專利名稱：基于超分支滾環(huán)擴增的核酸試紙條檢測食品致病菌的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法及檢測單增李斯特菌和沙門氏菌的試劑盒。
背景技術：
近年來，食源性致病菌以其傳染性和致病性，在全球范圍內造成了越來越多的食品安全事件，隨著人們的生活水平和接受教育水平的不斷提高，食品安全越來越受到人們的廣泛重視，食品致病菌問題也相應地更加備受關注?？焖?、高特異性、高靈敏度的檢測食品致病菌的方法不僅可以快速診斷致病的原因，在現(xiàn)實生活中還能預防腸道傳染病和食物中毒的發(fā)生。目前食源性致病菌的檢測方法主要依靠分離培養(yǎng)和生化鑒定，該方法費時費 力。而靈敏度更高、特異性更好的基于核酸的檢測方法，雖然可以直接用于細菌檢測而不需要前期培養(yǎng)或者縮短孵育時間，但是需要溫度循環(huán)和昂貴的設備，例如聚合鏈式酶反應(PCR)和基于核酸擴增的熒光檢測技木。隨著膠體金診斷技術的發(fā)展，一種檢測速度快、特異性好、靈敏度高、設備簡單、成本低、操作簡單的膠體金免疫試紙條在生物醫(yī)學領域特別是醫(yī)學檢驗中，得到了廣泛應用，早孕試紙條成功的商品化應用就是證明，但是膠體金免疫試紙條所用的單克隆抗體也比較昂貴，針對不同的檢測樣品，需要調整抗體的類型，不適于廣譜性檢測。近期，一種基于核酸檢測的核酸試紙條發(fā)展迅速，它與恒溫擴增的方法相結合用于檢測，已有環(huán)介導的恒溫擴增核酸試紙條(LAMP-NALFTS)，基于核酸序列的核酸試紙條(NASBA-NALFTS)，交叉引物恒溫擴增核酸試紙條，循環(huán)探針溫擴增核酸試紙條(CPT-NALFTS)，重組聚合酶溫擴增核酸試紙條(RPA-NALFTS)，鏈置換恒溫擴增核酸試紙條(SDA-NALFTS)等方法的報道，但是普遍存在探針設計復雜，檢測靈敏度相對不高，易出現(xiàn)假陽性等問題，且在食源性致病微生物檢測領域的應用較少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條進行簡便、靈敏度高、探針設計簡單、操作步驟簡短及特異性高的檢測食品致病菌的方法。本發(fā)明的另ー目的在于提供ー種使用上述方法實現(xiàn)檢測單增李斯特菌和沙門氏菌的試劑盒。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，具體包括如下步驟(I)食品致病菌基因組DNA的提取及酶切提取食品致病菌的基因組DNA，根據(jù)食品致病菌的保守序列選擇限制性內切酶對食品致病菌的基因組DNA進行酶切反應得到靶片段。
(2)擴增引物及核酸探針序列設計根據(jù)步驟(I)得到的靶片段序列設計一條5’端磷酸化修飾的鎖式探針(padlock
probeノ ；根據(jù)鎖式探針序列設計兩條擴增方向相反的引物I和引物2，引物I和引物2的5’端修飾有功能基團；設計一條與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNA，作用是使其與超分支滾環(huán)擴增的雙鏈產物退火雜交，為試紙條上核酸雜交提供空閑堿基位點；設計一條5’端修飾有功能基團的多聚T探針；設計一條5’端修飾有功能基團的多聚A捕捉探針。(3)超分支滾環(huán)擴增反應 連接反應反應體系包括步驟(I)中所述的靶片段、步驟(2)中所述的鎖式探針、連接酶及其緩沖液和雙蒸水；消化反應反應體系包括上述連接反應的產物、核酸外切酶及其緩沖液和雙蒸水；擴增反應反應體系包括上述消化反應的產物、步驟(2)中所述的引物I和引物2、dNTP、聚合酶及其緩沖液和雙蒸水。(4)退火雜交將超分支滾環(huán)擴增反應產物與步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA退火雜交。(5)納米金探針的制備納米金的制備用檸檬酸鹽還原法以氯金酸(HAuCl4)為原料制備納米金；納米金探針的制備將步驟(2)中所述的多聚T探針與納米金連接制備納米金探針，并用包埋緩沖液重懸納米金探針得到用于包埋的納米金探針。(6)膠體金核酸試紙條的制備膠體金核酸試紙條由底板、樣品板、金墊、硝酸纖維素膜(NC膜)和吸水板構成，將底板、樣品板、金墊、NC膜和吸水板按圖4所示結構組裝底板在最下層，NC膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于NC膜的上部的一側并與之重疊，樣品板位于金墊的上部與之重疊，吸水板位于硝酸纖維素膜的上部相對于金墊和樣品板的另ー側并與硝酸纖維素膜重疊；所述的金墊包埋有步驟(5)制備的納米金探針；所述的硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素的檢測線(T線)和含鏈霉親和素和多聚A捕捉探針的控制線(C線)。(7)樣品的檢測將由步驟(4)得到的退火雜交產物與SSC緩沖液(檸檬酸鈉緩沖液)組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，再滴加SSC緩沖液，讀取結果，檢測線和控制線都變成紅色表明有靶片段存在，即有待測食品致病菌，僅有控制線變成紅色表明沒有待測食品致病菌；為了定量檢測，可用讀條機讀取檢測線和控制線上的信號。步驟(I)中所述的食品致病菌包括單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸桿菌 0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)>志賀氏菌(Shigella. Spp)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和臘狀芽抱桿菌(Yersiniaenterocolitica)等。步驟(I)中所述的食品致病菌的保守序列優(yōu)選為食品致病菌的16S-23S啟動子間基因片段或食品致病菌的毒力基因片段，如單增李斯特菌表達溶素O的基因(hlyA)，沙門氏菌的侵襲基因A (invA)等。步驟(2)中所述的鎖式探針分為5’端和3’端與靶片段序列毗鄰互補的區(qū)域和中間與超分支滾環(huán)擴增的兩個引物(引物I和引物2)結合的區(qū)域。步驟(2)中所述的引物I的功能基團優(yōu)選為生物素。步驟(2)中所述的引物2的功能基團優(yōu)選為生物素。步驟(2)中所述的單鏈DNA的多聚A尾優(yōu)選為16 32個A。
步驟(2)中所述的多聚T探針的功能基團優(yōu)選為巰基，多聚T探針中T的數(shù)量優(yōu)選為16 32個；步驟(2)中所述的多聚A捕捉探針的功能基團為生物素，多聚A捕捉探針中A的數(shù)量優(yōu)選為16 32個。當食品致病菌為單增李斯特菌時其保守序列為表達溶素O基因(hlyA，NCBI編號AF253320)，用限制性內切酶Bspl286 I (Sdu I )和EcoT14 I (Sty I )對單增李斯特菌基因組DNA進行酶切，得到hlyA 靶片段，序列為5 ’ -TCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACG 丨(X A ATCG A A A AG AAACACGC-3’，單下劃線表示的是hlyA靶片段與鎖式探針結合的區(qū)域，豎線表示隔開了鎖式探針的5’和3’端；步驟(2)中所述的5’端磷酸化修飾的鎖式探針的序列為5’ -phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGG ATTACKTTTAC 丁 dPATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-35(phosphate 表示磷酸化)，單下劃線部分為與hlyA靶片段互補配對的，雙下劃線表示的是引物I結合的區(qū)域，點下劃線表示的是引物2結合的區(qū)域；步驟(2)中所述引物I 為5’ -Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’ (Bio 表示生物素)；步驟(2)中所述引物2 為5’ -Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’ (Bio 表示生物素)；步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA的序列為5’-Poly (dA)-CAATCGAAMGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3，，多聚A尾為16個A ;步驟(2)中所述的多聚T探針的5’端修飾有巰基、T的數(shù)量為16個，步驟(2)中所述的多聚A捕捉探針5’端修飾有生物素、A的數(shù)量為16個。當食品致病菌為沙門氏菌時其保守序列為侵襲基因A(invA，NCBI編號EU348367)，用限制性內切酶Taq I和Alu I對沙門氏菌基因組DNA進行酶切，得到invA靶片段，序列為5’-GTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGACTTGTGCCGAAGAGCCGGC-3’ ；根據(jù)超分支滾環(huán)擴增的原理，針對不同靶序列設計的鎖式探針，可以有相同的連接序列，所以該鎖式探針的連接序列與檢測單增李斯特菌時鎖式探針的連接序列相同，故可以使用相同的引物；步驟(2)中所述的5’端磷酸化修飾的鎖式探針的序列為5’-phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3’(phosphate 表示磷酸化)；步驟(2)中所述引物I 為5’ -Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’ (Bio 表示生物素)；步驟(2)中所述引物2 為5’ -Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’ (Bio 表示生物素)；步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA的序列為5’-Poly (dA)-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚 A 尾為 16 個 A ;步驟(2)中所述的多聚T探針的5’端修飾有巰基、T的數(shù)量為16個，步驟(2)中·所述的多聚A捕捉探針5’端修飾有生物素、A的數(shù)量為16個。步驟(3)中所述的連接酶及其緩沖液優(yōu)選為Taq DNA連接酶及其相配的商品化的緩沖液；步驟(3)中所述的連接反應的條件優(yōu)選為60°C反應lh，接著95°C反應lOmin。步驟(3)中所述的核酸外切酶及其緩沖液優(yōu)選為Exco I和Exco III及其相配的商品化的緩沖液；步驟(3)中所述的消化反應的條件優(yōu)選為37°C反應2 4h，接著95°C反應IOmin0步驟(3)中所述的聚合酶及其緩沖液優(yōu)選為Bst DNA聚合酶(大片段)及其相配的商品化的緩沖液；步驟(3)中所述的擴增反應的條件優(yōu)選為63 65°C反應lh。步驟(4)中所述的退火雜交的條件優(yōu)選為95°C反應2min，然后37で反應5min。步驟(5)中所述的納米金探針的制備方法為將20 μ L 200 μ M的5’端修飾有巰基的多聚T探針、0.66 μ L 500 μ M的醋酸緩沖液(pH 5. 2)和IyL 10 μ M TCEP (磷酸三氯こ酷)混勻，室溫、避光孵育I小時；在不斷的搖動下，加入ImL IOnM的納米金膠體溶液，密封，室溫避光用振蕩器600rpm反應16小時；緩慢震蕩下逐滴加入20 μ L500mM的Tris醋酸緩沖液(pH 8. 2)，再逐滴加入200 μ LlM NaCl，避光孵育一天;12000rpm，4で離心30分鐘，收集沉淀即得到納米金探針。步驟(5)中所述的包埋緩沖液為Na3P0420mM，BSA (牛血清白蛋白)質量百分比5%，Tween X-100體積百分比0. 25%,鹿糖質量百分比8%。步驟(6)中所述的底板的材料優(yōu)選為PVC塑料。步驟(6)中所述的樣品板的材料優(yōu)選為玻璃纖維，其處理方法為用樣品板處理緩沖液浸潤，置于干燥器中室溫保存；所述的樣品板處理緩沖液為PH 8.0，體積百分比
0.25% 的 Triton X-100,0. 05Μ Tris_HCl，0. 15M NaCl。步驟(6)中所述的金墊的材料優(yōu)選為玻璃纖維，其的處理方法為用50yL步驟
(4)中所述的用于包埋的納米金探針噴在其上，室溫下干燥，干燥器中4°C保存。步驟(6)中所述的硝酸纖維素膜的處理方法優(yōu)選為用噴膜儀將6 μ L鏈霉親和素溶液噴到檢測線(T線)的位置，將6 μ L鏈霉親和素溶液和多聚A捕捉探針混合液噴到控制線(C線)的位置，置于室溫下干燥lh，并于4°C干燥保存；所述的鏈霉親和素溶液濃度為
I.67mg/mL,所述的多聚A捕捉探針的濃度為ImM ;所述的檢測線寬2mm與金墊相隔6mm,所述的控制線寬2mm與金墊相隔12mm。步驟(6)中所述的吸水板的材料優(yōu)選為吸水纖維。步驟(6)中所述的組裝優(yōu)選為底板在最下層，NC膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于NC膜的上部的一側并與之重疊2mm，樣品板位于金墊的上部與之重疊2mm，吸水板位于NC膜的上部相對與金墊和樣品板的另ー側并與NC膜重疊2mm,最后用切條機切成4mm寬的條。步驟(7)中所述的樣品的檢測的過程優(yōu)選為將30 μ L由步驟(4)得到的退火雜交產物與120 μ L 4X SSC緩沖液組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，IOmin后， 再滴加50 μ L 4Χ SSC緩沖液，15min之內讀取結果。實現(xiàn)使用上述方法檢測單增李斯特菌和沙門氏菌的試劑盒，包含A、B、C三個分試劑盒。A分試劑盒包含引物、dNTP、DNA連接酶、核酸外切酶和DNA聚合酶及其相配的商品化的酶緩沖液和膠體金核酸試劑條。所述的引物包括引物I和引物2 引物I 為5’ -Bio-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3，，引物2 為5’ -Bio-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’。所述的DNA連接酶優(yōu)選為Taq DNA連接酶，核酸外切酶優(yōu)選為Exco I和Exco III，DNA聚合酶優(yōu)選為Bst DNA聚合酶。所述的膠體金核酸試劑條包含附著于底板(材料為PVC塑料)上且依次緊密相連的樣品板(材料為玻璃纖維)、金墊(材料為玻璃纖維)、硝酸纖維素膜和吸水板(材料為吸水纖維)；所述的緊密連接的方式優(yōu)選為硝酸纖維素膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于硝酸纖維素膜上部的一側并與之重疊2mm，樣品板位于金墊的上部與之重疊2mm，吸水板位于硝酸纖維素膜上部相對于金墊和樣品板的另ー側并與硝酸纖維素膜重疊2_ ;金墊包埋有連接多聚T探針的納米金探針；硝酸纖維素膜上有一條含鏈霉親和素的檢測線和一條含鏈霉親和素和5’端修飾有生物素的多聚A捕捉探針的控制線，檢測線靠近金墊，控制線靠近吸水板；檢測線寬度為2mm與金墊相隔6mm,控制線寬度為2mm與金墊相隔12mm;多聚T探針T的數(shù)量為16個，多聚A捕捉探針A的數(shù)量為16個。B分試劑盒包含限制性內切酶Bspl286 I、EcoT14 I及其商品化的酶緩沖液、5’端磷酸化修飾的鎖式探針B和與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNAB ；所述的鎖式探針B為5，-phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-3，；所述的單鏈DNA B 為5’-Poly (dA)-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚 A 尾 A 的數(shù)量為 16個。C分試劑盒包含限制性內切酶Taq KAlu I及其商品化的酶緩沖液、5’端磷酸化修飾的鎖式探針C和與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNA C ；所述的鎖式探針 C 為5’ -phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3，；所述的單鏈 DNA C 為 5’ -PolyC dA)-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚 A 尾 A 的數(shù)量為16個。分試劑盒A和B —起用于檢測單增李斯特菌；分試劑盒A和C 一起用于檢測沙門氏國。本發(fā)明的基本原理如圖I所示當存在檢測的目的基因片段時，超分支滾環(huán)擴增產生兩端含功能基團的長短不一的雙鏈，該雙鏈與一條帶有多聚A尾的的單鏈序列混合，退火雜交，形成含有空閑雜交位點 的雜交復合物，當將含有該雜交產物的樣品滴加到樣品板上時，通過層析作用，與結合墊處已經包埋有多聚T包被的納米金探針再次雜交，形成”三明治”結構，當其到達已包埋有與引物的功能基團互補的基團或物質的檢測線(T線)處時就會形成一條紅色的線，過量的多聚T包被的納米金探針繼續(xù)層析，到達已包埋有多聚A的控制線(C線)處時形成第二條紅色的線；而不含目的片段吋，檢測線(T線)處因不能形成”三明治”結構的雜交產物，而沒有紅色的線出現(xiàn)，只有過量的多聚T包被的納米金探針繼續(xù)層析，到達已包埋有多聚A捕捉探針的控制線(C線)處時形成一條紅色的線；若檢測線(T線)和控制線(C線)處都無紅色的線出現(xiàn)，則表明試紙條已經失效，檢測失敗，樣品需要重新檢測。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(I)超分支滾環(huán)擴增降低非特異性擴增幾率，不易出現(xiàn)假陽性。設計一條5’端磷酸化修飾的閉合探針，當且僅當閉合探針的5’和3’并列分別與一段待檢測的DNA完全互補配對吋，5’和3’的距離很近，中間沒有隔開ー個堿基的距離，這個時候連接酶就會特異的連接5’和3’，使先前的開環(huán)的閉合探針成為ー個封閉的環(huán)的結構；而當沒有目的DNA存在時，閉合探針就不能與非目的DNA完全互補配對，這樣5’和3’的距離就不會拉近，因此連接酶也就不能將其連接上；(2)可以實現(xiàn)定性或者定量檢測，結果穩(wěn)定；(3)檢測速度快，特異性好，靈敏度高；(4)設備簡單，成本低，無需昂貴的儀器；(5)探針設計簡單，操作步驟簡短，易于推廣。


圖I是本發(fā)明原理圖，超分支滾換擴增原理(A)，試紙條各部位包埋情況(B)，試紙條陽性檢測原理(C)。圖2是13nm膠體金的吸收光譜圖，在520mm處有最大吸收峰。圖3是超分支滾環(huán)擴增的產物的瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果圖；圖4是試紙條的組裝結構及各部分的尺寸圖5是超分支滾環(huán)擴增核酸試紙條檢測單增李斯特菌結果圖，陰性結果(I號試紙條)和陽性結果(2號試紙條)；圖6是超分支滾環(huán)擴增核酸試紙條檢測沙門氏菌的陽性結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進ー步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中所用試劑均購自新英格蘭生物技術公司，試紙條材料及設備均購自上海金標生物有限公司。實施例II.單核增生李斯特菌的DNA的提取及酶切采用TIANamp Bacteria DNA kit抽提單增李斯特菌(菌株號為CMCC54007，購自廣州微生物研究所)基因組DNA。單增李斯特菌的保守序列為表達溶素O基因(hlyA，NCBI編號AF253320)，用EcoT14 I (Sty I )酶和Bspl286 I (Sdu I )酶對單增李斯特菌基因組DNA進行酶切反應。20 μ L Bspl286 I 酶切反應體系
權利要求
1.一種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)食品致病菌基因組DNA的提取及酶切 提取食品致病菌的基因組DNA，根據(jù)食品致病菌的保守序列選擇限制性內切酶對食品致病菌的基因組DNA進行酶切反應得到靶片段； (2)擴增引物及核酸探針序列設計 根據(jù)步驟(I)得到的靶片段序列設計一條5’端磷酸化修飾的鎖式探針； 根據(jù)鎖式探針序列設計兩條擴增方向相反的引物I和引物2，引物I和引物2的5’端修飾有功能基團； 設計一條與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNA ； 設計一條5’端修飾有功能基團的多聚T探針； 設計一條5’端修飾有功能基團的多聚A捕捉探針； (3)超分支滾環(huán)擴增反應 連接反應反應體系包括步驟(I)中所述的靶片段、步驟(2)中所述的鎖式探針、連接酶及其緩沖液和雙蒸水； 消化反應反應體系包括上述連接反應的產物、核酸外切酶及其緩沖液和雙蒸水； 擴增反應反應體系包括上述消化反應的產物、步驟(2)中所述的引物I和引物2、dNTP、聚合酶及其緩沖液和雙蒸水； (4)退火雜交 將超分支滾環(huán)擴增反應產物與步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA退火雜交； (5)納米金探針的制備 納米金的制備用檸檬酸鹽還原法以氯金酸為原料制備納米金； 納米金探針的制備將步驟(2)中所述的多聚T探針與納米金連接制備納米金探針，并用包埋緩沖液重懸納米金探針得到用于包埋的納米金探針； (6)膠體金核酸試紙條的制備 膠體金核酸試紙條由底板、樣品板、金墊、硝酸纖維素膜和吸水板構成，將底板、樣品板、金墊、NC膜和吸水板按如下結構組裝底板在最下層，NC膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于NC膜的上部的一側并與之重疊，樣品板位于金墊的上部與之重疊，吸水板位于硝酸纖維素膜的上部相對于金墊和樣品板的另ー側并與硝酸纖維素膜重疊； 所述的金墊包埋有步驟(5)制備的納米金探針；所述的硝酸纖維素膜上有含鏈霉親和素的檢測線和含鏈霉親和素和多聚A捕捉探針的控制線； (7)樣品的檢測 將由步驟(4)得到的退火雜交產物與檸檬酸鈉緩沖液組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，再滴加檸檬酸鈉緩沖液，讀取結果，檢測線和控制線都變成紅色表明有靶片段存在，即有待測食品致病菌，僅有控制線變成紅色表明沒有待測食品致病菌。
2.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 步驟(2)中所述的鎖式探針分為5’端和3’端與靶片段序列毗鄰互補的區(qū)域和中間與超分支滾環(huán)擴增的引物I和引物2結合的區(qū)域。
步驟(2)中所述的引物I的功能基團為生物素； 步驟(2)中所述的引物2的功能基團為生物素； 步驟(2)中所述的單鏈DNA的多聚A尾為16 32個A ; 步驟(2)中所述的多聚T探針的功能基團為巰基，T的數(shù)量為16 32個； 步驟(2)中所述的多聚A捕捉探針的功能基團為生物素，A的數(shù)量為16 32個。
3.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致·病菌的方法，其特征在干 當所述的食品致病菌為單增李斯特菌時，其保守序列為hlyA基因，用限制性內切酶Bspl286 I和EcoT14 I對單增李斯特菌基因組DNA進行酶切，得到hlyA靶片段，序列為5’ -TCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGC-3’ ； 步驟(2)中所述的5’端磷酸化修飾的鎖式探針的序列為5’ -phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-3，； 步驟(2)中所述的引物 I 為5’ -生物素-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’ ； 步驟(2)中所述的引物2為5’ -生物素-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’ ； 步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA的序列為為5’-Poly (dA)-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚A尾A的數(shù)量為16個； 步驟(2)中所述的多聚T探針的5’端修飾有巰基、T的數(shù)量為16個； 步驟(2)中所述的多聚A捕捉探針5’端修飾有生物素、A的數(shù)量為16個。
4.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 當所述的食品致病菌為沙門氏菌時，其保守序列為irwA基因，用限制性內切酶Taq I和Alu I對沙門氏菌基因組DNA進行酶切，得到invA靶片段，序列為5’-GTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGACTTGTGCCGAAGAGCCGGC-3，； 步驟(2)中所述的5’端磷酸化修飾的鎖式探針的序列為5’ -phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3，； 步驟(2)中所述的引物 I 為5’ -生物素-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAL3’ ； 步驟(2)中所述的引物2為5’ -生物素-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’ ； 步驟(2)中所述的5’端含多聚A尾的單鏈DNA的序列為5’-Poly (dA)-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚A尾為16個A ; 步驟(2)中所述的多聚T探針的5’端修飾有巰基、T的數(shù)量為16個，步驟 (2)中所述的多聚A捕捉探針5’端修飾有生物素、A的數(shù)量為16個。
5.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 步驟(3)中所述的連接酶及其緩沖液為Taq DNA連接酶及其相配的商品化的緩沖液；步驟(3)中所述的連接反應的條件為60°C反應lh，接著95°C反應IOmin ； 步驟(3)中所述的核酸外切酶及其緩沖液為Exco I和Exco III及其相配的商品化的緩沖液； 步驟(3)中所述的消化反應的條件為37°C反應2 4h，接著95V反應IOmin ； 步驟(3)中所述的聚合酶及其緩沖液為Bst DNA聚合酶及其相配的商品化的緩沖液； 步驟(3)中所述的擴增反應的條件為63 65°C反應Ih ； 步驟(4)中所述的退火雜交的反應條件為95°C反應2min，然后37°C反應5min。
6.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 步驟(5)中所述的包埋緩沖液為Na3P0420mM，BSA質量百分比5%，Tween X-100體積百分比O. 25%,鹿糖質量百分比8%。
7.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 步驟(6)中所述的底板的材料為塑料PVC板； 步驟(6)中所述的樣品板的材料為玻璃纖維，其處理方法為用樣品板處理緩沖液浸潤，置于干燥器中室溫保存；所述的樣品板處理緩沖液為PH 8.0，體積百分比O. 25%的Triton X-100,0. 05Μ Tris-HCl,0. 15M NaCl ； 步驟(6)中所述的金墊的材料為玻璃纖維，其的處理方法為用50 μ L步驟(4)中所述的用于包埋的納米金探針噴在其上，室溫下干燥，干燥器中4°C保存； 步驟(6)中所述的硝酸纖維素膜的處理方法為用噴膜儀將6 μ L鏈霉親和素溶液噴到檢測線的位置，將6 μ L鏈霉親和素溶液和多聚A捕捉探針混合液噴到控制線的位置，包埋好探針的硝酸纖維素膜置于室溫下干燥lh，并于4°C干燥保存；所述的鏈霉親和素溶液濃度為I. 67mg/mL，所述的多聚A捕捉探針的濃度為ImM ； 步驟(6)中所述的吸水板的材料為吸水纖維； 步驟(6)中所述的組裝為底板在最下層，硝酸纖維素膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于硝酸纖維素膜的上部的一側并與之重疊2mm，樣品板位于金墊的上部與之重疊2mm，吸水板位于硝酸纖維素膜的上部相對與金墊和樣品板的另ー側并與硝酸纖維素膜重疊2mm,最后用切條機切成4mm寬的條。
8.根據(jù)權利要求I所述的ー種基于超分支滾環(huán)擴增的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法，其特征在干 步驟(7)中所述的樣品的檢測的過程為將30 μ L由步驟(4)得到的退火雜交產物與120 μ L4X檸檬酸鈉緩沖液組成的溶液滴加到膠體金核酸試紙條的樣品板上，IOmin后，再滴加50yL4X檸檬酸鈉緩沖液，15min之內讀取結果。
9.實現(xiàn)權利要求I 8任一項所述方法的試劑盒，其特征在于包含A、B、C三個分試劑盒； A分試劑盒包含引物、dNTP、DNA連接酶、核酸外切酶和DNA聚合酶及其相配的商品化的酶緩沖液和膠體金核酸試劑條； 所述的引物包括引物I和引物2 所述的引物 I 為5’ -生物素-CTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAAT-3’，所述的引物 2 為5’ -生物素-ACCAAGAGCAACTACACGAATTC-3’ ； 所述的膠體金核酸試劑條包含附著于底板上且依次緊密相連的樣品板、金墊、硝酸纖維素膜和吸水板；金墊包埋有連接多聚T探針的納米金探針；硝酸纖維素膜上有一條含鏈霉親和素的檢測線和一條含鏈霉親和素和5’端修飾有生物素的多聚A捕捉探針的控制線，檢測線靠近金墊，控制線靠近吸水板； B分試劑盒包含限制性內切酶Bspl286 I、EcoT14 I及其商品化的酶緩沖液、5’端磷酸化修飾的鎖式探針B和與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNAB ； 所述的鎖式探針 B 為5’ -phosphate-GCGTCTTAGGACTTGCAGGCGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCTGTTTCTTTTCGATTG-3，； 所述的單鏈 DNA B 為5’-Poly (dA)-CAATCGAAAAGAAACAGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGC-3’，多聚 A 尾 A 的數(shù)量為 16 個； C分試劑盒包含限制性內切酶Taq I、Alu I及其商品化的酶緩沖液、5’端磷酸化修飾的鎖式探針C和與鎖式探針互補的5’端含多聚A尾的單鏈DNA C ； 所述的鎖式探針 C 為5’ -phosphate-TCAACGGTACGGTCTCTGTAGAGACGGGATTAGGTTACTGCGATTAGCACAAGCACCAAGAGCAACTACACGAATTCCGGCTCTTCGGCACAAG-3，； 所述的單鏈 DNA C 為 5’-Poly (dA)-CTTGTGCCGAAGAGCCGGAATTCGTGTAGTTGCTCTTGGTGCTTGTGCTAATCGCAGTAACCTAATCCCGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGA-3’，多聚 A 尾 A 的數(shù)量為 16個； 分試劑盒A和B —起用于檢測單增李斯特菌；分試劑盒A和C 一起用于檢測沙門氏菌。
10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其特征在于 所述的連接酶為Taq DNA連接酶；所述的核酸外切酶為Exco I和Exco III ;所述的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶； 所述的緊密連接的方式為硝酸纖維素膜粘貼在底板上的中間部位，金墊位于硝酸纖維素膜上部的一側并與之重疊2mm，樣品板位于金墊的上部與之重疊2mm，吸水板位于硝酸纖維素膜上部相對于金墊和樣品板的另ー側并與硝酸纖維素膜重疊2mm ； 所述的檢測線寬度為2mm與金墊相隔6mm ;所述的控制線寬度為2mm與金墊相隔12mm ； 所述的多聚T探針T的數(shù)量為16個；所述的聚A捕捉探針A的數(shù)量為16個。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于超分支滾環(huán)擴增的的膠體金核酸試紙條檢測食品致病菌的方法及檢測單增李斯特菌和沙門氏菌的試劑盒，屬于生物檢測技術領域。該方法主要的步驟包括(1)食品致病菌DNA的提取及酶切，(2)擴增引物及核酸探針序列設計，(3)超分支滾環(huán)擴增反應，(4)退火雜交，(5)納米金探針的制備，(6)膠體金核酸試紙條的制備，(7)樣品的檢測。當樣品中含有目的基因片段時，膠體金核酸試紙條的T線和C線處都會形成紅線；若樣品中不含目的基因片段，膠體金核酸試紙條只有C線處會形成紅線。本發(fā)明可以快速、特異、靈敏、定性和定量檢測食品樣本中的食品致病菌，其探針設計簡單，操作步驟簡短，易于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102816855SQ20121032164
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權日2012年9月3日
發(fā)明者周小明, 劉宏星, 邢達 申請人:華南師范大學