專利名稱：一株綠色木霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株綠色木霉菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是破壞維管束導(dǎo)致植株死亡的毀滅性病害，其病原菌為尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)。尖孢鐮刀菌古巴專化型4號小種(F0C4)在亞洲和非洲的部分國家以及澳大利亞發(fā)生為害，嚴(yán)重威脅世界第一大香蕉種植品種Cavendi sh的生存。Cavendi sh香蕉于20世紀(jì)60年代取代當(dāng)時大蜜哈而成為世界香蕉第一品種，后者則由于香蕉枯萎病菌I號小種的為害而導(dǎo)致絕產(chǎn)。因而，F(xiàn)0C4的出現(xiàn)和蔓延，引起各香蕉種植國家的高度關(guān)注。F0C4幾乎能侵染所有香蕉種類，如Cavendish、大蜜哈、矮香蕉、棱指蕉,危害最大。·目前對枯萎病的防治還沒有一種有效的化學(xué)農(nóng)藥，而且長期使用化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重威脅。與化學(xué)防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有對環(huán)境友好、成本低、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是未來病害防治的方向。近年來，人們越來越重視木霉作為生防菌應(yīng)用于香蕉栽培的研究，2010年6月吳琳的碩士學(xué)位論文《拮抗香蕉枯萎病的木霉菌株的分離、篩選及應(yīng)用》公開了對拮抗尖孢鐮刀菌古巴?；娃卓剐Ч^好的木霉96株，其中木霉T-C2對尖孢鐮刀菌古巴?；偷霓卓剐Ч詈?。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一株綠色木霉菌。本發(fā)明所提供的綠色木霉菌是綠色木霉(Trichodermaviride) H06,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6229。該菌種已于2012年06月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。本發(fā)明的綠色木霉(Trichodermaviride)H06CGMCC No. 6229在PDA培養(yǎng)基上菌落生長迅速，呈不定型棉絮狀或致密叢束狀，其表面的顏色多呈綠色。菌絲有隔分枝，厚垣孢子有或無。分生孢子梗是菌絲的短側(cè)枝，側(cè)枝上對稱或互生分枝，形成二級和三級分枝，分枝角度為銳角或近于直角，在分枝末端形成瓶狀小梗。分生孢子多為卵圓形，無色或綠色，簇生于小梗頂端。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種殺菌劑。本發(fā)明所提供的殺菌劑，它的活性成分是上述綠色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229。所述綠色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229具體可為分生抱子或/和菌絲體。所述殺菌劑具體可用于防治由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporumf.sp. cubense)引起的植物病害。所述植物病害具體可為香蕉枯萎病。
本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是提供一種制備上述殺菌劑的方法。本發(fā)明所提供的制備殺菌劑的方法，包括在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229的步驟；所述固體培養(yǎng)基由如下物質(zhì)制成600質(zhì)量份玉米粉、160質(zhì)量份小麥麩皮、240質(zhì)量份稻殼、I質(zhì)量份MgS04、l質(zhì)量份KCl和200質(zhì)量份水。其中，培養(yǎng)分為如下三個階段a階段在溫度為25°C、空氣相對濕度為95% (體積百分含量)和不通氣的條件下培養(yǎng)；時間為2d ；b階段然后在溫度為28°C、空氣相對濕度為80% (體積百分含量)和通氣比為O. 5的條件下培養(yǎng)；時間為2d; c階段然后在溫度為29°C、空氣相對濕度為40% (體積百分含量)和通氣比為I的條件下培養(yǎng)；時間為2d。所述通氣比為每分鐘內(nèi)通過發(fā)酵培養(yǎng)基的空氣體積與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比(V /
V· min)。實驗證明，綠色木霉(Trichodermaviride) HO6CGMCC No. 6229對由尖孢鐮刀菌古巴專化型4號小種(F0C4)引起的香蕉枯萎病的防治效果可達(dá)88%,綠色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。分類命名綠色木霉(Trichodermaviride)菌株編號H06保藏機(jī)構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機(jī)構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2012年06月15日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 6229下面結(jié)合具體實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的木霉T-C2 (吳琳的碩士學(xué)位論文《拮抗香蕉枯萎病的木霉菌株的分離、篩選及應(yīng)用》)，公眾可從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所獲得。下述實施例中的尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種(Fusarium oxysporumf. sp. cubense race 4，F(xiàn)0C4) B2 菌株(F0C4-B2)(齊興柱，楊臘英，黃俊生· F0C4 的 2 個過氧化氫酶基因的克隆與表達(dá)分析.及其引起的香蕉苗活性氧迸發(fā)研究中國農(nóng)學(xué)通報2012，28(15) : 163-169，公眾可從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所獲得。實施例I、綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的分離及鑒定I、綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的分離I)菌株的分離篩選步驟如下從中國海南省香蕉種植地選擇枯萎病重發(fā)田中發(fā)病田塊的香蕉植株，采集根部土樣。把土壤樣本風(fēng)干，過篩后稱取IOg放入裝有90mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩，靜置5min后，按梯度濃度法稀至1X10_2、1X10_3、1X10_4。各梯度稀釋液取IOOul涂布于孟加拉紅分離培養(yǎng)基上。28°C恒溫培養(yǎng)4-5d，根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲豐富程度和產(chǎn)孢量等特征挑取有代表性的單菌落純化，純化后轉(zhuǎn)入孟加拉紅斜面培養(yǎng)基保存，作為待測菌株。2)菌株的對峙培養(yǎng)復(fù)篩菌株篩選用大板篩選，木霉生長速度比較快，很快占優(yōu)勢，所以這個步驟要病原菌的孢子濃度高達(dá)IO8CFU/皿而木霉的孢子濃度IO6CFU/皿即可。對峙培養(yǎng)將大板篩出的理想菌株與病原菌做對峙培養(yǎng)，即將木霉和尖孢鐮刀菌點接在平板兩邊緣，相距5cm-6cm，倒置放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次，以僅接種尖孢鐮刀菌菌株為對照，定期觀察木霉對其抑制作用，并記錄菌落生長半徑及相互作用情況，同時做木霉和尖孢鐮刀菌的純培養(yǎng)試驗并記錄菌落滿皿時間。經(jīng)過該對峙培養(yǎng)得到綠色木 霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229。2、綠色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229 的鑒定(I)形態(tài)學(xué)鑒定綠色木霉(Trichodermaviride)H06 CGMCC No. 6229 在 PDA 培養(yǎng)基上菌落生長迅速，呈不定型棉絮狀或致密叢束狀，其表面的顏色多呈綠色。菌絲有隔分枝，厚垣孢子有或無。分生孢子梗是菌絲的短側(cè)枝，側(cè)枝上對稱或互生分枝，形成二級和三級分枝，分枝角度為銳角或近于直角，在分枝末端形成瓶狀小梗。分生孢子多為卵圓形，無色或綠色，簇生于小梗頂端。(2)分子鑒定用于擴(kuò)增綠色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229ITS 序列的上下游引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別為ITS4 5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，和 ITS6 :5 ’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’。以綠色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229 的基因組 DNA 為模板，利用引物 ITS4 及 ITS6進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用DNA回收試劑盒(AXYGEN公司)回收純化后，與T-載體(Takara PMD-19T)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，然后在含有Amp、IPTG、X_Gal的平板土進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并進(jìn)行菌落PCR篩選出重組質(zhì)粒。經(jīng)驗證為目的片段的陽性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過檢索Genbank(http : / / www.nebi.nlm.nih.gov / Blast / ),采用BLAST進(jìn)行序列一致性比較。對所測得的ITS序列與GenBank中已知序列比對，結(jié)果表明，與該菌株ITS序列最為接近的為綠色木霉(Trichoderma viride),其ITS序列同源性為99%。綠色木霉(Tri choderma viride)H06已于2012年06月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6229。實施例2、綠色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229對尖抱鍵刀菌古巴專化型4號小種(F0C4)菌絲的拮抗作用供試菌株綠色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229 和木霉 T-C2。采用平板對峙法，測試綠色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229和木霉T-C2對F0C4-B2的拮抗作用。實驗設(shè)三個處理，分別為木霉H06組、木霉T-C2組和對照組。木霉H06 組的處理方法如下將木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229 和F0C4-B2同時點接在PDA培養(yǎng)基兩邊緣，相距5cm_6cm，倒置放入28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次，定期觀察綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229對其抑制作用，并記錄菌落生長半徑及相互作用情況。木霉T-C2 組的處理方法除將綠色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229替換為木霉T-C2外，其它與木霉H06組的處理方法完全相同。對照組的處理方法除了只接種F0C4-B2不接種其它微生物外，其它與木霉H06組的處理方法完全相同。 測試項目及記載標(biāo)準(zhǔn)如下接種后7d測量上述三個處理中F0C4-B2的直線生長距離，以及木霉H06組和木霉T-C2組中木霉的直線生長距離按以下公式計算抑菌率抑菌率(%)= (dCK-dB) X100/dCK其中dCK:對照組接種7d后F0C4-B2的直線生長距離，單位是cm;dB:木霉H06組或木霉T-C2組接種7d后F0C4-B2的直線生長距離，單位是cm;dT:木霉H06組或木霉T_C2組接種7d后的木霉直線生長距離,單位是cm;結(jié)果如表I所不,結(jié)果表明綠色木霉(Trichoderma viride) H06 CGMCC No. 6229對F0C4-B2的抑菌率為83. 8%，木霉T-C2對F0C4-B2的抑菌率為70. 0%。表I.平板對峙法實驗結(jié)果
編號dTdBdCK抑菌率(％)
對照組8
木霉 H06 組 θΓδO~8^8
木霉 T-C2 組 5Λ2Λ~700實施例3、綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 菌劑的制備木霉菌種綠色木霉(Trichodermaviride) H06CGMCC No. 6229 和木霉 T-C2I、一級平板菌種培養(yǎng)將分離純化的木霉菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板，放入28°C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 5天，待菌絲長滿平板并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)；每1000ml PDA培養(yǎng)基由如下物質(zhì)制成馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，瓊脂20g，用水將培養(yǎng)基定容至1000mL。其配制方法如下將切成小塊的去皮土豆煮沸20分鐘，然后用紗布過濾，在濾液中，按上述配方加入其他成分，用水定容至1000mL，121°C濕熱滅菌半小時得到培養(yǎng)基。2、液體種子培養(yǎng)在1000ml三角瓶中，裝入400ml的液體種子培養(yǎng)基，接入平板菌種，接種量為每IOOOrnl三角瓶接種1/6培養(yǎng)好的一級平板菌種(培養(yǎng)皿規(guī)格90mm)，接種后置于恒溫?fù)u床(28°C, 140轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)3 5天。每IOOOml液體種子培養(yǎng)基按照如下方法配制玉米粉4g，蛋白胨3g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀4g，硫酸鎂3g，二水氯化鈣3g，吐溫O. 2ml，酵母浸膏O. 5g,用水將培養(yǎng)基定容至IOOOmL, 121° C高壓滅菌30分鐘，待冷卻至40°C后接種。3、液體發(fā)酵生產(chǎn)取50升機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，裝入35升液體培養(yǎng)基，按5%接種量(體積比)進(jìn)行接種；培養(yǎng)條件為溫度28°C，通入空氣，通氣量為IOL min，保壓O. 03Mpa，轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)65小時，然后放罐，此時發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子，發(fā)酵液較粘稠。每IOOOml液體培養(yǎng)基按照如下方法配制豆餅粉15g,玉米粉15g和IOOOml水，PH自然；121。C高壓滅菌30分鐘，待冷卻至40°C后接種。
·
4、固體發(fā)酵生產(chǎn)固體培養(yǎng)料按照如下方法配制600質(zhì)量份玉米粉、160質(zhì)量份麩皮(小麥最外層的表皮)、240質(zhì)量份稻殼、I質(zhì)量份MgS04、l質(zhì)量份KC1、200質(zhì)量份水；pH自然，121°C蒸汽滅菌60分鐘。在經(jīng)甲醛和高錳酸鉀薰蒸滅菌的無菌房子內(nèi)接種。將步驟3得到的發(fā)酵產(chǎn)物與固體培養(yǎng)料混合均勻，接種量為30% (即步驟3得到的發(fā)酵產(chǎn)物與固體培養(yǎng)料體積比為30:70)。接種后，將混勻后的混合物裝于淺盤中，各裝入量疏松度和深度一致，然后按如下階段培養(yǎng)a階段在溫度為25°C、空氣相對濕度為95% (體積百分含量)和不通氣的條件下培養(yǎng)；時間為2d ;期間用塑料薄膜覆蓋以保持濕度；該階段菌絲生長階段，要求低溫高濕；b階段在溫度為28 V、空氣相對濕度為80% (體積百分含量)和通氣比為O. 5的條件下培養(yǎng)；時間為2d ;期間改用滅過菌的報紙覆蓋以保持濕度；該階段開始形成孢子，要求高溫中濕；c階段在溫度為29°C、空氣相對濕度為40% (體積百分含量)和通氣比為I的條件下培養(yǎng)；時間為2d ;期間不需要覆蓋；該階段菌要求高溫低濕；所述通氣比為每分鐘內(nèi)通過發(fā)酵培養(yǎng)基的空氣體積與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比(V /
V· min)。上述培養(yǎng)過程中，a階段不能翻料，b和c階段要經(jīng)常進(jìn)行翻料。5、發(fā)酵產(chǎn)物的干燥干燥處理用抽濕機(jī)干燥處理，時間約2d，得到固體菌劑。其中，抽濕的標(biāo)準(zhǔn)為濕度計恒定在30%的室內(nèi)濕度保持ld，固體菌劑含水量10%。結(jié)果表明綠色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No. 6229固體菌劑的抱子含量為5. 16X IO9Cfu/克菌劑，木霉T-C2固體菌劑的孢子含量為I. 15X IO9Cfu/克菌劑。實施例4、盆栽防治香蕉枯萎病試驗供試菌劑實施例3制備的綠色木霉(Trichoderma viride) HO6 CGMCCNo. 6229固體菌劑(孢子含量為5. 16 X IO9Cfu/克菌劑)，木霉T-C2固體菌劑(孢子含量為
I.15 X IO9Cfu/ 克菌劑)。供試的香蕉苗為巴西蕉幼苗，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心提供。
盆栽設(shè)計實驗設(shè)三個處理，分別為木霉H06組、木霉T-C2組和對照組。木霉H06組的處理方法如下將20盆(5片葉)巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml綠色木霉(Trichoderma viride) HO6CGMCC No. 6229孢子懸液(用水懸浮實施例3制備的綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229固體菌劑使綠色木霉(Trichoderma viride) H06CGMCC No. 6229 的含量為 107CFU/ml )，三天后，每盆的土壤中均施入100ml F0C4-B2孢子懸液(用水懸浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量為IO6CFU/ml )，之后在溫室大棚里常溫培養(yǎng)，50天后，調(diào)查香蕉發(fā)病情況及病情指數(shù)。木霉T-C2組的處理方法如下將20盆(5片葉)巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml木霉T-C2組孢子懸液(用水懸浮實施例3制備的木霉T-C2固體菌劑使木霉T-C2的含量為107CFU/ml)，三天后，每盆的土壤中均施入100ml F0C4-B2孢子懸液(用水懸浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量為106CFU/ml )，之后在溫室大棚里常溫培養(yǎng)，50 天后，調(diào)查香蕉發(fā)病情況及病情指數(shù)。對照組的處理方法如下將20盆苗齡與上述木霉H06組施入F0C4-B2時相同的巴西蕉幼苗(I株/盆)每盆的土壤中均施入IOOml尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種B2菌株(F0C4-B2)孢子懸液(用水懸浮F0C4-B2孢子使F0C4-B2孢子的含量為106CFU/ml)，之后在溫室大棚里常溫培養(yǎng)，50天后，調(diào)查香蕉發(fā)病情況及病情指數(shù)。結(jié)果如表2所不,說明綠色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No. 6229對香蕉枯萎病具有很好的防病效果。將香蕉枯萎病分為以下5個標(biāo)準(zhǔn)O級植株無枯黃癥狀。I級植株下部葉片出現(xiàn)輕微的枯黃癥狀，嫩葉完好，少部分根系輕微褐變，莖部出現(xiàn)水潰狀褐變。2級植株下部葉片出現(xiàn)明顯的枯黃癥狀，但嫩葉完好，根系出現(xiàn)褐變，莖部和假莖部出現(xiàn)水潰狀褐變。3級整個植株出現(xiàn)枯黃癥狀，根系褐變腐爛，莖部和假莖部褐變連片，少數(shù)葉柄出現(xiàn)紅褐。4級植株出現(xiàn)枯萎死亡癥狀，根系嚴(yán)重褐變腐爛。
病情指數(shù): immmmmmwm χ蘭％
總數(shù)X域高級代表值
防病效果=(對麗_情指數(shù)-處HfWjjfiD X 100%
對照病情指數(shù)表2、木霉菌劑對香蕉枯萎病的防治效果
權(quán)利要求
1.綠色木霉(Trichodermaviride),其特征在于所述綠色木霉(Trichodermaviride)的菌株號為H06，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為 CGMCC No. 6229。
2.權(quán)利要求I所述的綠色木霉(Trichodermaviride)在生產(chǎn)分生孢子和/或菌絲體中的應(yīng)用。
3.一種殺菌劑,它的活性成分是權(quán)利要求I所述的綠色木霉(Trichoderma viride)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殺菌劑,其特征在于所述綠色木霉(Trichodermaviride)為分生孢子或/和菌絲體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的殺菌劑，其特征在于所述殺菌劑用于防治由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的殺菌劑，其特征在于所述植物病害為香蕉枯萎病。
7.權(quán)利要求I所述的綠色木霉(Trichodermaviride)在制備植物殺菌劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺菌劑的靶標(biāo)菌為尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺菌劑用于防治香蕉枯萎病。
10.制備權(quán)利要求3或4所述殺菌劑的方法，包括在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的綠色木霉的步驟；所述固體培養(yǎng)基由如下物質(zhì)制成600質(zhì)量份玉米粉、160質(zhì)量份麩皮、240質(zhì)量份稻殼、I質(zhì)量份MgS04、I質(zhì)量份KCl和200質(zhì)量份水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株綠色木霉菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的綠色木霉菌是所述綠色木霉(Trichoderma viride)H06，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.6229。本發(fā)明的綠色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229對由尖孢鐮刀菌古巴專化型4號小種(FOC4)引起的香蕉枯萎病的防治效果可達(dá)88%，綠色木霉(Trichoderma viride)H06CGMCC No.6229培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N3/00GK102839131SQ201210323738
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者黃俊生, 梁昌聰, 楊臘英, 吳 琳, 王亞 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所