專利名稱：：一種HIV-1肽Env_120-128特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種Hiv-I肽特異性T細(xì)胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于艾滋及艾滋/結(jié)核共感染疾病基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染得到的CD8+T細(xì)胞及其在制備抗艾滋及艾滋/結(jié)核共感染疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)即艾滋病病毒,入侵人體后將嚴(yán)重破壞人體免疫力，使各種罕見感染及癌癥得以在人體內(nèi)發(fā)生，最終形成艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)。HIV主要存在于HIV感染者或艾滋病患者體液中，任何能夠引起體液交換的行為都有傳播HIV的可能，包括性接觸傳播、血液傳播及母嬰傳播。自上世紀(jì)80年代HIV開始在人類中傳播以來，將近6000萬人感染，其中2500萬人死亡。目前尚無可根除HIV、根治艾滋病的藥物，也沒有證據(jù)表明人體會對HIV產(chǎn)生保護(hù)性免疫，因此大多數(shù)艾滋病病人死于反復(fù)繼發(fā)感染及腫瘤。艾滋病的治療一方面是抑制病毒在體內(nèi)的繁殖，增強(qiáng)免疫功能；另一方面是防治機(jī)會性感染，緩解癥狀，延長生命。早期治療和預(yù)防其它感染可延緩病程發(fā)展，提高生活質(zhì)量。目前臨床上常用的治療方法有以下幾個方面(1)聯(lián)合使用幾種抗逆轉(zhuǎn)錄毒藥物的“雞尾酒療法”實(shí)施抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，其在降低發(fā)病率和病死率、提高生活質(zhì)量方面有明顯作用；(2)針對各種機(jī)會性感染的抗生素對癥治療與預(yù)防，包括腫瘤的化療和對癥治療；(3)其他，包括免疫調(diào)節(jié)治療、營養(yǎng)支持治療和中醫(yī)藥治療等。HIV-I肽Env12Q_128，即艾滋病病毒HIV-1包膜蛋白gpl60的第120-128位氨基酸構(gòu)成的肽表位(KLTPLCVTL)，存在于80%的多變性HIV-I肽序列中，在HIV-IB亞型病毒株中具有最高度的保守性，可被表達(dá)HLA-A*0201的個體識別。T細(xì)胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)是所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，在T細(xì)胞抗原識別中起關(guān)鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構(gòu)成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其胞質(zhì)區(qū)很短，信號傳遞主要通過與其以非共價鍵結(jié)合的CD3分子進(jìn)行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)(Va、νβ)又各有三個高變區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識別MHC-抗原肽復(fù)合體時，⑶R1XDR2識別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。根據(jù)TCRνα、νβ基因的同源性，可將80多個TCRVa基因分為32個家族、60多個TCRνβ基因分為24個家族。利用每個T細(xì)胞克隆均有其獨(dú)特CDR3序列的特點(diǎn)，采用CDR3譜型分析技術(shù)，可測定各TCR家族各CDR3出現(xiàn)的頻率，由此反映T細(xì)胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細(xì)胞中，針對各種抗原的T細(xì)胞克隆分布均勻，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具體地，表現(xiàn)為各家族均出現(xiàn)呈高斯分布的約8個CDR3峰；抗原刺激則引起識別該抗原的某一個或幾個特異TCR家族T細(xì)胞反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為該家族CDR3成員出現(xiàn)少于4個峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現(xiàn)為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對該家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，可獲得抗原特異TCRCDR3序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于篩選出HIV-I肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特異的TCR基因，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到⑶8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)HIV-I肽Eiw12ch128特異TCR的⑶8+T細(xì)胞，以及該經(jīng)過TCR基因修飾的⑶8+T細(xì)胞在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是HIV-I肽Eiw12ch128特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的CDR3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。優(yōu)選的，所述HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的α鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述Hiv-I肽Env120^128特異性TCR的α鏈氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。編碼Hiv-I肽Eiw12ch128特異性TCR的基因。一種HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有編碼HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR的基因。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有SEQIDNO:13所示基因。優(yōu)選的，上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的出發(fā)載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞。HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR，編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒，該逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗艾滋病、艾滋/結(jié)核共感染疾病藥物中的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案的具體步驟流程如下I、篩選HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特異的TCR①采用淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②計數(shù)PBMC，調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，每孔細(xì)胞分別加入含HIV肽Eiw12ch12850ng/ml的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；③培養(yǎng)2h后，加入25U/mlIL-2,第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天；④磁珠分選出⑶8+T細(xì)胞，提取其mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑤互補(bǔ)決定區(qū)3(complementaritydeterminingregion3,CDR3)譜型分析檢測刺激前后⑶R3譜型，找出刺激后呈單克隆增生的HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特異的TCRα、β基因家族。2、構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①根據(jù)GeneBank報道的人TCRα、β基因家族上游可變區(qū)(variableregion,V)和下游恒定區(qū)(constantregion,C)基因序列，設(shè)計TCRα、β鏈全長基因上、下游引物,擴(kuò)增出HIV肽特異的TCRα、β全長基因。②設(shè)計含TCRα、β鏈C區(qū)下游與⑶3ζ分子融合位點(diǎn)的重組引物，將HIV肽特異的TCRα、β基因片段與⑶3ζ分子進(jìn)行融合。該步驟的目的在于減少內(nèi)外源性TCRα、β鏈的錯配，因為⑶8+T細(xì)胞存在內(nèi)源性TCRα、β基因的表達(dá)，通過以⑶3ζ鏈替換α、β全長基因部分C區(qū)可以促使外源性α與β基因表達(dá)的蛋白正確裝配成TCR蛋白分子并穩(wěn)定表達(dá)在CD8+T細(xì)胞表面，同時可以避免競爭結(jié)合CD8+T細(xì)胞表面的CD3分子，增強(qiáng)內(nèi)外源性TCR的信號傳導(dǎo)功能，提高修飾后CD8+T細(xì)胞的抗HIV活性。當(dāng)然，此處還可以采取其他策略來減少內(nèi)外源性TCRα、β鏈的錯配，如將α、β鏈C區(qū)的9個氨基酸分別用鼠C區(qū)相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸替換(LuoW，ZhangXB,HuangYT,HaoPP,JiangZM,WenQ,ZhouMQ,JinQ,MaL.DevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011,89(9):903-13);在外源性α、β基因C區(qū)引入二硫鍵(Boulter,J.M.etal.(2003)Stable,solubleT—cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突變外源性α、β基因C區(qū)關(guān)鍵氨基酸以改變α、β鏈之間的靜電荷(Voss,R.H.etal.(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Tmmunol·180,391-401);將外源性α、β基因V區(qū)合并為一條單鏈TCR并與CD3ζ鏈融合(Willemsen，R.A.etal.(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneTher.7,1369-1377);利用2A連接外源性ct、β基因?qū)崿F(xiàn)平衡表達(dá)(LeisegangM,EngelsB,MeyerhuberP,KiebackE,SommermeyerD,XueSA,ReussS，StaussH,Uckertff.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008,86:573-583.)等。③通過F2A上的AgeI酶切位點(diǎn)將HIV肽特異的α-⑶3ζ、β-⑶3ζ融合基因進(jìn)行拼接。④將測序正確的1^011(^-0)34424-1^0}^0-0)34融合基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP并酶切鑒定。⑤采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pMX-hVβhCβ-CD3ζ_F2A_hVahCa-CD3ζ-IRES-GFP與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細(xì)胞。⑥收集48h_72h病毒上清，低溫超速離心濃縮純化病毒。⑦重組病毒感染NIH3T3細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒滴度，計算公式病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞數(shù)XGFP陽性率/病毒濃縮液量(ml)。3、鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗結(jié)核和抗HIV活性①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型供者外周血PBMC；②磁珠分選CD8+T細(xì)胞；③IL-2和抗CD3單抗活化分選出的T細(xì)胞；④按感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)=13將上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染CD8.T細(xì)胞；⑤使用IL-2和抗⑶3單抗刺激感染后的⑶8+T細(xì)胞；⑥流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒感染后GFP表達(dá)陽性細(xì)胞的百分比；⑦測定病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗HIV活性實(shí)驗設(shè)置陰性對照組(HIV肽Eiw12ch128特異TCR基因修飾的⑶8+T細(xì)胞+樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC))、未轉(zhuǎn)染組(未轉(zhuǎn)染CD8.T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Env120^128的DC)、空載體轉(zhuǎn)染組(空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Eiw12ch128的DC)、無關(guān)肽組(HIV肽Eiw12ch128特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載CMVpp65495_503的DC)、HIVTd+HIV-DC組(HIV肽Env120^128特異TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞+負(fù)載HIV肽Eiw12ch128的DC)。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)檢測CD8+T細(xì)胞對DC的殺傷活性。其中，CD8+T細(xì)胞是人體內(nèi)的一種細(xì)胞亞群，可由人外周血中分離獲得，并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，分離和培養(yǎng)的實(shí)驗設(shè)備要求低，技術(shù)成熟。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒序列構(gòu)建的基因運(yùn)載工具，能夠攜帶外源基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并整合到染色體基因組上，目前已成為商業(yè)化產(chǎn)品，容易購買和獲得。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常用的分子克隆技術(shù)，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方法是目前常用的生物技術(shù)手段，除本發(fā)明中使用的人工脂質(zhì)體法外，還可以使用其它化學(xué)轉(zhuǎn)染法，包括=DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法；以及物理方法，包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功篩選出HIV肽Eiw12ch128特異的TCR，攜帶該肽特異TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識別HIV肽Eiw12ch128并介導(dǎo)IFN-Y、TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/結(jié)核共感染疾病基因治療的應(yīng)用價值，可為艾滋病及艾滋/結(jié)核共感染疾病的過繼細(xì)胞免疫治療開辟新徑。圖IHIV肽Env120^128刺激前后CD8.T細(xì)胞TCRα和β鏈CDR3譜型分析；圖2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP構(gòu)建示意圖3pMX-hVβ18hCP-CD3ζ-F2A-hVaIlhCa-CD3ζ-IRES-GFP的酶切鑒定(Μ.DL15000marker；1.pMX-IRES-GFP空載體；2.pMX-IRES-GFP空載體的XhoI酶切產(chǎn)物；3.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP；4.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP的XhoI酶切產(chǎn)物；5.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP的Xhol+Notl雙酶切產(chǎn)物)；圖4熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)(XlO)(a.明場；b.熒光；c.置加圖);圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞的GFP表達(dá)陽性率(a.未轉(zhuǎn)染；b.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP)；圖6熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(X10；EmTd:空載體轉(zhuǎn)染組；HIVTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(UnTd:未轉(zhuǎn)染組；EmTd空載體轉(zhuǎn)染組；HIVTd:重組病毒轉(zhuǎn)染組)；圖8ELISA檢測⑶8+T細(xì)胞IFN-Y的分泌水平；圖9ELISA檢測⑶8+T細(xì)胞TNF-α的分泌水平；圖10TRFIA檢測⑶8+T細(xì)胞的殺傷活性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中，所有計量資料結(jié)果用±s表示，采用單因素方差分析(One-Way八勵￥4)比較各組間細(xì)胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差異，方差不齊時用Welch校正，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較，方差不齊時采用Dunnett’sT3法校正。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗。采用SPSS17.Oforwindows統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例I.篩選HIV-I肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特異的TCRI.I密度梯度離心法分離純化PBMC(1)在15ml刻度無菌離心管加入適量Ficoll淋巴細(xì)胞分離液；(2)取肝素抗凝的外周靜脈血與等量RPMI1640液充分混勻稀釋，用巴斯德滴管吸取2倍體積的抗凝血沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平離心2030min；(3)離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和稀釋液，管底主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的灰白色云霧層；(4)用吸管插到灰白色層，吸取單個核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)，加入5倍以上體積的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min離心lOmin，洗滌細(xì)胞兩次去除大部分混雜的血小板后為PBMC；(5)細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活力檢測PBMC細(xì)胞懸液與1/10體積的O.4%臺酚藍(lán)染液混合，于血球計數(shù)板上計數(shù)板上角上四個大方格總細(xì)胞數(shù)，總細(xì)胞數(shù)的四分之一數(shù)乘以IO4即為每毫升濃度；死細(xì)胞可著色臺盼藍(lán)，活的不著色，計數(shù)200個淋巴細(xì)胞，計算活細(xì)胞百分率[活細(xì)胞率％=(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X100%]。I.2制備HIV肽Eiw12ch128特異T細(xì)胞克隆(1)計數(shù)PBMC,調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，分別加入含HIV-1肽Env120^12850ng/ml的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；(2)37。C、5%CO2條件下培養(yǎng)2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天。I.3免疫磁珠(德國美天旎生物公司)分選⑶8+T細(xì)胞I.4總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述收集到的細(xì)胞沉淀的總RNAI.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR擴(kuò)增34個TCRVa基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.)利用34條TCRVa家族特異性上游引物和共用下游Cα外、內(nèi)側(cè)引物做半巢式PCR:第一輪PCR:每樣本做34個PCR反應(yīng)管，第I34管分別加入TCRVaI至Va34家族上游引物，每管加共用下游Cα外側(cè)引物Iμ1，各引物濃度均為10μΜ。每PCR反應(yīng)管體積為25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2·5μ1，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min;95°C30s,60°C30s，72。Clmin，35個循環(huán)；72。C延伸lOmin。第二輪PCR:反應(yīng)總體積為25μ1，含第一輪PCR產(chǎn)物2μl，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U，TCRVα34條家族上游引物1μ1，下游FAM標(biāo)記內(nèi)側(cè)Ca引物Iμ1，各引物濃度均為10μM。PCR反應(yīng)條件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4個循環(huán)。I.7PCR擴(kuò)增24個TCRνβ基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.)每樣本做24個PCR反應(yīng)管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物Iμ1，第I至第24管分別加入TCRνβ至TCRVβ24上游引物Iμ1，各引物濃度均為10μM15PCR反應(yīng)體積為25μ1，含cDNA模板Iμ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件94。C變性3min;94。Clmin,55°Clmin，72。Clmin,35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。1.8瓊脂糖凝膠電泳取34個TCRVa和24個TCRνβ基因家族PCR產(chǎn)物各5μ1，2%瓊脂糖凝膠電泳，110V，20min,采用凝膠成像系統(tǒng)照相。剩余PCR產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆?。I.9CDR3譜型分析取34個Va、24個νβ基因家族FAM熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物2μ1，在373DNA序列分析儀(ABI,PerkinElmer)上進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集電泳過程中不同時間出現(xiàn)的不同強(qiáng)度的熒光信號，GeneScan672軟件自動分析收集的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為不同位置、高度和形態(tài)的峰，代表各TCR家族CDR3成員出現(xiàn)的頻率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有單峰分布的TCR家族即是抗原特異性單克隆增生的TCR家族。⑶R3譜型分析結(jié)果顯示，抗原肽刺激⑶8+T細(xì)胞后，部分TCR基因家族譜型發(fā)生改變，由原來的8個或多于8個峰型的高斯分布變?yōu)樯儆?個峰的單寡峰分布，表明這些家族是由于抗原肽持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出刺激前為多克隆，HIV肽刺激后分別呈單克隆擴(kuò)增的Va11、νβ18基因家族(圖I)。測序顯示，HIV-I肽Env120_128(KLTPLCVTL)特異的TCRVa11、νβ18的CDR3區(qū)的核苷酸序列如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，兩條⑶R3序列編碼的氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(構(gòu)建流程見圖2)2.I合成引物依據(jù)TCR⑶R3譜型，篩選出刺激前呈多克隆峰型、刺激后為單峰的TCRVa、νβ基因家族，依據(jù)GeneBank報道的該基因家族V區(qū)序列設(shè)計全長基因上、下游引物，依據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計與CD3(分子融合處的重組引物，依據(jù)F2A肽連接序列設(shè)計重組引物，全部引物由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱和序列(5，to3’)如下權(quán)利要求1.HIV-l肽EnVl2(l_128特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR，其特征在于，所述TCR的α鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR，其特征在于，所述α鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.編碼權(quán)利要求I3任一項所述TCR的基因。5.—種HIV-I肽Env120^128特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有權(quán)利要求4或5所述的基因。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，出發(fā)載體包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。9.權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞。10.權(quán)利要求I3任一項所述的HIV-I肽Eiw12ch128特異性TCR、權(quán)利要求4或5所述的基因、權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、權(quán)利要求8所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒、權(quán)利要求9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗艾滋病、艾滋/結(jié)核共感染疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種HIV-1肽Env120-128特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用。本發(fā)明成功篩選出HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)特異的TCR基因，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到CD8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)HIV-1肽Env120-128特異TCR的CD8+T細(xì)胞。該經(jīng)過TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識別HIV肽Env120-128并介導(dǎo)IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/結(jié)核共感染疾病基因治療的應(yīng)用價值，可為艾滋病及艾滋/結(jié)核共感染疾病的過繼細(xì)胞免疫治療開辟新徑。文檔編號C12N15/867GK102875667SQ201210326568公開日2013年1月16日申請日期2012年9月5日優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日發(fā)明者馬驪,郝佩佩,溫茜,羅微申請人:南方醫(yī)科大學(xué)