yī)務(wù)工作者(90%)中，HspX具有明顯的T細(xì)胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50 % )，提示HspX抗原具有免疫保護(hù)作用。近來(lái)有研究表明結(jié)核分枝桿菌phoY2基因與結(jié)核菌的休眠狀態(tài)形成有關(guān)，phoY2基因缺失可增加菌株對(duì)利福平，吡嗪酰胺等抗結(jié)核藥物的敏感性，并且影響小鼠感染結(jié)核模型中結(jié)核持留菌的形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2及其制備方法，為結(jié)核疫苗提供了有效的候選潛伏抗原。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白，具有如序列2所不的蛋白序列。上述的一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因。進(jìn)一步的，上述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因，是如下I)或
2)的基因
a)其核苷酸序列是序列表中的序列I;
b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的DNA分子。進(jìn)一步的，保護(hù)了含有上述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體為PET30a質(zhì)粒。含有上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的制備方法，包括有以下步驟
O獲得上述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因；
2)將步驟I)得到的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因?qū)胫亟M表達(dá)載
體；
3)將步驟2)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 4)培養(yǎng)步驟3)得到的宿主細(xì)胞；
5)將步驟4)得到的宿主細(xì)胞進(jìn)行處理得到上述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白并純化和表達(dá)。上述制備方法，所述編碼基因?yàn)樾蛄蠭所示的核苷酸序列；所述重組表達(dá)載體為PET30a質(zhì)粒；所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白在制備結(jié)核亞單位疫苗中的應(yīng)用。進(jìn)ー步的，上述應(yīng)用中，所述結(jié)核亞單位疫苗是將上述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀釋液與DDA水溶液和TDM水溶液混合加熱后制得的。進(jìn)ー步的，上述應(yīng)用中，所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白為用PBS稀釋至O. 2ug/ul ;所述DDA用注射用水配制成2. 5 mg/ml ;所述TDM用注射用水配制成2. 5 mg/ml ;所述加熱為80°C水浴加熱10分鐘；所述結(jié)核亞單位疫苗中各組分的體積比為結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀釋液DDA水溶液TDM水溶液為2:1:1。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明構(gòu)建了編碼結(jié)核分枝桿菌phoY2休眠基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)其表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究，證明此種抗原確實(shí)有效，為結(jié)核疫苗提供了有效的候選潛伏抗原。


圖I為結(jié)核分枝桿菌phoY2基因的體外擴(kuò)增圖譜，其中，
M Marker ；
泳道I :PCR產(chǎn)物。圖2為phoY2抗原的電泳結(jié)果，其中，
M Marker ；
泳道I :BL21 DE3誘導(dǎo)后上清；
泳道2 phoY2原樣；
泳道3 :上樣后流穿液；
泳道4 20mM/L咪唑漂洗緩沖液；
泳道5 500mM/L咪唑洗脫緩沖液洗脫收集液。圖3為phoY2抗原特異性免疫小鼠IFN- Y分泌水平。圖4為phoY2抗原特異性免疫小鼠IL-17分泌水平。
圖5為phoY2抗原特異性免疫小鼠體液IgGl檢測(cè)結(jié)果。圖6為phoY2抗原特異性免疫小鼠體液IgG2b檢測(cè)結(jié)果。圖7為phoY2抗原特異性免疫小鼠體液IgG2c檢測(cè)結(jié)果。圖8為臨床標(biāo)本特征表。圖9為人體外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對(duì)phoY2及HspX抗原的IFN- Y免疫反應(yīng)結(jié)果。其中，
HD :健康志愿者，n=9 ；
TB :結(jié)核患者,n=26 ；
LTB :密切接觸者，n=9。3 X IO6 PBMC/孔分別與 phoY2 抗原(5ug/ml)和 HspX 抗原(5ug/ml)在 37°C、5%C02條件下共孵育20小時(shí)后，運(yùn)用ELISP0T方法檢測(cè)計(jì)數(shù)分泌IFN- Y的細(xì)胞數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
pET-30a phoY2質(zhì)粒的克隆構(gòu)建
I、目的基因phoY2的擴(kuò)增
以結(jié)核分枝桿菌(MTB)毒株H37 Rv的DNA為模板，根據(jù)GenBank中公布的結(jié)核分枝桿菌phoY2基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，上游引物含EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物含Hind III酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增全長(zhǎng)為642bp的phoY2，擴(kuò)增結(jié)果如圖I所示。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，69°C復(fù)性30s，72°C延伸50s，25個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用EcoR I和Hindm雙酶切，克隆構(gòu)建在質(zhì)粒pET-30a ( + )中。2、構(gòu)建phoY2表達(dá)質(zhì)粒
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，phoY2片段被EcoR I和Hind III酶切后并純化后，構(gòu)建入pET_30a相應(yīng)的多克隆酶切位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pET30a-phoY2，經(jīng)測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果為序列2。實(shí)施例2 phoY2蛋白表達(dá)純化
將質(zhì)粒pET30a-phoY2轉(zhuǎn)化入E. Coli BL21 (DE3)中，活化表達(dá)phoY2蛋白的E. coliBL21菌體，移入200 mL培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)2 3 h至A600達(dá)到O. 5 ;加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG (O. 5mmol / L) 25°C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)12h ；4°C IOOOOrpm離心IOmin收集細(xì)菌；超聲破碎提取與上清，隨后應(yīng)用Ni-NTA His-Bind柱(Novagen)純化系統(tǒng)純化目的蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3
制備phoY2抗原免疫小鼠，并檢測(cè)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫水平
I、將phoY2蛋白用PBS稀釋至10ug/50ul ;DDA用注射用水配制成2. 5 mg/ml，80°C、IOmin水浴加熱；TDM用注射用水配制成2. 5mg/ml,80°C、IOmin水浴加熱；取DDA和TDM溶液各50ul與IOOul的phoY2蛋白充分混勻，最后疫苗呈均一的乳油狀。2、將30只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組phoY2蛋白免疫組(n=10)，卡介苗BCG免疫組(n=10)，和PBS對(duì)照組(n=10)。分別在第1、4、7周用制備好的蛋白疫苗腹股溝皮下免疫動(dòng)物(200ul/只)，5X IO6 CFU BCG在第I周腹股溝皮下免疫動(dòng)物I次。蛋白疫苗最后一次免疫后6周，各組各取4只小鼠采血檢測(cè)體液免疫指標(biāo)，動(dòng)物處死無(wú)菌分離脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)。3、細(xì)胞因子IFN-Y及IL-17的水平與結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)相關(guān)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分別針對(duì)特異性抗原phoY2分泌IFN-Y及IL-17的水平，結(jié)果如圖3和圖4所示。小鼠最后一次免疫6周后無(wú)菌分離脾臟，檢測(cè)脾細(xì)胞受到phoY2蛋白(5ug/ml)刺激后IFN- Y及IL-17的分泌水平。4、用 phoY2 蛋白(5ug/ml)包被 96 孔板(100ul/well)4°C過(guò)夜。PBST 溶液 300ul/well洗板5次X5 min/次。洗滌后加入10% BSA 200ul/孔，37°C封閉lh。棄去孔內(nèi)液體后，加入稀釋的血清樣品IOOul/孔，從I :100開(kāi)始至I : 12800，37°C放置lh。洗板后，加入200ul/well 的 1:15000 稀釋的兔抗鼠 IgGl, 1:10000 稀釋的 IgG2b 和 1:5000 稀釋的 IgG2c,37°C放置lh。洗板后，加入lOOul/well TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘顯色后，加入50ul/well終止液(2M的H2S04)終止反應(yīng)；在450nm檢測(cè)OD值，結(jié)果如圖5-圖7所示。 實(shí)施例4
I、本研究納入人群分為3組，如圖8所示活動(dòng)性肺結(jié)核病人(TB,26例)，肺結(jié)核患者密切接觸者(LTB，9例，視為結(jié)核潛伏感染者)，BCG接種的健康志愿者(HD，9例)。于蘭州市肺科醫(yī)院采集臨床標(biāo)本，抽取人體靜脈血IOml于肝素抗凝管中，分離PBMC，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)度至5X IO6 cells/ml。將分離的PBMC加入到ELISP0T板中(3X IO6Cells/孔，同時(shí)分別加入刺激蛋白HspX，phoY2，使蛋白終濃度均為5ug/ml)。2、37°C、5% C02條件下共同孵育20小時(shí)后，按ELISP0T操作說(shuō)明依次加入檢測(cè)抗體等試劑，洗板、顯色，分別進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖9所示。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白，其特征在于，具有如序列2所示的蛋白序列。
2.一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因，其特征在于是如下I)或2)的基因 a)其核苷酸序列是序列表中的序列I; b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體為PET30a質(zhì)粒。
5.含有權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)。
6.一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的制備方法，其特征在于包括有以下步驟 O獲得如權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因； 2)將步驟I)得到的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的編碼基因?qū)胫亟M表達(dá)載體； 3)將步驟2)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 4)培養(yǎng)步驟3)得到的宿主細(xì)胞； 5)將步驟4)得到的宿主細(xì)胞進(jìn)行處理得到如權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白并純化和表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述編碼基因?yàn)樾蛄蠭所示的核苷酸序列；所述重組表達(dá)載體為PET30a質(zhì)粒；所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
8.—種如權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白在制備結(jié)核亞單位疫苗中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述結(jié)核亞單位疫苗是將如權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀釋液與DDA水溶液和TDM水溶液混合加熱后制得的。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于如權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白為用PBS稀釋至O. 2ug/ul ;所述DDA用注射用水配制成2. 5 mg/ml ;所述TDM用注射用水配制成2. 5 mg/ml ;所述加熱為80°C水浴加熱10分鐘；所述結(jié)核亞單位疫苗中各組分的體積比為結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白的PBS稀釋液DDA水溶液TDM水溶液為2:1:1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原phoY2蛋白，是具有如序列2所示的蛋白序列，并公開(kāi)了其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明構(gòu)建了編碼結(jié)核分枝桿菌phoY2休眠基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)其表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化，通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫原性進(jìn)行了研究，證明此種抗原確實(shí)有效,為結(jié)核疫苗提供了有效的候選潛伏抗原。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102816218SQ20121031488
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者張穎, 辛奇, 祝秉東, 景濤, 唐克峰, 葉華 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)