專利名稱：一種檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCR技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ー種檢測(cè)大ロ黑鱸虹彩病毒的雙重PCR技木。
背景技術(shù)：
大口黑S盧(Micropterus salmoides,或 Largemouth bass),俗稱加州S盧，原產(chǎn)于北美密西西比河流域，屬?gòu)V溫性魚類，具有生長(zhǎng)快、病害少、耐低溫、肉質(zhì)鮮美和容易捕撈等特點(diǎn)，已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種。從20世紀(jì)90年代開始，我國(guó)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸發(fā)生病害的問題越來(lái)越復(fù)雜，如爛鰓病、腸炎病、腐皮病、水霉病、車輪蟲病、杯體蟲病等，導(dǎo)致大ロ黑鱸發(fā)病的病原主要是嗜水氣單胞菌，柱狀黃桿菌，霉菌和寄生蟲，確診由病毒感染導(dǎo)致發(fā)病的報(bào)道較少。大口黑鱸虹彩病毒(LMBV，又稱SCRV)通常指的是虹彩病毒科(Iridoviridae)的娃病毒屬(ZfeflaFirw1S),最早分離自1991年美國(guó)佛羅里達(dá)州Lake Weir市的野生大口黑鱸。1995年美國(guó)南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫(kù)養(yǎng)殖的大口黑鱸暴 發(fā)魚災(zāi)(fish kill)引起人們高度關(guān)注。該病毒的特點(diǎn)是不僅可以導(dǎo)致大面積魚爆發(fā)疾病死亡引起魚災(zāi)，也可以是不表現(xiàn)任何癥狀的隱性帶毒，因此對(duì)大口黑鱸健康養(yǎng)殖帶來(lái)巨大威脅。2009年鄧國(guó)成等人報(bào)道了大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的，這是國(guó)內(nèi)對(duì)大ロ黑鱸潰瘍病毒性病原的首次報(bào)道。而虹彩病毒科中另外ー個(gè)重要的病毒屬腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus')，對(duì)魚的致病性更強(qiáng)，該類病毒引起的魚類疾病呈逐年上升趨勢(shì)，患病魚死亡率達(dá)30-100%。馬冬梅等人研究證實(shí)大口黑鱸的肝脾腫大癥由腫大細(xì)胞病毒屬虹彩病毒引起，實(shí)驗(yàn)室大ロ黑鱸攻毒試驗(yàn)顯示100%死亡率(馬冬梅等，大ロ黑鱸肝脾腫大病病原研究，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2011, 18 (3), 654-659)ο兩種不同種屬虹彩病毒對(duì)大ロ黑S盧養(yǎng)埴的影響，引起廣大科研人員和基層養(yǎng)殖戶對(duì)該類病原的高度關(guān)注。在虹彩病毒中，研究比較清楚的結(jié)構(gòu)蛋白是主衣殼蛋白(MCP)。MCP占整個(gè)病毒粒子多肽的40-45%，是虹彩病毒粒子中豐度最高的蛋白，并且在虹彩病毒科中高度保守，因此可以利用MCP的同源性差異進(jìn)行虹彩病毒分子進(jìn)化方面的研究。1999年Mao J等人綜合大口黑鱸病毒蛋白合成分析，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析(RFLP)，MCP和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DMet)基因序列分析的結(jié)果，明確了大口黑鱸虹彩病毒的分類地位為虹彩病毒科蛙病毒屬成員。Mao J等人比較了 LMBV與蛙病毒3 (FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列，以及它們的限制性內(nèi)切酶圖譜，結(jié)果顯示LMBV與蛙病毒代表株FV3有一定差距。在國(guó)際病毒分類委員會(huì)第八次報(bào)告中將LMBV歸類為娃病毒屬的Santee-Cooper ranavirus種。目前,針對(duì)大ロ黑鱸蛙病毒屬的常規(guī)PCR和熒光定量PCR檢測(cè)方法雖然已有報(bào)道，但尚缺乏ー種能快速、準(zhǔn)確地同時(shí)對(duì)大口黑鱸蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬兩種虹彩病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可同時(shí)檢測(cè)、鑒別蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬兩種虹彩病毒的雙重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是一種檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，包括以下步驟
O從待檢大口黑鱸的組織器官提取基因組DNA ；
2)以基因組DNA為模板，使用分別根據(jù)大口黑鱸虹彩病毒科蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬的MCP基因序列設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)引物，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；其中引物序列如下
娃病毒屬引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
腫大細(xì)胞病毒屬M(fèi)egancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，其中蛙病毒擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)475bp，腫大細(xì)胞病毒擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)262bp。所述雙重PCR反應(yīng)體系為待檢DNA t旲板或陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品2 μ I，IOXbuffer 5 μ I, MgCl2 濃度 I. 5mmol/L,各引物濃度 O. 5 μ mol/L, dNTP 濃度 O. 4mmol/L,Taq 酶 2. 5U, ddH20 補(bǔ)齊至 50 μ I ；
所述雙重 PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應(yīng) 30-35次循環(huán)；72°C IOmin ；
優(yōu)選的，退火溫度為55°C ；
優(yōu)選的，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30次。ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測(cè)試劑盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，其特征在于，所用引物序列分別為
娃病毒屬引物Ranancp
上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I),
下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)；
腫大細(xì)胞病毒屬M(fèi)egancp
上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3),
下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)；
所述陽(yáng)性質(zhì)控品為SD-R和NH-M的DNA模板，陰性質(zhì)控品為無(wú)菌ddH20。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬兩種虹彩病毒，該發(fā)明方法敏感性強(qiáng)、特異性高，可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)大口黑鱸虹彩病毒進(jìn)行診斷和種屬鑒定。


圖I為特異性試驗(yàn)電泳圖譜；
圖2為敏感性試驗(yàn)電泳圖譜；
圖3為病料檢測(cè)試驗(yàn)電泳圖譜。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施案例進(jìn)ー步描述本發(fā)明。引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中LMBV的MCP基因序列(登錄號(hào)⑶256635)和馬冬梅等發(fā)表的大口黑鱸肝脾腫大癥病毒的MCP基因序列，設(shè)計(jì)和篩選出兩對(duì)特異性片段引物。各引物序列和預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，包括以下步驟 1)從待檢大口黑鱸的組織器官提取基因組DNA; 2)以基因組DNA為模板，使用分別根據(jù)大ロ黑鱸虹彩病毒科蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬的MCP基因序列設(shè)計(jì)合成的兩對(duì)引物，在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；其中引物序列如下 娃病毒屬引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 腫大細(xì)胞病毒屬M(fèi)egancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)； 3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行判定，其中蛙病毒擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)475bp，腫大細(xì)胞病毒擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)262bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于所述雙重PCR反應(yīng)體系為待檢DNA模板或陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品2 yl，IOXbuffer 5u I,MgCl2 濃度 I. 5mmol/L，各引物濃度 0. 5 u mol/L, dNTP 濃度 0. 4mmol/L, Taq 酶 2. 5U, ddH20補(bǔ)齊至50 u I0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于所述雙 重 PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C 30s，55_58°C 30s, 72°C 30s，反應(yīng) 30-35 次循環(huán)；72°C IOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于退火溫度為55で。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，其特征在于反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30次。
6.ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測(cè)試劑盒，包括如下成分10XPCR buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、引物、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，其特征在于，所用引物序列分別為 娃病毒屬引物Ranancp 上游引物tatgtgctcaactcttggctggtc (SEQ ID NO. I), 下游引物ccacgatgggcttgacttctcc (SEQ ID NO. 2)； 腫大細(xì)胞病毒屬M(fèi)egancp 上游引物atgctcattgaacagtgccaggtg (SEQ ID NO. 3), 下游引物ggtggagccgaggggtgttc (SEQ ID NO. 4)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的ー種大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陽(yáng)性質(zhì)控品為SD-R和NH-M的DNA模板，陰性質(zhì)控品為無(wú)菌ddH20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)大口黑鱸虹彩病毒的雙重PCR方法，通過設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物和優(yōu)選的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件，可同時(shí)檢測(cè)、鑒別蛙病毒屬和腫大細(xì)胞病毒屬兩種虹彩病毒，該發(fā)明方法敏感性強(qiáng)、特異性高，可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)大口黑鱸虹彩病毒進(jìn)行診斷和種屬鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816868SQ201210316708
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者王慶, 曾偉偉, 劉春 , 李凱彬, 王芳, 王英英, 石存斌, 吳淑勤 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所