專利名稱：一種鑒定瓠瓜類型砧木品種真實性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬站4號’和‘甬站5號’真實性的一種鑒定方法。
背景技術(shù)：
西瓜枯萎病引發(fā)連作障礙，在瓜類種植區(qū)普遍發(fā)生，是瓜類生產(chǎn)的重大難題。據(jù)統(tǒng)計，每年西瓜枯萎病的發(fā)病率可達10-30%，嚴重地塊甚至絕產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟損失。目前，由于土地資源限制和枯萎病病原菌的頑固性，輪作和化學防治效果不佳，且存在環(huán)境污染和食品安全等問題，因此，嫁接是西瓜生產(chǎn)中用以克服連作障礙和枯萎病的有效手段。甬砧系列是寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院重點針對西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列瓠瓜類型砧木品種。它主要包括甬砧I號(早熟栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧3號(長季節(jié) 栽培西瓜嫁接專用砧木)、甬砧4號(耐溫度逆境西瓜嫁接專用砧木)，和甬砧5號(小果型西瓜嫁接專用砧木)。該系列抗性強、嫁接性能好、對西瓜品質(zhì)無不良影響、產(chǎn)量高，瓜農(nóng)增益明顯。隨著甬砧系列的推廣，鑒別品種真實性對維護生產(chǎn)者和育種者的利益日益重要。然而，目前砧木品種的鑒定多運用種子或植株形態(tài)學鑒定等常規(guī)方法。這些方法耗時長、易受環(huán)境影響、可靠性差，面對品種繁多、外觀表型相似、而遺傳基礎(chǔ)相對狹窄的砧木材料，鑒定真?zhèn)坞y以奏效。石占木新品種‘甬石占I號，、‘甬石占3號，、‘甬石占4號’和‘甬石占5號’至今只作了大田形態(tài)學純度鑒定，尚缺乏便捷有效的品種真實性鑒定方法，對于品種保護還遠遠不夠。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種利用DNA指紋圖譜鑒定甬砧系列瓠瓜類型砧木品種‘甬站I號’、‘甬站3號’、‘甬站4號’和‘甬站5號’品種真實性的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明者提供以下技術(shù)方案采用CTAB法提取‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’及其對照品種的幼葉DNA ;利用4個RAPD引物和3對SSR引物進行PCR擴增(引物名稱與序列表中序列號的對應關(guān)系如表I所示，引物具體序列見本說明書最后一頁所附序列表)；擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。有差異的等位位點，擴增出條帶的記為“1”，同一位置無帶記為“O” ；將這些差異擴增片段轉(zhuǎn)換為由I和O組成的字符串，即構(gòu)成DNA指紋圖譜，用以區(qū)分4份瓠瓜類型砧木品種及其對照。本發(fā)明的優(yōu)點與常規(guī)形態(tài)鑒定比較，本發(fā)明的鑒定結(jié)果準確可靠、耗時短、不受環(huán)境影響、操作簡單，可以同時鑒定多個品種，方便快捷。
四

圖I為本發(fā)明實施例中，RAPD引物s23、s24、sl48、s255 (左)和SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128(右)在‘甬砧 I 號’、‘甬砧 3 號’、‘甬砧 4 號’、‘甬石占5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增。圖I中左側(cè)四幅圖片自上而下分別是RAro引物s23、s24、sl48、s255在‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬站4號’、‘甬砧5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增;右側(cè)三幅圖片自上而下分別是SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128在‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’及其對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’中的擴增。兩組圖片樣品排列順序自左至右依次為DNA Marker、‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’、‘神通力’和‘京欣砧I號’。圖片左側(cè)標注是DNA marker標準分子量，右側(cè)標注是引物名稱及差異位點所在片段大小。
五具體實施例方式I、取樣播種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’、‘甬砧5號’及其對照，待植株長至5-6片真葉時，采集嫩葉lg，_80°C保存。 2、DNA 提取參照 CTAB 法(見Murray HG, Thompson WF. Rapid isolation ofhigher weight DNA. Nucleic Acids Res, 1980,8 :4321),提取新鮮葉片總基因組 DNA。3、PCR 擴增RAPD 和 SSR 的混樣體系均為 15 μ I (Fazio G, Staub JE, StevensMR. Genetic mapping and QTL analysis of horticultural traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines. Theor Appl Genet,2003,107 :864-874),包括 1·5μ1 dNTP(l. 25mM), I. 5ul 10 X buffer, I. 5ul MgCl2 (25mM)，2. Oul 引物(5mM ;SSR兩條引物分別添加 1.0ul)，5ul DNA(10ng/ul),0. 05ul Taq (IU)，3. 45ul 超純水。RAPD 的PCR擴增程序為預變性94°C 4min ;變性93°C 15sec，退火37°C lmin30sec，延伸72°C2min(40個循環(huán));延伸72 °C 6min。SSR的PCR擴增程序為預變性94°C Imin ;變性93 °Clmin，退火 40°C lmin，延伸 72°C 2min(40 個循環(huán));延伸 72°C Imin04,PCR產(chǎn)物檢測RAPD擴增產(chǎn)物使用2%普通標準凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍500-20Kbp)，SSR使用2. 5%高分辨率標準凝膠瓊脂糖(DNA片段分離范圍40_lKbp)。添加20 μ I EB (ethidium bromide,溴化乙淀)顯色。在 PCR產(chǎn)物中加入 2μ I Loading Dye,電泳2-3小時，電壓200-250V。電泳結(jié)束后，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。5、數(shù)據(jù)收集與分析對4個RAPD引物s23、s24、sl48、s255和3對SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128 在‘甬砧 I 號’、‘甬砧 3 號’、‘甬砧 4 號’、‘甬砧 5號’及對照材料‘神通力’和‘京欣砧I號’的擴增結(jié)果進行賦值，某等位基因擴增出條帶的記為“1”，同一位點無擴增條帶的記為“O”。將這些差異擴增片段轉(zhuǎn)換為由I和O組成的字符串，即構(gòu)成品種指紋圖譜(表I)。利用7個分子標記產(chǎn)生的11個多態(tài)性位點，構(gòu)建‘甬砧I號’的指紋圖譜為o-i-i-i-o-o-i-o-i-i-o，‘甬砧3號’的指紋圖譜為1-0-0-0-0-0-1-1-0-0-0, ‘甬砧 4 號’的指紋圖譜為 1-1-1-0-1-0-1-0-1-1-0，‘甬砧 5 號’的指紋圖譜為 0-0-1-1-0-0-1-1-0-0-1，‘神通力’的指紋圖譜為 0-1-1-0-1-0-1-1-0-0-1，
‘京欣砧I號’的指紋圖譜為0-0-0-0-0-1-0-0-0-1-0。這些指紋圖譜不僅可以有效區(qū)分上述四個品種，還可以將它們從形態(tài)易混淆的相似品種中甄別出來，起到品種鑒定與保護的作用。表I供試瓠瓜類型砧木品種及對照編號、名稱和RAPD/SSR指紋圖譜
權(quán)利要求
1.本發(fā)明用以鑒定‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’所使用的方法。本發(fā)明利用4個RAro引物(SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4)和3對SSR引物(SEQ IDNO. 5-SEQ ID NO. 10)，對瓠瓜類型砧木品種‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’及對照進行PCR擴增，擴增產(chǎn)生的11個差異位點經(jīng)過“I”和“O”的賦值，構(gòu)建品種DNA指紋圖譜用以真實性鑒定。發(fā)明者提供的技術(shù)方案與鑒定指標模糊、鑒定結(jié)果易受環(huán)境影響的常規(guī)形態(tài)學鑒定相比，具有鑒定手段靈敏、時間人工成本低、結(jié)果準確等優(yōu)點，且對于批量材料的鑒定更方便。請求對以下權(quán)利進行保護
2.本發(fā)明用以鑒定‘甬砧I號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’所使用的4個RAPD 引物和 3 對 SSR 引物的序列，包括 SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10。
全文摘要
本發(fā)明題為《一種鑒定‘甬砧1號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’品種真實性的方法》，屬于生物領(lǐng)域。鑒別品種真實性對維護生產(chǎn)者和育種者的利益日益重要。砧木品種繁多外觀相似，利用形態(tài)指標甄別真?zhèn)?，耗時長可靠性差。為此，發(fā)明一種利用分子標記鑒定砧木品種真實性的方法成為當務之急。技術(shù)方案為利用4個RAPD引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4)和3對SSR引物(SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.10)，對四個品種及對照進行PCR擴增，產(chǎn)生的11個差異位點經(jīng)過“1”和“0”賦值，構(gòu)建品種指紋圖譜用以真實性鑒定。發(fā)明以更靈敏的鑒定手段、更低的時間人工成本，對瓠瓜類型砧木品種‘甬砧1號’、‘甬砧3號’、‘甬砧4號’和‘甬砧5號’進行更準確更有效的鑒定與保護。
文檔編號C12Q1/68GK102925551SQ20121031865
公開日2013年2月13日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者宋慧, 王毓洪, 張香琴, 應泉盛, 王迎兒, 嚴蕾艷 申請人:寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院