專(zhuān)利名稱(chēng)：改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法
改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法本申請(qǐng)是中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)No. 200780026810. 2的分案申請(qǐng)。母案申請(qǐng)日為2007年7月4日，發(fā)明題目為“改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法”。本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝。此類(lèi)工藝?yán)鐝腤004/099396已知。該文中描述了如何通過(guò)優(yōu)化補(bǔ)料分批工藝中的生長(zhǎng)條件來(lái)提高細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞密度和想要的生物材料的產(chǎn)率。此外，W005/095578公開(kāi)了一種培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，其通過(guò)對(duì)包含細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)灌注培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過(guò)濾器模塊上循環(huán)，導(dǎo)致產(chǎn)生比細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞密度更低的液體流出物，并且過(guò)濾器模塊內(nèi)部的流是交互切向流(alternating tangential flow),其 中，所述細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)。在W005/095578的實(shí)施例中顯示，生產(chǎn)了 O. 9g/L/天的產(chǎn)物，這對(duì)應(yīng)于流出物中大約O. 3g/L的產(chǎn)物濃度。含生物物質(zhì)的液體體積越大，對(duì)生物物質(zhì)的純化就越費(fèi)力。W004/099396和W005/095578公開(kāi)的工藝中，獲得的生物物質(zhì)的濃度并不高。因此，對(duì)該生物物質(zhì)的下游加工是麻煩的，因?yàn)樾枰趹?yīng)用后續(xù)純化步驟之前對(duì)生物物質(zhì)加以濃縮，或者需要對(duì)大體積、低濃度的生物物質(zhì)加以純化。因此，以較低的細(xì)胞密度培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致體積生產(chǎn)力(productivity)較低，因此對(duì)給定的生產(chǎn)水平需要更大和/或更多的培養(yǎng)容器以及由此需要在裝備上投入更多。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種工藝，其中，以更高的濃度從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得產(chǎn)物。本發(fā)明的另一目的是使得能夠在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)生物材料。這些目的通過(guò)在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞的如下工藝來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將生物物質(zhì)與比所述生物物質(zhì)分子量更低的物質(zhì)分開(kāi)，并且，其中，所述生物物質(zhì)保留在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器。例如，本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)，其中，向所述反應(yīng)器補(bǔ)料營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基，并且，其中，包含細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在孔徑或分子量分離點(diǎn)在5至500kD之間的過(guò)濾器上循環(huán)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用將生物物質(zhì)與分子量比生物物質(zhì)低的物質(zhì)相分離的分離系統(tǒng)，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中以更高濃度積累生物物質(zhì)。因此，本發(fā)明不同于現(xiàn)有技術(shù)描述的細(xì)胞培養(yǎng)，其允許想要的生物材料與細(xì)胞物質(zhì)一起積累。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，更低分子量的物質(zhì)的一部分持續(xù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中移出。本發(fā)明的工藝的另一優(yōu)點(diǎn)在于，較之例如分批或補(bǔ)料分批工藝，可以達(dá)到更高的存活細(xì)胞濃度。此外，較之例如分批或補(bǔ)料分批工藝，生產(chǎn)時(shí)間(即細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)的時(shí)間段)可被延長(zhǎng)。此外，較之分批或補(bǔ)料分批工藝，有可能使用更小的反應(yīng)器。使用更小的反應(yīng)器是有益的，因?yàn)檫@降低了裝備和設(shè)施相關(guān)的投入。此外，可在更短的時(shí)間內(nèi)獲得更高濃度的生物物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，可在反應(yīng)器內(nèi)獲得高濃度的生物物質(zhì)，而不會(huì)顯著減少細(xì)胞存活性以及因此不需限制生產(chǎn)時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能預(yù)計(jì)到，將可能發(fā)生產(chǎn)物抑制，即，生物物質(zhì)自身對(duì)生物物質(zhì)生產(chǎn)的抑制，或者細(xì)胞產(chǎn)生的其它大分 子(例如，宿主細(xì)胞蛋白、酶或細(xì)胞殘骸)造成的抑制。此外，我們發(fā)現(xiàn)，想要的生物材料的積累不會(huì)損害分離系統(tǒng)的功能。本發(fā)明的工藝在細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)物濃度以及延長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間等方面，較之根據(jù)W005/095578和W004/099396的工藝提供了相當(dāng)大的好處。由此，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致了對(duì)想要的生物材料的改進(jìn)的生產(chǎn)。可用于生產(chǎn)生物物質(zhì)的細(xì)胞原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能生產(chǎn)生物產(chǎn)物的所有細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是真核的，例如，有絲真菌，例如，Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Penicillium chrysogenum,酵母，例如Saccharomyces cerevis iae> Kluyveromyces lactis、Phaffia rhodozyma,來(lái)自 Pichia屬的酵母，例如，Pichia pastoris,或原核的,例如，Escherichia coli、Bacillus sp,例如，B. lichen 和 rmis、B. subtilis、B. amyloliquefaciens>B. alkalophilus、Streptomycessp.、Corynebacterium glutamicum>Pseudomonas sp。真核細(xì)胞的例子還例如描述于 Chu,L. , Robinson,D. K.，(2001) Curr. Opinion Biotechn. , vol. 12,p. 180-187 中。優(yōu)選地，用于本發(fā)明工藝中的細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包括CHO (中華倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞、雜交瘤、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、人細(xì)胞(例如HEK-293細(xì)胞、人淋巴母細(xì)胞)、E1永生化的HER細(xì)胞、小鼠細(xì)胞(例如NSO細(xì)胞)。更優(yōu)選地，使用El永生化的HER細(xì)胞，最優(yōu)選使用PER. C6細(xì)胞?？蓮奶悍蛛x初級(jí)人胚視網(wǎng)膜(HER)細(xì)胞(Byrd P, Brown Kff, GallimorePH.1982.Malignant transformation of human embryo retinoblasts by clonedadenovirus 12 DNA. Nature298 :69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988.Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirusElregions and combinations of ElA+ras. 0ncogene2 :477-484)。培養(yǎng)若干傳代后，初級(jí)細(xì)胞將死亡。就本發(fā)明的目的而言，El永生化的HER細(xì)胞得自初級(jí)HER細(xì)胞，這是通過(guò)在其中表達(dá)編碼腺病毒ElA和ElB蛋白的DNA，來(lái)獲得永生化細(xì)胞的。這類(lèi)經(jīng)永生化的細(xì)胞可培養(yǎng)超過(guò)100次傳代。用于獲得El永生化HER細(xì)胞的方法例如已被描述于美國(guó)專(zhuān)利 5，994，128,描述于 Byrd P, Brown Kff, Gallimore PH. 1982Malignant transformationof human embryo retinoblasts by cloned adenovirusl2DNA. Nature298 :69-71,描述于 Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primaryhuman embryo retinal cells by adenovirus Elregions and combinations of ElA+ras.0ncogene2 :477-484,且描述于 Gallimore, P. H.，Grand, R. J. A. and Byrd, P. J. (1986).Transformation of humanembryo retinoblasts with simian virus 40,adenovirus andras oncogenes. AntiCancer Res. 6, p499_508 中。例如，通過(guò)用含腺病毒血清型 5 (Ad5)ElA-和ElB-編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒(處于人磷酸甘油酸激酶(“PGK”)啟動(dòng)子控制下)轉(zhuǎn)染初級(jí)HER細(xì)胞，來(lái)產(chǎn)生永生化的HER細(xì)胞，包括PER. Cl、PER. C3、PER.C4、PER. C5、PER. C6、PER. C8 和 PER. C9 細(xì)胞(見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利 5，994，128)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明工藝中的細(xì)胞是El-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選地，是PER. C6細(xì)胞(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，994，128)。PER. C6細(xì)胞的例子是以ECACC No. 96022940保藏的細(xì)胞(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5，994，128、EP0833934B1)。在本發(fā)明的工藝中，可以在懸浮液中對(duì)任何形式的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，例如，作為被固定的細(xì)胞、單個(gè)細(xì)胞或在細(xì)胞簇中或者作為其組合。優(yōu)選地，細(xì)胞作為單個(gè)細(xì)胞和/或作為不超過(guò)100個(gè)細(xì)胞(更優(yōu)選不超過(guò)20個(gè)細(xì)胞)的小細(xì)胞簇被培養(yǎng)。細(xì)胞例如可被固定到微載體上，例如，可從例如GE Healthcare商業(yè)獲得的微載體(Cytodex)。反應(yīng)器在本文中被定義為包含細(xì)胞培養(yǎng)物的系統(tǒng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)而包含細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基。其優(yōu)選提供無(wú)菌屏障，例如空氣過(guò)濾器，以防止其它細(xì)胞污染想要的細(xì)胞，并且，其通過(guò)提供正確的培養(yǎng)條件(例如，混合、溫度、pH、氧濃度等)來(lái)保持對(duì) 細(xì)胞有利的環(huán)境。反應(yīng)器例如可以是更為永久的性質(zhì)的，例如，反應(yīng)器可以是不銹鋼或玻璃的，或者例如可以是可棄置的，例如，反應(yīng)器可以是塑料瓶或塑料袋。適合用于本發(fā)明的反應(yīng)器的例子包括但不限于攪拌槽容器、空運(yùn)用(airlift)容器和可棄置容器，它們可通過(guò)搖動(dòng)、振蕩運(yùn)動(dòng)或攪拌來(lái)進(jìn)行混合。優(yōu)選使用可棄置(生物)反應(yīng)器，因?yàn)樗鼈儍H需要相對(duì)低的投資成本，具有強(qiáng)大的操作靈活性、短的周轉(zhuǎn)時(shí)間，并且易于針對(duì)工藝對(duì)其加以配置?？蓷壷?生物)反應(yīng)器可商業(yè)獲得,例如從Hyclone、Sartorius、Applikon或Wave獲得。術(shù)語(yǔ)“分離系統(tǒng)”在本發(fā)明上下文中被定義為能基于分子量進(jìn)行分離的系統(tǒng)。用于本發(fā)明工藝中的分離系統(tǒng)能將生物物質(zhì)與分子量比所述生物物質(zhì)低的物質(zhì)分開(kāi)。換句話(huà)說(shuō)，分子量分離點(diǎn)被選擇為使得所述分子量分離點(diǎn)(MWCO)小于所述生物物質(zhì)的分子量，更優(yōu)選以至少2的因子，最優(yōu)選以至少3的因子小于所述生物物質(zhì)的分子量。典型地，分離系統(tǒng)的MWCO優(yōu)選為至少5kDa，更優(yōu)選至少I(mǎi)OkDa,最優(yōu)選至少30kDa，優(yōu)選至多500kDa，更優(yōu)選至多300kDa，最優(yōu)選至多IOOkDa,但是當(dāng)然這將取決于本發(fā)明的工藝所生產(chǎn)的生物物質(zhì)的分子量。例如，對(duì)于分子量為150kDa的IgG來(lái)說(shuō)，具有至多50kDa的MWCO的分離系統(tǒng)是最優(yōu)選的。分離系統(tǒng)的例子包括但不限于過(guò)濾器、離心機(jī)和水性?xún)上噍腿∠到y(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“過(guò)濾器”在本文中使用時(shí)表示包括具有基于分子量或大小來(lái)分離顆粒的能力的所有設(shè)備。原則上，在本發(fā)明的工藝中，任何過(guò)濾器都可使用，只要選用的孔徑或MWCO能使得生物物質(zhì)與分子量比生物物質(zhì)低的物質(zhì)分開(kāi)即可，典型地，這將是5至500kDa之間的MWCO或孔徑。適合用于本發(fā)明的過(guò)濾器的例子包括膜過(guò)濾器、陶瓷過(guò)濾器和金屬過(guò)濾器。過(guò)濾器可以以任何形式來(lái)使用，過(guò)濾器可以例如是螺旋卷繞狀(spiral wound)或管狀的，或者可以以片狀形式使用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝中，所用的過(guò)濾器是膜過(guò)濾器，優(yōu)選地，中空纖維過(guò)濾器。術(shù)語(yǔ)“中空纖維”表示管狀的膜。所述管的內(nèi)徑為至少0. 1mm，更優(yōu)選為至少0. 5mm,最優(yōu)選為至少0. 75mm,優(yōu)選地,管的內(nèi)徑至多IOmm,更優(yōu)選至多6mm,最優(yōu)選至多1mm。包含中空纖維的過(guò)濾器模塊可從例如General Electric (GE,以前的Amersham)商業(yè)獲得。通過(guò)將包含生物物質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，生物物質(zhì)和細(xì)胞留在反應(yīng)器中，液體流出物因此比具有比細(xì)胞培養(yǎng)物更低的生物物質(zhì)含量和更低的細(xì)胞密度。通常，在本發(fā)明的工藝中，液體流出物不含或很少含任何生物物質(zhì)和細(xì)胞。通常，液體流出物基本上僅含分子量比所述生物物質(zhì)低的組分。因此，基本上所有細(xì)胞和基本上所有生物物質(zhì)通常都留在反應(yīng)器中。優(yōu)選地，過(guò)濾器的孔徑或MWCO被選擇為使得過(guò)濾器的孔徑或MWCO比產(chǎn)物的直徑或分子量要小，更優(yōu)選以至少2的因子，最優(yōu)選至少3的因子小，以確保產(chǎn)物的高駐留。典型地，分離系統(tǒng)的孔徑或MWCO優(yōu)選為至少5kDa，更優(yōu)選至少I(mǎi)OkDa,最優(yōu)選至少30kDa，和/或所述過(guò)濾器/膜的孔徑或MWCO優(yōu)選至多500kDa，更優(yōu)選至多300kDa，最優(yōu)選至多IOOkDa，但是當(dāng)然這將取決于本發(fā)明的工藝所生產(chǎn)的生物物質(zhì)的分子量。分子量分尚點(diǎn)(MWCO)表不分子量大于其的顆粒中至少90%都留在分尚系統(tǒng)中。將細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)(例如過(guò)濾器)上循環(huán)表示細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)分離系統(tǒng)(例如過(guò)濾器)，產(chǎn)生液體流出物和其中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或回送進(jìn)反應(yīng)器的流。其中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或回送進(jìn)反應(yīng)器的流通?；旧蟽H含分子量至少等 于生物物質(zhì)或分子量更高的組分，因此所述的流將比液體流出物包含更多的生物物質(zhì)。原則上，在本發(fā)明的工藝期間，細(xì)胞培養(yǎng)物何時(shí)在分離系統(tǒng)上循環(huán)并非關(guān)鍵。細(xì)胞培養(yǎng)物的循環(huán)可例如從工藝開(kāi)始時(shí)直接開(kāi)始，或者當(dāng)細(xì)胞的存活細(xì)胞密度達(dá)到某個(gè)水平時(shí)才開(kāi)始。細(xì)胞培養(yǎng)物在過(guò)濾器上的循環(huán)可以是相對(duì)過(guò)濾器表面來(lái)說(shuō)基本垂直的流，這也被稱(chēng)為盡頭(dead-end)流，或其可以是與過(guò)濾器表面基本平行的流，這也被稱(chēng)為切向流，例如單向切向流(TFF)或交叉流(cross-flow)。交叉流的一種優(yōu)選例子是交互切向流(ATF)，因?yàn)椴捎肁TF時(shí)發(fā)現(xiàn)，不會(huì)(迅速)發(fā)生過(guò)濾器阻塞，即使是在非常高的細(xì)胞密度下。通常公知，在深度過(guò)濾中，需要通過(guò)漸進(jìn)的前過(guò)濾器來(lái)保護(hù)最后的小孔徑過(guò)濾器免受阻塞。該實(shí)踐基于下述公知常識(shí)具有較小孔或較小MWCO的的過(guò)濾器更容易阻塞，由此限制了生產(chǎn)時(shí)間。如果使用ATF，那么就不必要使用前過(guò)濾器了?？赏ㄟ^(guò)移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物，或者通過(guò)移動(dòng)過(guò)濾器，或者移動(dòng)兩者，來(lái)引導(dǎo)流。例如可通過(guò)旋轉(zhuǎn)(旋轉(zhuǎn)式過(guò)濾器)或振動(dòng)(振動(dòng)式過(guò)濾器)來(lái)移動(dòng)過(guò)濾器?；蛘?，如果僅通過(guò)移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)引導(dǎo)流，那么過(guò)濾器是靜止的，例如可以通過(guò)泵或壓力來(lái)移動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物?！敖换デ邢蛄鳌北硎?，有一條與過(guò)濾器表面同樣方向(S卩，與其切向)的流，所述的流往復(fù)運(yùn)動(dòng)，并且，還有一條與所述過(guò)濾器表面方向基本垂直的流。交互切向流可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)獲得(例如，如US6，544，424所述)。在對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)期間，至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分,例如,一種或多種營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基，可被補(bǔ)料給細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，部分補(bǔ)充，或者優(yōu)選地，全部補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物中的至少一種是有好處的，這通過(guò)將該營(yíng)養(yǎng)物或這些營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)料至反應(yīng)器來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可向反應(yīng)器補(bǔ)料完全細(xì)胞培養(yǎng)基，這是有好處的，因?yàn)檫@樣就無(wú)須再分別制備單獨(dú)的補(bǔ)料了。細(xì)胞培養(yǎng)基例如還可以更濃縮的形式補(bǔ)料給細(xì)胞，這是有好處的，因?yàn)檩^小的體積更易于操作。此外，可向反應(yīng)器補(bǔ)料一種或多種營(yíng)養(yǎng)物。例如，碳水化合物，例如葡萄糖或果糖；氨基酸，例如谷氨酰胺；和/或肽可有利地補(bǔ)料至反應(yīng)器。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，選用這樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件，使得細(xì)胞生長(zhǎng)速率和/或細(xì)胞的比生產(chǎn)力不受限制，更優(yōu)選地，使得細(xì)胞培養(yǎng)基組分中的至少一種的濃度保持基本上恒定。限制細(xì)胞培養(yǎng)條件的例子是營(yíng)養(yǎng)物限制和抑制性代謝物(例如氨、二氧化碳和乳酸鹽)的形成。例如，細(xì)胞培養(yǎng)條件(例如，補(bǔ)料)可被選擇為使得細(xì)胞生長(zhǎng)速率不受限制，這例如通過(guò)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物以補(bǔ)償消耗和/或避免抑制性代謝物(例如如酸鹽或氨)的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可選用通氣條件，使得二氧化碳形成不會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)速率。從Good Manufacturing Practice (GMP)的觀點(diǎn)來(lái)看,在非限制性條件下培養(yǎng)細(xì)胞是高度有好處的，因?yàn)椋珼這能提供恒定的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，在很多情況下還會(huì)提供恒定、良好的產(chǎn)物品質(zhì)，以及2)這可導(dǎo)致高的細(xì)胞存活率，在一些情況下，導(dǎo)致細(xì)胞存活率超過(guò)98%。高細(xì)胞存活率降低了細(xì)胞相關(guān)污染物(例如宿主細(xì)胞蛋白)的釋放，這有助于對(duì)產(chǎn)物的純化。此外，以不受限制的細(xì)胞培養(yǎng)速率和/或不受限制的比生產(chǎn)力來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞具有商業(yè)優(yōu)點(diǎn)，從而得以在進(jìn)一步更短的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出更多的生物物質(zhì)，因?yàn)?，在所述工藝中可更早達(dá)到更高的細(xì)胞密度。細(xì)胞的“比生產(chǎn)力”是每時(shí)間單位每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的給定生物物質(zhì)的量，其通常被表示為Pg.細(xì)胞^天人向細(xì)胞培養(yǎng)物添加至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分(例如營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基)的速率(流入速率或灌注速率)影響細(xì)胞的存活性和密度。在本發(fā)明的工藝 中，細(xì)胞培養(yǎng)基組分(例如營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基)可例如以連續(xù)的流、半連續(xù)的流(例如分步的流)或間隔的(staggered)流來(lái)補(bǔ)料。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基組分(例如營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基)以連續(xù)的流添加。細(xì)胞培養(yǎng)基組分，例如完全細(xì)胞培養(yǎng)基和/或營(yíng)養(yǎng)物，原則上可以在所述工藝期間的任何時(shí)候補(bǔ)料至反應(yīng)器。優(yōu)選地，補(bǔ)料在谷氨酰胺和葡萄糖等底物達(dá)到低至導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)的水平前啟動(dòng)，或在抑制性代謝物(例如乳酸鹽或氨)達(dá)到高至生長(zhǎng)將停止的水平前啟動(dòng)。從該時(shí)起，細(xì)胞培養(yǎng)基組分(例如營(yíng)養(yǎng)物和/或完全細(xì)胞培養(yǎng)基)優(yōu)選以使得達(dá)到底物需求的速率補(bǔ)料至反應(yīng)器。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基以根據(jù)式(I)的補(bǔ)料速率添加補(bǔ)料速率=SFRX (總細(xì)胞培養(yǎng)物體積)X (存活細(xì)胞密度)(I)其中，補(bǔ)料速率以每天的升數(shù)表示，其中，SFR是比補(bǔ)料速率，S卩，以每時(shí)間單位相對(duì)于每個(gè)存活細(xì)胞添加的培養(yǎng)基體積表示的細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)料至細(xì)胞培養(yǎng)物的速率，其中，存活細(xì)胞密度是每體積單位存活細(xì)胞的數(shù)量。存活細(xì)胞的數(shù)量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)測(cè)定，例如，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)排除方法。比補(bǔ)料速率優(yōu)選被選擇為O. 01至O. 3nL/細(xì)胞/天之間，更優(yōu)選在O. 01至O. 2nL/細(xì)胞/天之間。調(diào)節(jié)補(bǔ)料速率時(shí)考慮到其它參數(shù)可能是有好處的，例如，向培養(yǎng)物補(bǔ)料的葡萄糖的量和/或氧吸收速率。例如，對(duì)于PER. C6而言，細(xì)胞培養(yǎng)基和/或營(yíng)養(yǎng)物的補(bǔ)料速率優(yōu)選被選擇為使得葡萄糖濃度保持在3至20mmol/L之間,更優(yōu)選在5至15mmol/L之間。優(yōu)選地，葡萄糖濃度為至少3mmol/L,更優(yōu)選至少5mmol/L,優(yōu)選至多20mmol/L,更優(yōu)選至多15mmol/L。在本發(fā)明的一種特別的實(shí)施方式中，至少一次從反應(yīng)器移出細(xì)胞培養(yǎng)物(包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基)，并向反應(yīng)器中加入液體(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)料)，以補(bǔ)償細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。細(xì)胞培養(yǎng)物的移出可導(dǎo)致更高細(xì)胞密度下進(jìn)行更長(zhǎng)的處理時(shí)間，并且組合高的細(xì)胞存活率，這導(dǎo)致了更高的生產(chǎn)力。細(xì)胞培養(yǎng)物可連續(xù)或分步移出。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，只要達(dá)到想要的細(xì)胞密度，例如，至少I(mǎi)OXlO6個(gè)存活細(xì)胞/ml，優(yōu)選至少20X IO6個(gè)存活細(xì)胞/ml，更優(yōu)選至少30X IO6個(gè)存活細(xì)胞/ml，例如，至多200X IO6個(gè)存活細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度，就從反應(yīng)器中移出細(xì)胞培養(yǎng)物(包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基)，并且向反應(yīng)器中加入液體(例如細(xì)胞培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)料)，以補(bǔ)償細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。優(yōu)選地，以使得細(xì)胞密度保持在想要的細(xì)胞密度范圍內(nèi)的速率來(lái)移出細(xì)胞培養(yǎng)物。較之傳統(tǒng)的分批或補(bǔ)料分批工藝，本發(fā)明的該實(shí)施方式是高度有利的，因?yàn)槠鋵⒈景l(fā)明工藝的優(yōu)點(diǎn)與可被保持更長(zhǎng)時(shí)間的高存活率組合起來(lái)，使得得以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步更高的總體積生產(chǎn)力。“體積生產(chǎn)力”表示每單位時(shí)間每單位反應(yīng)器體積產(chǎn)生的生物物質(zhì)的量，其通常被表示為g.L—1.天―1。較之傳統(tǒng)灌注工藝，本發(fā)明的該實(shí)施方式是高度有好處的，因?yàn)槠鋵⒈景l(fā)明工藝的優(yōu)點(diǎn)和具有高濃度生物物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物移出流組合到一起。細(xì)胞培養(yǎng)物移出流中高濃度的生物物質(zhì)使得從其中收獲生物物質(zhì)具有商業(yè)價(jià)值。在其中移出細(xì)胞培養(yǎng)物的傳統(tǒng)灌注工藝中，細(xì)胞培養(yǎng)物移出流含有的生物物質(zhì)并不足以使得收獲所述生物物質(zhì)具有商業(yè)價(jià)值，因此細(xì)胞培養(yǎng)物移出流通常被認(rèn)為是廢料。因此，本發(fā)明的該實(shí)施方式中，理論上可以以直接、經(jīng)濟(jì)可行且簡(jiǎn)單的方式收獲產(chǎn)生的所有生物物質(zhì)。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，選用這樣的細(xì)胞培養(yǎng)條件，使得細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)速率和/或比生產(chǎn)力不受限制，更優(yōu)選地，還使得細(xì)胞培養(yǎng)基的至少 一種組分(例如葡萄糖或谷氨酰胺)的濃度保持恒定，并且，只要達(dá)到想要的細(xì)胞密度，至少進(jìn)行一次從反應(yīng)器移出細(xì)胞培養(yǎng)物的操作，并且，向反應(yīng)器加入液體(例如細(xì)胞培養(yǎng)基)，以補(bǔ)償細(xì)胞培養(yǎng)物的移出。優(yōu)選地，流出物的速率被選擇為使得其與至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分(例如營(yíng)養(yǎng)物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基)的添加速率減去任選的細(xì)胞培養(yǎng)基移出速率基本等同。產(chǎn)生生物物質(zhì)的細(xì)胞例如是能表達(dá)編碼生物物質(zhì)的基因的細(xì)胞?？衫缤ㄟ^(guò)用含有編碼生物物質(zhì)的基因和編碼合適的選擇標(biāo)記的基因(例如，編碼新霉素抗性的基因(Neo標(biāo)記基因))的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而制備能表達(dá)編碼生物物質(zhì)的基因的細(xì)胞。然后可通過(guò)選擇壓力來(lái)選出經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如，在Neo標(biāo)記基因的情況下，通過(guò)在存在G418(genericin)的情況下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及針對(duì)展示出生物物質(zhì)高水平表達(dá)的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞加以立即篩選。用于制備表達(dá)蛋白的El-永生化HER細(xì)胞的克隆的方法以及用于培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞以生產(chǎn)所述蛋白的方法都是技術(shù)人員公知的，例如可在US6，855，544中找到?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)，例如通過(guò)表達(dá)編碼(重組)基因編碼來(lái)產(chǎn)生的生物物質(zhì)，因此例如是(重組)蛋白，特別是受體、酶、融合蛋白、血蛋白(例如來(lái)自凝血級(jí)聯(lián)的蛋白)、多功能蛋白(例如促紅細(xì)胞生成素)、病毒或細(xì)菌蛋白(例如用于疫苗的)、免疫球蛋白(例如抗體，例如IgG或IgM)等；優(yōu)選地，通過(guò)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白，更優(yōu)選地，產(chǎn)生抗體。優(yōu)選地，通過(guò)細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)，例如蛋白或疫苗可用作為藥物制劑中的活性成分。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)物”和“生物物質(zhì)”可交換使用。在本發(fā)明的上下文中，藥物制劑表示可用作為藥品(特別是用于人的藥品)的任何制劑。此類(lèi)藥品可以例如用于診斷或用于預(yù)防目的(例如，疫苗)和/或用于治療目的，例如患者缺乏的酶或蛋白，或者用于殺死不想要的細(xì)胞的抗體。藥物制劑還可含有可藥用載體或賦形劑，它們的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。PER. C6細(xì)胞系可用于生產(chǎn)生物物質(zhì)，例如El-缺失的腺病毒(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利6，994， 128 ;Nichols et al，2002， Propagation of adenoviral vectors use of PER.C6cells. In Curiel D, Douglas JT, editors. Adenoviral vectors for gene therapy.San Diego :Elsevier.pl29-167)、其它病毒(見(jiàn)，例如，W001/38362)或重組蛋白(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利 6，855，544 ;Yallop et al, 2005, PER. C6 cells for the manufacture ofbiopharmaceutical proteins, Modem Biopharmaceuticals Design, Development andOptimization, 4Volumes, 779-807, Jorg Knablein (編輯))?？捎米鳛樗幬镏苿┲谢钚猿煞值牡鞍椎睦影?括號(hào)內(nèi)是商品名)Tenecteplase (TN Kase )、(重組)抗血友病因子(ReFacto )、淋巴母細(xì)胞干擾素 a -nl (ffellferon ) > (重組)凝血因子(NovoSeven ) > Etanercept (EnbreI ) >Trastuzumab(Herceptin )、Infliximab(Remicade )、Palivizumab(Synagis )、Basiliximab (Simulect )、Daclizumab (Zenapaz )、Rituximab (Rituxan ),(重組)凝血因子 IX (Benef ix )和干擾素 β -Ia (Avonex )。可用作為藥物制劑中活性成分的疫苗的例子包括經(jīng)分離的蛋白抗原，其例子包括但不限于活的、口服的、四價(jià)的輪狀病毒疫苗(RotaShield )、狂犬病疫苗(RanAvert )、流感疫苗和滅活甲肝疫苗(VAQTA )。細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩(osmolarity)原則上并非關(guān)鍵，它們?nèi)Q于所選用的細(xì)胞的類(lèi)型。優(yōu)選地，pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩被選擇為使得對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力來(lái)說(shuō)是最佳的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何找到培養(yǎng)物的最佳pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩(見(jiàn)，例如W02004/099396)。優(yōu)選地，對(duì)于本發(fā)明的工藝而言，當(dāng)使用El永生化的HER細(xì)胞時(shí)，選用6. 6至7. 6之間的pH，和/或選用30至39°C之間的溫度和/或選用260至400m0sm/kg之間的同滲容摩。為保持最佳工藝條件，對(duì)工藝條件控制的自動(dòng)化是人們想要的。為了對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，例如為了獲得生長(zhǎng)阻礙用于增加細(xì)胞生產(chǎn)力，在培養(yǎng)期間，可應(yīng)用培養(yǎng)條件的變更。這可例如通過(guò)溫度變更(例如從37至32°C )、pH變更或同滲容摩變更來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的工藝原則上可以在適于培養(yǎng)細(xì)胞的任何類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)行。選擇細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)條件的指導(dǎo)是公知的，例如被提供于Freshney, R. I. Culture ofanimal cells(a manual ofbasic techniques),4thedition 2000, Wiley-Liss and inDoyle,A.,Griffiths,J. B. ,Newell,D. G. Cell & Tissue culture !Laboratory Procedures1993, John Wiley & Sons 的第 8 和 9 章中。例如，細(xì)胞培養(yǎng)基可例如包含碳水化合物來(lái)源、鹽和/或氨基酸和/或維生素和/或脂類(lèi)和/或去垢劑和/或緩沖劑和/或生長(zhǎng)因子和/或激素和/或細(xì)胞因子和/或痕量元素作為細(xì)胞培養(yǎng)基組分。碳水化合物來(lái)源的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和丙酮酸鹽。鹽的例子包括鎂鹽，例如MgCl2. 6H20、MgSO4和MgSO4. 7H20,鐵鹽，例如FeSO4. 7H20,鉀鹽，例4如KH2P04、KCl ;鈉鹽，例如NaH2P04、Na2HPO4,和鈣鹽，例如CaCl2. 2H20。氨基酸的例子包括所有已知的形成蛋白質(zhì)的氨基酸，例如組氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、甲硫氨酸。維生素的例子包括抗壞血酸鹽、生物素、膽堿氯、肌醇、D-泛酸鹽、核黃素。脂類(lèi)的例子包括脂肪酸，例如，亞油酸和油酸；去垢劑的例子包括Tween 80和Pluronic F68。緩沖劑的例子包括HEPES和Na2CO315生長(zhǎng)因子/激素/細(xì)胞因子的例子包括IGF (胰島素樣生長(zhǎng)因子)、腎上腺皮質(zhì)素和(重組)胰島素。痕量元素的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括Zn、Mg和Se。細(xì)胞培養(yǎng)基還可例如包含其它細(xì)胞培養(yǎng)基組分，例如大豆蛋白胨或乙醇胺。
為按照本發(fā)明來(lái)生產(chǎn)生物物質(zhì)，特別是如果生物物質(zhì)將要用作為藥物制劑中的活性成分的話(huà)，不含血清的培養(yǎng)基相對(duì)含血清來(lái)源的培養(yǎng)基是優(yōu)選的。其理由是血清來(lái)源的培養(yǎng)基可能被病毒污染，存在朊性(prionic)感染的風(fēng)險(xiǎn)，并且可能對(duì)生物藥物產(chǎn)品的下游加工(即，從細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)生物物質(zhì)的進(jìn)一步純化)造成大的障礙。因此，本發(fā)明的工藝優(yōu)選在不包含來(lái)自動(dòng)物(包括人)來(lái)源的血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。鑒于來(lái)自哺乳動(dòng)物來(lái)源的化合物也存在感染風(fēng)險(xiǎn)，因此，優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基是非哺乳動(dòng)物來(lái)源的，即，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含來(lái)自哺乳動(dòng)物來(lái)源的血清或組分。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基是非動(dòng)物來(lái)源的，即，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含來(lái)自動(dòng)物(包括人)來(lái)源的血清或組分。可用于培養(yǎng)PER.C6細(xì)胞的不含血清的培養(yǎng)基的例子包括可商業(yè)獲得的培養(yǎng)基，例如，EX Cell VPRO培養(yǎng)基(SAFC)、HyQ CDM4Retino (HyClone)、IS ProVec CD(Irvine scientific)、293_SFM
II(invitrogen)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，從其中內(nèi)含物被保持在反應(yīng)器中或優(yōu)選被回送進(jìn)反應(yīng)器的流來(lái)收獲本發(fā)明的工藝中產(chǎn)生的生物物質(zhì)，或從由反應(yīng)器移出的細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲，或者從兩者中收獲。還可在所謂的下游加工中使用取決于生物物質(zhì)的方法(所述方 法是技術(shù)人員公知的)，從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲本發(fā)明工藝中產(chǎn)生的生物物質(zhì)。下游加工通常包含以各種組合和順序進(jìn)行的若干純化步驟。下游加工中純化步驟的例子是分離步驟(例如，通過(guò)親和色譜和/或離子交換色譜和/或通過(guò)水性?xún)上嘞到y(tǒng)萃取和/或通過(guò)例如硫酸銨沉淀)、用于濃縮生物物質(zhì)的步驟(例如通過(guò)超濾或滲濾)、用于更換緩沖液的步驟和/或用于移出或滅活病毒的步驟(例如，通過(guò)病毒過(guò)濾、PH變更或溶劑去垢劑處理)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選El-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選PER. C6細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其具有至少50 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL，優(yōu)選至少60 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL，特別是至少90 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL的存活細(xì)胞密度以及至少5g/L，更優(yōu)選至少10g/L，特別是至少llg/L的生物物質(zhì)濃度。原則上生物物質(zhì)的濃度可高達(dá)至生物物質(zhì)的溶解度所允許的程度。存活細(xì)胞的濃度典型地不超過(guò)200 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL，優(yōu)選在80-150 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL的范圍內(nèi)。存活細(xì)胞密度例如可這樣來(lái)測(cè)定使用臺(tái)盼藍(lán)排除方法，例如通過(guò)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器(可從例如Innovatis (Cedex細(xì)胞計(jì)數(shù)器)商業(yè)獲得)來(lái)進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)物表示包含細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞和生物物質(zhì)的液體，所述液體是在反應(yīng)器中在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的工藝的結(jié)果，其中，所述細(xì)胞產(chǎn)生所述生物物質(zhì)?，F(xiàn)在將通過(guò)下述實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明，但下述實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明加以限制。附圖
描述圖I顯示了針對(duì)工藝A (分批)、B (補(bǔ)料分批)和Cl (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度ΥαοΙπιΓ1)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖2顯示了針對(duì)工藝A(分批)、Β (補(bǔ)料分批)和Cl (本發(fā)明的工藝)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A中的IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖3顯示了針對(duì)工藝A (分批)、Β (補(bǔ)料分批)和C2 (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度ΥαοΙπιΓ1)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖4顯示了針對(duì)工藝A (分批)、Β (補(bǔ)料分批)和C2 (本發(fā)明的工藝)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A中的IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。
圖5顯示了針對(duì)工藝A (分批)、B (補(bǔ)料分批)和C3 (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度ΥαοΙπιΓ1)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖6顯示了針對(duì)工藝A和C3的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A3中的IgG濃度的％)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖7顯示了針對(duì)工藝Α、B和C3的累積產(chǎn)率Q (相對(duì)于工藝A中的產(chǎn)率的％，每升反應(yīng)器體積)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖8顯示了針對(duì)工藝C4(本發(fā)明的工藝)的細(xì)胞數(shù)量Yao6^mr1)對(duì)工藝時(shí)間X(天)的作圖。 圖9顯示了針對(duì)工藝C4(本發(fā)明的工藝的一種實(shí)施方式)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于達(dá)到的最大IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間X(天)的作圖。
實(shí)施例實(shí)施例I:對(duì)分批工藝、補(bǔ)料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較在該實(shí)施例中，將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補(bǔ)料分批工藝相比較。圖I顯示了針對(duì)工藝A (分批)、B (補(bǔ)料分批)和Cl (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度Yaof^mr1)對(duì)工藝時(shí)間X(天)的作圖。圖2顯示了針對(duì)工藝A(分批)、B (補(bǔ)料分批)和Cl (本發(fā)明的工藝)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A中的IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間X(天)的作圖。所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實(shí)驗(yàn)中都使用相同的產(chǎn)生IgG的PER. C6細(xì)胞系(見(jiàn)W02004/099396)。分批工藝A分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X 10e5個(gè)細(xì)胞/mL接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。補(bǔ)料分批工藝B補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X 10e5個(gè)細(xì)胞/mL接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過(guò)15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充消
耗的氨基酸。本發(fā)明的工藝Cl本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有IOOkDa分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(從GeneralElectric(GE)獲得)被用于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X 10e5個(gè)細(xì)胞/mL開(kāi)始。使用0. 05至0. 2nL/細(xì)胞/天之間的比流速(SFR)，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)。獲得的最高產(chǎn)物濃度為I. 4g/L。本發(fā)明的工藝較之前文提到的培養(yǎng)模式而言，以較少的時(shí)間產(chǎn)生了增加的存活細(xì)胞密度以及增加的產(chǎn)物濃度，這可從圖I和圖2中看到。實(shí)施例2 :對(duì)分批工藝、補(bǔ)料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較
在該實(shí)施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補(bǔ)料分批工藝相比較；在工藝C2中，CO2壓力被控制，并且使用50kDa的分離系統(tǒng)。圖3顯示了針對(duì)工藝A (分批)、B (補(bǔ)料分批)和C2 (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度ΥαοΙπιΓ1)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖4顯示了針對(duì)工藝A (分批)、Β (補(bǔ)料分批)和C2 (本發(fā)明的工藝)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A中的IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。
所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實(shí)驗(yàn)中都使用相同的產(chǎn)生IgG (大約150kDa)的PER. C6細(xì)胞系(見(jiàn)W02004/099396)。分枇工藝A分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個(gè)細(xì)胞.mL—1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。補(bǔ)料分枇工藝B補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個(gè)細(xì)胞.mL—1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過(guò)15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充消
耗的氨基酸。本發(fā)明的工藝C2本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有50kDa分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(GE)被用于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X10e5個(gè)細(xì)胞/mL開(kāi)始。使用0. 05至0. 2nL.細(xì)胞Λ天―1之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)。CO2壓力被控制為低于15%。結(jié)果如從圖3和圖4可見(jiàn)，根據(jù)本發(fā)明的工藝在相等或更短的時(shí)間(分批時(shí)間的100%;補(bǔ)料分批時(shí)間的81%)內(nèi)產(chǎn)生了顯著增加的存活細(xì)胞密度和增加的產(chǎn)物濃度(2415% X分批的產(chǎn)率；690% X補(bǔ)料分批的產(chǎn)率)。本發(fā)明工藝總生產(chǎn)力(以g. L-1.天-1)的增加是分批生產(chǎn)力(以g. L-1.天―1)的23. 9倍，是補(bǔ)料分批生產(chǎn)力(Hg. Γ1.天―1)的8. 5倍。在本發(fā)明的工藝C2中，產(chǎn)生了 11. Ig產(chǎn)物/L。17天期間沒(méi)有發(fā)生駐留設(shè)備的阻塞，即使是非常高細(xì)胞密度的情況下。實(shí)施例3 :對(duì)分批工藝、補(bǔ)料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較在該實(shí)施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的采用細(xì)胞培養(yǎng)物移出的工藝的表現(xiàn)與分批和補(bǔ)料分批工藝相比較；在工藝C3中，移出了細(xì)胞培養(yǎng)物。圖5顯示了針對(duì)工藝A (分批)、B (補(bǔ)料分批)和C3 (本發(fā)明的工藝)的存活細(xì)胞密度ΥαοΙπιΓ1)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖6顯示了針對(duì)工藝A和C3的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于工藝A3中的IgG濃度的％)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。圖7顯示了針對(duì)工藝Α、B和C3的累積產(chǎn)率Q (相對(duì)于工藝A中的產(chǎn)率的％，每升反應(yīng)器體積)對(duì)工藝時(shí)間Χ(天)的作圖。
所有發(fā)酵都采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C, pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200rpm條件下進(jìn)行。在所有實(shí)驗(yàn)中都使用相同的產(chǎn)生IgG (大約150kDa)的PER. C6細(xì)胞系(見(jiàn)W02004/099396)。分枇工藝A分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個(gè)細(xì)胞.mL—1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。補(bǔ)料分枇工藝B補(bǔ)料分批工藝以4L的工作體積在Sartorius B5容器中進(jìn)行。將細(xì)胞以3X IO5個(gè)細(xì)胞.mL—1接種于補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超過(guò)15mM和ImM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補(bǔ)充消 耗的氨基酸。本發(fā)明的工藝C3本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有IOOkDa分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(GE)被用于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X10e5個(gè)細(xì)胞/mL開(kāi)始。使用0. 05至0. 2nL.細(xì)胞 ' 天―1之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注補(bǔ)充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)。當(dāng)存活細(xì)胞密度大于10X IO6個(gè)細(xì)胞.mL—1時(shí)，每天以工作體積的10%移出細(xì)胞培養(yǎng)物，當(dāng)存活細(xì)胞密度超過(guò)30 X IO6個(gè)細(xì)胞.mL—1時(shí)，每天以工作體積的30%移出細(xì)胞培養(yǎng)物。結(jié)果如可從圖5看到的，采用本發(fā)明的工藝，快速達(dá)到了更高的存活細(xì)胞密度。此外，圖5還顯示，采用本發(fā)明的工藝細(xì)胞的存活性可保持更長(zhǎng)時(shí)間，例如工藝C3保持運(yùn)行了接近40天，因?yàn)榧词乖诟呒?xì)胞密度的情況下也不會(huì)發(fā)生對(duì)駐留設(shè)備的阻塞。圖6顯示，本發(fā)明工藝的產(chǎn)物濃度要比分批工藝中的產(chǎn)物濃度高得多。以分批工藝A中終濃度的大約200%至250%倍從工藝C3收獲了含有產(chǎn)物的產(chǎn)物流。圖7顯示，本發(fā)明的工藝形成了最多的產(chǎn)物，并且本發(fā)明的工藝能比分批工藝A和補(bǔ)料分批工藝B保持更長(zhǎng)的時(shí)間。在第17天，工藝C3的累積產(chǎn)率為分批工藝(A3)累積產(chǎn)率的8. I倍，是補(bǔ)料分批工藝(B)累積產(chǎn)率的2. I倍。此外，在第17天，分批工藝終止。在第21天，工藝C3的累積產(chǎn)率是補(bǔ)料分批工藝B的累積產(chǎn)率的3. O倍。在第21天，補(bǔ)料分批工藝終止。39天后，工藝C3的總累積產(chǎn)率是分批工藝A累積產(chǎn)率的25倍，是補(bǔ)料分批工藝B產(chǎn)率的6倍。從該實(shí)驗(yàn)可以推斷出，在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)一定高水平后，可通過(guò)應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)物的移除，來(lái)進(jìn)一步提高想要的生物材料的總產(chǎn)率。實(shí)施例4 :培養(yǎng)和牛產(chǎn)CHO細(xì)胞在該實(shí)施例中，采用生產(chǎn)IgG的CHO細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行了根據(jù)本發(fā)明的工藝，其中包括溫度降低以減少細(xì)胞生長(zhǎng)。圖8顯示了針對(duì)工藝C4(本發(fā)明的工藝)的細(xì)胞數(shù)量Yao6-Hir1)對(duì)工藝時(shí)間χ(天)的作圖。圖9顯示了針對(duì)工藝C4(本發(fā)明的工藝的一種實(shí)施方式)的反應(yīng)器Z中的IgG濃度(相對(duì)于達(dá)到的最大IgG濃度的％ )對(duì)工藝時(shí)間X(天)的作圖。發(fā)酵米用Sartorius Biostat B控制器,將溫度控制為36. 5°C, pH控制為7. I至6. 9之間，在DO為40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。溫度在第5天降低至32°C。本發(fā)明的工藝C4本發(fā)明的工藝在2L Applikon容器中進(jìn)行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有50kD分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(General Electric)被用于保留細(xì)胞和IgG產(chǎn)物。培養(yǎng)以MTCM-49培養(yǎng)基(Hyclone)中 的5X IO6個(gè)細(xì)胞/mL開(kāi)始。使用O. I至0.4nL.細(xì)胞 ' 天―1之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注培養(yǎng)基。CO2壓力被控制為低于15%。益果數(shù)據(jù)顯示，使用產(chǎn)生蛋白的CHO細(xì)胞系時(shí)，本發(fā)明的工藝同樣能夠工作。獲得的細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度較之分批培養(yǎng)有所增加。數(shù)據(jù)還顯示，在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，細(xì)胞生長(zhǎng)可被阻礙(例如，通過(guò)溫度降低)，而培養(yǎng)系統(tǒng)中的產(chǎn)物積累能夠繼續(xù)。實(shí)施例5:采用骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行的本發(fā)明的工藝根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應(yīng)用到骨髓瘤細(xì)胞系上。為達(dá)到此目的，發(fā)酵采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。培養(yǎng)以在5L Sartorius容器中的SFM4Mab培養(yǎng)基(Hyclone)中以3X 10e5個(gè)細(xì)胞/mL接種骨髓瘤細(xì)胞開(kāi)始。細(xì)胞和產(chǎn)物駐留設(shè)備是用ATF-4系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(General Electric)。使用O. I至O. 4nL.細(xì)胞Λ天―1之間的SPR,經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注SFM4Mab培養(yǎng)基(Hyclone)。CO2壓力被控制為低于15%。實(shí)施例6 :采用MDCK細(xì)胞系講行的本發(fā)明的工藝根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應(yīng)用到懸浮液中的經(jīng)轉(zhuǎn)化的MDCK細(xì)胞系上。為達(dá)到此目的，發(fā)酵采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36. 5°C，pH控制為7. 2至6. 8之間，在DO為40%空氣飽和度以及IOOrpm條件下進(jìn)行。培養(yǎng)以在5L Sartorius容器中的VP-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)中以3 X 10e5個(gè)細(xì)胞/mL接種經(jīng)轉(zhuǎn)化的MDCK細(xì)胞開(kāi)始。細(xì)胞和產(chǎn)物駐留設(shè)備是用ATF-4系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30kD分子量分離點(diǎn)(MWCO)的中空纖維膜(General Electric)。使用O. I至O. 4nL.細(xì)胞' 天之間的SPR，經(jīng)由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物灌注VP-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)。CO2壓力被控制為低于 15%。
權(quán)利要求
1.包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其具有至少50X IO6個(gè)細(xì)胞/mL的存活細(xì)胞密度以及至少5g/L的生物物質(zhì)濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中，所述生物物質(zhì)濃度為至少10g/L，優(yōu)選至少llg/L0
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是El-永生化的HER細(xì)胞，優(yōu)選是PER. C6細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。具體地，本發(fā)明涉及在反應(yīng)器中于細(xì)胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選E1-永生化的HER細(xì)胞，更優(yōu)選PER.C6細(xì)胞的工藝，其中，細(xì)胞產(chǎn)生生物物質(zhì)，優(yōu)選產(chǎn)生抗體，其中，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料至少一種細(xì)胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含細(xì)胞、生物物質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將生物物質(zhì)與比所述生物物質(zhì)分子量更低的物質(zhì)分開(kāi)，并且，其中，所述生物物質(zhì)保留在反應(yīng)器中或被回送進(jìn)反應(yīng)器。優(yōu)選地，更低分子量的物質(zhì)的一部分持續(xù)從細(xì)胞培養(yǎng)物中移出。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102876628SQ20121032162
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2007年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者格本·梅勒·茲吉爾斯特瑞, 羅伯特·帕特里克·浩弗, 雅各布·史德勒 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司