專利名稱：一種溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，適用于空間搭載細(xì)胞培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
隨著中國航天事業(yè)的發(fā)展，空間生物學(xué)效益的研究越來越深入，目前利用返回式衛(wèi)星和神舟飛船搭載植物種子和微生物已進(jìn)行了大量研究，但對于人和動物細(xì)胞，由于培養(yǎng)條件所限，研究的較少，特別是經(jīng)過衛(wèi)星和飛船搭載得到活細(xì)胞的研究更是鮮有報道。由于飛行器在發(fā)射和入軌前條件較為復(fù)雜，會使細(xì)胞受到影響，研究人員往往希望在此階段細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，在飛行器入軌后再對細(xì)胞進(jìn)行激活。目前國內(nèi)也有一些細(xì)胞搭載培養(yǎng)裝置，但都需要航天員人工操作，需要航天員定時加入激活劑以保證在軌階段 細(xì)胞的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的的目的在于提供一種溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過溫度控制進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，工藝步驟如下I.微載體準(zhǔn)備稱取100-500毫克微載體(由纖維素、粘多糖、膠原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一種或幾種制成)于離心管中，加入10-40毫升磷酸鹽緩沖液(DPBS，由1-8克/升的氯化鈉、0. 1-0. 2克/升的氯化鉀、1-2克/升的磷酸氫二鈉、0. 1-0. 2克/升的磷酸二氫鉀制成)，室溫浸泡1-4小時后，更換新的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗2次后，去除磷酸鹽緩沖液，放入高壓滅菌鍋115-121°C滅菌15-30分鐘。取出后去除多余水分，加入含體積百分?jǐn)?shù)5-10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基平衡10_24h，得到可以用于細(xì)胞生長的微載體；2.細(xì)胞接種取處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞如小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)、腎上皮細(xì)胞(293細(xì)胞)、人肺癌細(xì)胞(H1299)等，或原代培養(yǎng)細(xì)胞如人皮膚成纖維細(xì)胞(ESF細(xì)胞)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3-L1細(xì)胞)，細(xì)胞數(shù)量為1-10 X IO6個，用0. 05-0. 25% (體積百分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶消化后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，使用含1-15% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清的完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為0. 5-2 X IO5個細(xì)胞/毫升，加入步驟I得到的可用于細(xì)胞生長的微載體，使其濃度為1-10毫克/毫升，得到細(xì)胞與微載體的混合物。將該混合物置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中，1-5小時內(nèi)每15-30分鐘搖晃一次培養(yǎng)皿，使細(xì)胞與微載體完全接觸。培養(yǎng)4-16小時后,細(xì)胞已全部貼附于微載體上生長；3.細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制將步驟2得到的已生長于微載體上的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中，加入含1%或10%(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清的完全培養(yǎng)基，蓋上蓋子，封口膜封口，分別放置于20-25°C及37°C溫度控制器內(nèi)。
4.細(xì)胞增殖情況檢測生長于微載體上的細(xì)胞，在20-25°C及37°C溫度控制器內(nèi)放置24-240小時后，取出搖勻，取100-1000微升細(xì)胞懸液，加入1-15% (體積百分?jǐn)?shù))的CCK-8，25-37°C孵育1-4小時，取上清液于酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀在450-550納米波長下檢測上清液的OD值，OD值反應(yīng)細(xì)胞的増殖。此時細(xì)胞不増殖，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，但仍有活性。將含I %胎牛血清的培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將溫度控制器升溫至37°C繼續(xù)培養(yǎng)24-240小時，取100-1000微升細(xì)胞懸液用上述CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖情況，此時細(xì)胞已開始増殖，且與一直放置于37°C培養(yǎng)的對照組細(xì)胞沒有顯著差異。本發(fā)明所述的微載體為球形，直徑在60-87微米。 本發(fā)明所述的所述的CCK-8是一種用于測定細(xì)胞増殖或毒性實驗中活細(xì)胞數(shù)目的高靈敏度的比色檢測法，其顏色變化與細(xì)胞數(shù)量成正比。本發(fā)明的優(yōu)點在于，在一些特殊條件下，如空間細(xì)胞搭載時，在飛行器入軌前，通過溫度控制，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞不受外界環(huán)境影響，飛行器入軌后再通過溫度控制激活細(xì)胞，這樣不僅能獲得較多的活細(xì)胞，保證了有足夠的實驗材料進(jìn)行后續(xù)實驗，同時細(xì)胞只受空間環(huán)境的影響，減少了在飛船入軌前細(xì)胞受到的影響，更能準(zhǔn)確反應(yīng)空間環(huán)境對細(xì)胞的影響，同時不需要航天員額外的操作，較少了航天員的工作量及工作難度。


圖I為B16細(xì)胞使用溫度控制方法培養(yǎng)細(xì)胞的増殖。圖2為ESF細(xì)胞使用溫度控制方法培養(yǎng)細(xì)胞的増殖。在20_23°C培養(yǎng)5天后，B16細(xì)胞和ESF細(xì)胞基本不增殖，處于休眠狀態(tài)，但細(xì)胞仍有活性。使用I %胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的B16細(xì)胞，也無明顯増殖，但在升溫至37°C前需換用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。在37°C放置的細(xì)胞有明顯増殖。當(dāng)溫度控制器升溫到37°C后，原來放于20-23°C的細(xì)胞被激活，開始增殖。
具體實施例方式實施例I.微載體準(zhǔn)備稱取500毫克微載體于離心管中，加入40毫升磷酸鹽緩沖液，室溫浸泡2小時后，更換新的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗2次后，去除磷酸鹽緩沖液，放入高壓滅菌鍋120°C滅菌20分鐘。取出后去除多余水分，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基平衡16h，得到可以用于細(xì)胞生長的微載體；2.細(xì)胞接種取處于對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)以及原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞(ESF細(xì)胞)，用0. 25%的胰蛋白酶消化后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，使用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為I X IO5個細(xì)胞/毫升，加入可用于細(xì)胞生長的微載體，使其濃度為5毫克/毫升，得到細(xì)胞與微載體的混合物。將該混合物置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37°C>5% CO2的培養(yǎng)箱中，3小時內(nèi)每20分鐘搖晃一次培養(yǎng)皿，使細(xì)胞與微載體充分接觸。培養(yǎng)16小時后,細(xì)胞已全部貼附于微載體上生長；
3.細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制將已生長于微載體上的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中，加入含I %或10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，蓋上蓋子，封口膜封口，分別放置于20-23°C及37°C溫度控制器內(nèi)。4.細(xì)胞增殖情況檢測生長于微載體上的細(xì)胞，在20_23°C及37°C溫度控制器內(nèi)放置120小時后，取出搖勻，取180微升細(xì)胞懸液，加入10%的CCK-8，37°C孵育I小時，取上清液于酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀在450納米波長下檢測上清液的OD值，OD值反應(yīng)細(xì)胞的増殖。此時細(xì)胞不増殖，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，但仍有活性。將含I %胎牛血清的完全培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將溫度控制 器升溫至37°C繼續(xù)培養(yǎng)96小時，取180微升細(xì)胞懸液用上述CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖情況，此時細(xì)胞已開始増殖，且與一直放置于37°C培養(yǎng)的對照組細(xì)胞沒有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，工藝步驟如下 (1)微載體準(zhǔn)備 稱取100-500毫克微載體于離心管中，加入10-40毫升磷酸鹽緩沖液DPBS，室溫浸泡1-4小時后，更換新的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗2次后，去除磷酸鹽緩沖液，放入高壓滅菌鍋115-121°C滅菌15-30分鐘；取出后去除多余水分，加入含體積百分?jǐn)?shù)5-10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基平衡10_24h，得到用于細(xì)胞生長的微載體； (2)細(xì)胞接種 取處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞或原代培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量為I-IOXlO6個，用.0.05-0. 25體積％的胰蛋白酶消化后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，使用含1-15體積％胎牛血清的完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為0.5-2X IO5個細(xì)胞/毫升，加入步驟(I)得到的用于細(xì)胞生長的微載體，使其濃度為1-10毫克/毫升，得到細(xì)胞與微載體的混合物；將該混合物置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中，1-5小時內(nèi)每15-30分鐘搖晃一次培養(yǎng)皿，使細(xì)胞與微載體完全接觸；培養(yǎng)4-16小時后,細(xì)胞已全部貼附于微載體上生長； (3)細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制 將步驟(2)得到的已生長于微載體上的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中，加入含I體積％或10體積％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，蓋上蓋子，封口膜封口，分別放置于20-25°C及37°C溫度控制器內(nèi)； (4)細(xì)胞增殖情況檢測 生長于微載體上的細(xì)胞，在20-25°C及37°C溫度控制器內(nèi)放置24-240小時后，取出搖勻，取100-1000微升細(xì)胞懸液，加入1-15體積％的00(-8，25-371孵育1-4小時，取上清液于酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)儀在450-550納米波長下檢測上清液的OD值，OD值反應(yīng)細(xì)胞的増殖。此時細(xì)胞不増殖，細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，但仍有活性； 將含I %胎牛血清的培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，將溫度控制器升溫至.37°C繼續(xù)培養(yǎng)24-240小時，取100-1000微升細(xì)胞懸液用上述CCK-8方法檢測細(xì)胞增殖情況，此時細(xì)胞已開始増殖，且與一直放置于37°C培養(yǎng)的對照組細(xì)胞沒有顯著差異。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的微載體為球形，直徑在60-87微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的所述的CCK-8是一種用于測定細(xì)胞増殖或毒性實驗中活細(xì)胞數(shù)目的高靈敏度的比色檢測法，其顏色變化與細(xì)胞數(shù)量成正比。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的微載體由纖維素、粘多糖、膠原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一種或幾種制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液DPBS由1-8克/升的氯化鈉、0. 1-0. 2克/升的氯化鉀、1-2克/升的磷酸氫二鈉、0. 1-0. 2克/升的磷酸二氫鉀制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞為小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞293細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞H1299。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的原代培養(yǎng)細(xì)胞為人皮膚成纖維細(xì)胞ESF細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞。
全文摘要
一種溫度控制細(xì)胞培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。工藝步驟為微載體準(zhǔn)備、細(xì)胞接種、細(xì)胞培養(yǎng)的溫度控制、細(xì)胞增殖情況檢測。優(yōu)點在于，在一些特殊條件下，如空間細(xì)胞搭載時，在飛行器入軌前，通過溫度控制，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，細(xì)胞不受外界環(huán)境影響，飛行器入軌后再通過溫度控制激活細(xì)胞，這樣不僅能獲得較多的活細(xì)胞，保證了有足夠的實驗材料進(jìn)行后續(xù)實驗，同時細(xì)胞只受空間環(huán)境的影響，減少了在飛船入軌前細(xì)胞受到的影響，更能準(zhǔn)確反應(yīng)空間環(huán)境對細(xì)胞的影響，同時不需要航天員額外的操作，較少了航天員的工作量及工作難度。
文檔編號C12N5/09GK102796704SQ201210320799
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者黨磊, 張美姿, 趙仁濱 申請人:北京天辰空間生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司