專利名稱：甘藍型油菜中一個新的甜菜堿醛脫氫酶基因BnBADH-1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明尤其涉及的是一種甘藍型油菜中一個新的甜菜堿醛脫氫酶基因BnBADH-1。
背景技術(shù)：
甜菜堿是高等植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑，可以保護生物大分子在高電解質(zhì)濃度下不變性，維持細胞的膨壓，不干擾細胞的結(jié)構(gòu)和功能，并且在脅迫解除后的恢復(fù)期間具有加速蛋白質(zhì)合成的作用，有利于提高植物對干旱脅迫或鹽脅迫的耐受性。甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)是高等植物體內(nèi)合成甜菜堿的重要的關(guān)鍵酶。甘藍型油菜是我國最重要的油料作物之一，我國的油菜種植面積和總產(chǎn)量位于世界首位。干旱脅迫往往嚴重影響油菜的產(chǎn)量。所以研究橄欖形油菜BADH基因就具有重要的理論和實踐意義。 與甘藍型油菜親緣關(guān)系較近的模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)體內(nèi)BADH基因家族至少有2個基因成員。即BADHl (ALDH10A8)和BADH2 (ALDH10A9)。NCBI數(shù)據(jù)庫上已知的油菜BADH (AY351634)基因，其序列與擬南芥BADH2(ALDH10A9)同源性達到90%以上，認為油菜BADH(AY351634)是擬南芥BADH2(ALDH10A9)的同源基因。但是擬南芥BADHl (ALDH10A8)在油菜體內(nèi)的同源基因未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
從甘藍型油菜種克隆到了一個新的BADH基因序列命名為BnBADH-1。甘藍型油菜中一個新的甜菜堿醛脫氫酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。我們將從甘藍型油菜種克隆到了一個新的BADH基因序列命名為BnBADH-I。BnBADH-I與擬南芥BADH I (ALDH10A8)相比對，核酸序列具有90. 24%的同源性，而氨基酸序列具有93. 41 %同源性。BnBADH-I與GeneBank現(xiàn)有的另一個油菜的BADH (AY351634)核酸序列同源性為75. 79%，氨基酸序列同源性為77. 93%。所以這是不同于AY351634的另一個新的基因。


圖I為油菜BnBADH-I基因的擴增電泳圖。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板做PCR擴增得到的BnBADH-I片段。M DNA marker DL 2000 ；1 :油菜BADH-I基因片段；圖 2 為載體 pEASY-T-BnBADH-Ι 的 PCR 檢測電泳圖。M :DNA marker DL 2000 ; I，2 :挑取的2個陽性菌落的PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。①無菌苗的獲得將甘藍型油菜種子經(jīng)75%乙醇浸泡lmin，O. 1%升汞浸泡8min消毒處理后，用滅菌水反復(fù)洗3、次,然后置于MS固體培養(yǎng)基上；于人工氣候箱內(nèi)25° C,相對濕度70%，16h光照/8h黑暗的條件下生長。②油菜總RNA的提取及總cDNA的合成取萌發(fā)后約3周左右的油菜葉片，采用Trizol試劑盒提取總RNA ;所得的總RNA用RNase-free DNase I去掉殘余DNA后,再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成第一鏈cDNA :用Oligo (dT) 18引物進行反轉(zhuǎn)錄,經(jīng)42 ° C孵育30 min后，85 ° C加熱5 min使酶失活。所得的cDNA在-20° C保存，以備后續(xù)PCR使用。③基因全長的擴增PCR體系按cDNA I μ L, dNTP 2 μ L, buffer(含 Mg2+)2 μ L,上下游引物(B-1: 5’ -ATGGCGATTCCGATGCCTACTC-3’ ；B-2:5，-TTAGTTGGGAGATTTGTACCAT-3，)各 I μ L，酶 TansTaq-T O. 2 μ L, ddH20 12. 8 μ L (共20 μ L)混合，其程序為95° C預(yù)變性5 min,反應(yīng)36個循環(huán)95° C 30 sec, 53° C 30 sec, 72° C lmin 30 sec,然后72° C終延伸8 min，4° C終止反應(yīng)并保存。④上一步的PCR產(chǎn)物經(jīng)由2%瓊脂糖凝膠電泳后，回收大小正確的片段(圖1)，直接連接在T載體pEASY-Tl Simple上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并涂布LB+Amp固體培養(yǎng)基平板。37° C隔夜培養(yǎng)后，挑取形狀規(guī)則的白斑，于LB+Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并做菌落PCR，體系和程序同上。將擴增出大小正確條帶(圖2)的菌液送交測序(SEQ ID N0:1)。序列結(jié)果DNAman軟件進行分析。應(yīng)當理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種甘藍型油菜中一個新的甜菜堿醛脫氫酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘藍型油菜中一個新的甜菜堿醛脫氫酶基因BnBADH-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。我們將從甘藍型油菜種克隆到了一個新的BADH基因序列命名為BnBADH-1。BnBADH-1與擬南芥BADH 1(ALDH10A8) 相比對，核酸序列具有90.24%的同源性，而氨基酸序列具有93.41 %同源性。BnBADH-1與GeneBank現(xiàn)有的另一個油菜的BADH(AY351634)核酸序列同源性為75.79%，氨基酸序列同源性為77.93%。所以這是不同于AY351634的另一個新的基因。
文檔編號C12N9/02GK102816776SQ201210319630
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者蔣梁材, 柴靚, 李浩杰, 蒲曉斌, 張錦芳, 蔣俊 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所