一種雙標記重組家蠶桿狀病毒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙標記重組家蠶桿狀病毒及其制備方法和應用，屬于基因工程【技術領域】。該病毒含有桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串聯(lián)基因SP-EGFP-TM，以及桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因和紅色熒光蛋白RFP基因形成的串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP。該病毒的制備方法是將兩段串聯(lián)基因插入到病毒表達載體的多克隆位點，構建成重組桿狀病毒轉座載體，再轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經過藍白斑篩選和PCR鑒定后，得到該病毒。該病毒可作為模式生物用于研究家蠶膿病。
【專利說明】一種雙標記重組家蠶桿狀病毒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學基因工程【技術領域】，具體涉及一種雙標記重組家蠶桿狀病毒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]桿狀病毒是一類在自然界中專一性感染節(jié)肢動物的DNA病毒，病毒粒子呈桿狀，基因組為雙鏈環(huán)狀DNA分子，DNA以超螺旋形式壓縮包裝在桿狀衣殼內，大小在90~180kb之間。家蠶核型多角體病毒是家蠶膿病的病原體，對于桿狀病毒的研究大多數(shù)集中在苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)，而對于家蠶核型多角體病毒(BmNPV，又稱家蠶桿狀病毒)的研究的報道甚少，所以開展家蠶核型多角體病毒的侵染機制的研究對于防治家蠶膿病具有重要的意義。
[0003]桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是在對病毒基因組結構和功能深刻認識的基礎上發(fā)展起來的。桿狀病毒表面展示系統(tǒng)以桿狀病毒為載體，外源基因片段插入到病毒衣殼蛋白的信號肽與成熟蛋白之間，與衣殼蛋白融合表達或與特異性的錨定部位結合表達。融合蛋白經過真核細胞內質網加工后，信號肽被切除，形成N端融合蛋白，借助桿狀病毒穩(wěn)定地表達并展示于感染細胞或病毒粒子的表面，篩選得到表達有特異目的蛋白的桿狀病毒粒子。外源蛋白或多肽也可與桿狀病毒的囊膜糖蛋白融合，利用桿狀病毒作為載體而在感染細胞的表面或病毒粒子的囊膜上獲得有效的展示。在桿狀病毒表面展示中，用于與外源蛋白發(fā)生融合的囊膜糖蛋白gp64是AcMNPV、BmNPV等I型出芽病毒特有的結構蛋白，與二硫鍵相連以同源二聚體、三聚體或四聚體的方式存在于囊膜內及被感染細胞或病毒粒子的表面，介導病毒和昆蟲細胞的融合與侵染過程。AcMNPV中gp64基因全長約512bp，是I型跨膜糖蛋白，屬于磷酸糖基化蛋白，含有2個高度疏水區(qū)，N端為帶有一個內質網加工的信號肽序列，近C端是一個疏水的跨膜結構域(transmembrane domain, TM),與TM相連的是親水性結構域，可以把病毒囊膜內的糖蛋白與細胞膜內的糖蛋白連接在一起。外源蛋白在信號肽的C端與gp64的N端發(fā)生融合，融合蛋白經過真核細胞內質網加工后，信號肽被切除，形成的N端融合蛋白可穩(wěn)定地在桿狀病毒表面進行`表達，形成桿狀病毒“假病毒”。另外，也有將目的蛋白融合于gp64的膜錨定結構域中，即將目的基因插入到gp64基因的ORF中，這種做法雖然破壞了 gp64的完整性，但可以實現(xiàn)目的蛋白的表達展示。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是現(xiàn)有技術中還沒有一種模式生物可以用于研究核型多角體病毒對宿主的侵入機制及后續(xù)防治該病毒藥物的研制。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種雙標記重組家蠶桿狀病毒，該病毒含有桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串聯(lián)基因SP-EGFP-TM，以及桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因和紅色熒光蛋白RFP基因形成的串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP。[0006]優(yōu)選地，所述串聯(lián)基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串聯(lián)基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0007]上述雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，步驟如下:
[0008](I)依次串聯(lián)桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串聯(lián)基因SP-EGFP-TM ;串聯(lián)桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因序列和紅色熒光蛋白RFP基因序列，形成串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP ；
[0009](2)將串聯(lián)基因 SP-EGFP-TM 和 RFP-VP39，或 SP-EGFP-TM 和 VP39-RFP 插入到病毒表達載體的多克隆位點，構建成重組桿狀病毒轉座載體；
[0010](3)重組桿狀病毒轉座載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)40~48小時，挑取白斑，培養(yǎng)20~24小時后抽提基因組進行PCR鑒定，鑒定正確的為雙標記重組家蠶桿狀病毒。
[0011]優(yōu)選地，步驟(1)桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因的擴增引物為SEQ IDN0:4~5，桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的擴增引物為SEQ ID N0:6~7，增強型綠色熒光蛋白EGFP基因的擴增引物為SEQ ID N0:8、，紅色熒光蛋白RFP基因的擴增引物為SEQ ID N0:l(Tll或SEQ ID NO: 12~13，桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因的擴增引物為SEQ IDNO:14~15 或 SEQ ID NO:16~17。
[0012]優(yōu)選地，步驟(2)所述病毒表達載體為pFastBac-Dual。
[0013]優(yōu)選地，步驟(2)所述串聯(lián)基因SP-EGFP-TM插入到載體pFastBac-Dual的PplO啟動子后的多克隆位點；串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到載體pFastBac-Dual的PpH啟動子后的多克隆位點。
[0014]優(yōu)選地，串聯(lián)基因SP-EGFP-TM是通過Sma I和Xho I雙酶切位點插入的；串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP是通過BamH I和EcoR I雙酶切位點插入的。
[0015]優(yōu)選地,步驟(2)所述大腸桿菌為DHlOBac。
[0016]優(yōu)選地，步驟(3)所述PCR的擴增引物如SEQ ID N0:18~19所示。
[0017]本發(fā)明所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒作為家蠶核型多角體病毒模式生物的應用。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0019]GP64是野生型家蠶桿狀病毒的囊膜糖蛋白，野生型的病毒將GP64蛋白表面展示在囊膜上，本發(fā)明改造的病毒繼續(xù)用GP64的信號肽(SP)和跨膜區(qū)(TM)，中間的展示蛋白將原先的GP64改成綠色熒光標記蛋白EGFP，這樣就將EGFP表面展示在囊膜上。同理，紅色熒光蛋白RFP被表達在核衣殼上。
[0020]病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39基因組與野生BmNPV基因組的區(qū)別在于兩個轉座子Tn7L、Tn7R之間的基因序列不同，在本發(fā)明的重組載體pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP-VP39中，轉座子Tn7L、Tn7R之間的基因序列與野生BmNPV的轉座子Tn7L、Tn7R之間的基因序列發(fā)生了同源重組，那么，本發(fā)明的目的基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39 (或VP39-RFP)就交換到了野生BmNPV基因組上，產生的病毒就是帶有熒光蛋白標記的重組病毒。[0021]本發(fā)明的重組病毒是利用雙色熒光蛋白對病毒衣殼及囊膜蛋白進行熒光標記，能夠更清楚地觀察到桿狀病毒侵染復制的全過程，采用全球先進的顯微設備(萊卡三通道激光共聚焦顯微鏡，電子顯微鏡)對病毒的入侵，表達，組裝進行實時監(jiān)控，更直觀的理解病毒的侵染機制?？梢酝ㄟ^該病毒研究其他展示蛋白在宿主細胞中的表達、加工展示過程情況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1 是重組轉移質粒 pFastBac-Dual-gp64-EGFP-RFP_VP39 結構示意圖。
[0023]圖2是原始質粒pFastBac-Dual圖譜示意圖。
[0024]圖3是串聯(lián)基因SP-EGFP-TM的重疊及鑒定結果，其中左圖M =DNA標準分子量，I:SP-EGFP重疊基因，2 =SP-EGFP-TM重疊基因；右圖M:DNA標準分子量，I =SP-EGFP-TM的PCR擴增產物，2:pFastBac-Dual-SP-EGFP-TM的雙酶切產物。 [0025]圖4是VP39與RFP的重疊及鑒定結果，M為DNA標準分子量，其中左圖1:使用引物對VP39.1擴增所得的VP39產物，2:使用引物對RFP.1擴增所得的RFP產物，3:使用引物對RFP.2產物，4:VP39.2PCR產物；中間圖中1:VP39_RFP重疊基因，2:RFP_VP39重疊基因；右圖中1:RFP-VP39重疊基因PCR擴增產物，2:RFP-VP39重疊基因雙酶切產物。
[0026]圖5是家蠶重組桿狀病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39激光共聚焦顯微圖，其中紅色顯示為紅色熒光蛋白RFP標記的桿狀病毒衣殼蛋白VP39，綠色顯示為增強型綠色熒光蛋白EGFP標記的桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0028]生物材料來源:pFastBaC-Dual載體、大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞和大腸桿菌DHlOBac購自Invitrogen公司；野生家蠶桿狀病毒BmNPV、含EGFP的重組載體、含有紅色熒光蛋白RFP基因的質粒均由本實驗室保存。
[0029]因gp64信號肽(SP)基因序列(SEQ ID NO: 20)、gp64跨膜區(qū)(TM)基因序列(SEQID N0:21)、桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因(SEQ ID N0:22)、EGFP蛋白的基因(SEQ ID NO:23)和RFP的基因(SEQ ID N0:24)均為現(xiàn)有已知基因序列，所以本發(fā)明使用的提供上述基因的載體如野生家蠶桿狀病毒BmNPV、含EGFP的重組載體何含有紅色熒光蛋白RFP基因的質粒可以更換成任何其他含有上述基因的生物材料。
[0030]實施例1家蠶重組桿狀病毒株Bmgp64EGFP-RFPVP39的制備
[0031](I) gp64信號肽(SP)基因的擴增
[0032]以野生家蠶桿狀病毒BmNPV的基因組為模板，分別用引物P1、P2進行PCR，擴增gp64的信號肽(SP)基因序列。PCR反應參數(shù)設為:98°C預變性5min，98°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s, 30個循環(huán)，72°C總延伸5min。
[0033]Pl:ACACCCGGGATGGTAGGCGCTATTG (SEQ ID N0:4)；
[0034]P2:CCTCGCCCTTGCTCACCGCCGCAAAGGCAGAATG (SEQ ID NO:5)。
[0035]反應體系如下:
【權利要求】
1.一種雙標記重組家蠶桿狀病毒，其特征在于，該病毒含有桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串聯(lián)基因SP-EGFP-TM，以及桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因和紅色熒光蛋白RFP基因形成的串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP。
2.根據(jù)權利要求1所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒，其特征在于，所述串聯(lián)基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串聯(lián)基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
3.權利要求1或2所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)依次串聯(lián)桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串聯(lián)基因SP-EGFP-TM ;串聯(lián)桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因序列和紅色熒光蛋白RFP基因序列，形成串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP ； (2)將串聯(lián)基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表達載體的多克隆位點，構建成重組桿狀病毒轉座載體； (3)重組桿狀病毒轉座載體轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)40~48小時，挑取白斑，培養(yǎng)20~24小時后抽提基因組進行PCR鑒定，鑒定正確的為雙標記重組家蠶桿狀病毒。
4.根據(jù)權利要求3所 述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟(1)桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因的擴增引物為SEQ ID NO:4飛，桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的擴增引物為SEQ ID NO: 6~7，增強型綠色熒光蛋白EGFP基因的擴增引物為SEQ ID NO: 8~9，紅色熒光蛋白RFP基因的擴增引物為SEQ ID NO: l(Tll或SEQ ID NO: 12~13，桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因的擴增引物為SEQ ID NO: 14~15或SEQ IDNO:16~17。
5.根據(jù)權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟(2)所述病毒表達載體為pFastBac-Dual。
6.根據(jù)權利要求5所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟(2)所述串聯(lián)基因SP-EGFP-TM插入到載體pFastBac-Dual的Ppltl啟動子后的多克隆位點；串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到載體pFastBac-Dual的PpH啟動子后的多克隆位點。
7.根據(jù)權利要求6所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于串聯(lián)基因SP-EGFP-TM是通過5-- I和通ο I雙酶切位點插入的；串聯(lián)基因RFP-VP39或VP39-RFP是通過I和I雙酶切位點插入的。
8.根據(jù)權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟(2)所述大腸桿菌為DHlOBac。
9.根據(jù)權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟(3)所述PCR的擴增引物如SEQ ID NO: 18~19所示。
10.權利要求1或2所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒作為家蠶核型多角體病毒模式生物的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK103667348SQ201210321448
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月3日 優(yōu)先權日:2012年9月3日
【發(fā)明者】張耀洲, 王俊祥, 陳劍清, 舒特俊 申請人:天津耀宇生物技術有限公司