專利名稱：一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用。
背景技術：
阿托伐他汀鈣是立普妥(Iipitor)的活性成分，立普妥是一種羥甲基戊二酰單酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，可使體內(nèi)膽固醇的合成減少,被用于治療高膽固醇血癥和混合型高脂血癥，冠心病和腦中風等疾病。阿托伐他汀鈣含兩個手性中心的側(cè)鏈是其藥效團，該側(cè)鏈的合成方法包括利用金屬催化劑從手性前體出發(fā)進行合成，或利用游離或固定化酶或含酶的完整細胞進行不對稱合成或外消旋拆分。由于生物法具有反應條件溫和、反應轉(zhuǎn)化率高、對映體選 擇性高等多種優(yōu)點，受到研究者的廣泛關注。鹵醇脫鹵酶(HHDH)是一類可以催化鄰鹵醇類化合物生成環(huán)氧化物的酶，因其能夠催化鄰鹵醇與環(huán)氧化合物之間的相互轉(zhuǎn)化，可用于合成多種化學中間體，并被用于阿托伐他汀鈣中間體的制備。1968年Castro首次在黃桿菌屬菌株(Flavobaterium sp.)中發(fā)現(xiàn)了鹵醇脫鹵酶，此后，人們相繼篩選到了多種產(chǎn)齒醇脫齒酶的菌株，如發(fā)射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter) ADl,根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens),節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. ) AD2,棒狀桿菌(Corynebacterium sp.),分枝桿菌(Mycobacterium sp. )GP1等。在已知的齒醇脫齒酶中，大部分已被克隆、測序及進行體外重組表達研究。目前對鹵醇脫鹵酶的研究集中于發(fā)現(xiàn)催化反應時間短、產(chǎn)物產(chǎn)率高、對映體選擇性高且副反應少的鹵醇脫鹵酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其編碼的鹵醇脫鹵酶。本發(fā)明的另一目的是提供含有該鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供含有該鹵醇脫鹵酶基因突變體的基因工程菌。本發(fā)明的又一目的是提供該該鹵醇脫鹵酶基因突變體的應用。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體編碼的鹵醇脫鹵酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。一種含有本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。所述的重組載體其可通過本領域常規(guī)方法將本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可為本領域常規(guī)的各種載體，優(yōu)選PUC18。含有本發(fā)明的鹵醇脫鹵酶基因突變體或其重組表達載體的基因工程菌。本發(fā)明基因工程菌優(yōu)選大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)或大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 a作為宿主細胞。將前述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中，即可得到本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌。本發(fā)明所述的基因工程菌進一步優(yōu)選大腸桿菌DH5aHhec05 (Escherichia coliDH5aHhec05)，已于2012年8月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO M 2012320。一種鹵醇脫鹵 酶的制備方法，包括如下步驟培養(yǎng)本發(fā)明所述的含有鹵醇脫鹵酶基因突變體的基因工程菌，獲得重組表達的鹵醇脫鹵酶。所述的培養(yǎng)包括藥搖培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)；優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl 6g/L,磷酸氫二鉀4. 2g/L,磷酸二氫鉀8. 5g/L,硫酸銨0. 5g/L,硫酸亞鐵I. Og/L,硫酸鋅七水合物0. 5g/L，氯化鈣二水合物0. 06g/L，硫酸錳二水合物0. 2g/L，硫酸銅七水合物
0.6g/L，氯化鈷六水合物0. 9g/L。所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選的生產(chǎn)罐發(fā)酵條件是罐溫37 °C，攪拌轉(zhuǎn)速900rpm左右，發(fā)酵過程中控制DO 30%以上，空氣流量I: I. 5vvm,甘油殘余量1%以下。發(fā)酵過程采用常規(guī)的兩階段控制策略發(fā)酵前期即菌體生長階段，控制發(fā)酵液pH
6.8左右，罐溫35-37°C ;發(fā)酵后期即添加IPTG之后的鹵醇脫鹵酶誘導表達階段，控制發(fā)酵液pH 7.0左右，罐溫為28-30°C。以使發(fā)酵前期菌體大量繁殖，發(fā)酵后期鹵醇脫鹵酶大量表達。所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體在鄰鹵醇化合物脫鹵素反應中的應用，利用本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體構(gòu)建基因工程菌，并表達制備鹵醇脫鹵酶，以所述的鹵醇脫鹵酶為催化劑催化鄰鹵醇化合物脫鹵素反應。 所述的鄰鹵醇化合物脫鹵素反應的底物的結(jié)構(gòu)式為
OH O其中，X為鹵素；R為烷基，苯基或帶有取代基的苯基。所述的鄰鹵醇化合物脫鹵素反應的反應方程式為
OH OOH O
IHHDHI
xJ-L + NaCN —CM、+ NaCI
'OR'OR,其中，X為鹵素；R為烷基，苯基或帶有取代基的苯基。所述的鹵醇脫鹵酶優(yōu)選分兩批加入，以縮短反應時間，降低酶用量。有益效果本發(fā)明以NCBI登錄號為AF397296的鹵醇脫鹵酶基因為模板，通過對其進行突變，從而獲得該鹵醇脫鹵酶基因突變體，其基因序列為SEQ ID NO. I。本發(fā)明以此為基礎，構(gòu)建了含有該鹵醇脫鹵酶基因突變體的工程菌，通過培養(yǎng)該基因工程菌制備鹵醇脫鹵酶，利用優(yōu)化的發(fā)酵條件，極大的提高了所制備的鹵醇脫鹵酶的產(chǎn)量和催化活性(酶活989U)。將制得的鹵醇脫鹵酶應用于(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)，在相同的生產(chǎn)條件下，產(chǎn)品的產(chǎn)率也有較大提高，達到93. 6% (專利CN 102168117報道為86. 29%);且鹵醇脫鹵酶用量較少，僅為20. 2kg (專利CN 102168117報道為64kg)，極大的降低了生產(chǎn)成本。生物樣品保藏信息大腸桿菌DH5 a Hhec05 (Escherichia coli DH5 a Hhec05),于 2012 年 8 月 29 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國，武漢，武漢大學，保藏號為CCTCC NO M2012320。
具體實施例方式實施例I基因工程菌的建立 通過NCBI查閱鹵醇脫鹵酶的基因(NCBI登錄號為AF397296 );人工合成鹵醇脫鹵酶基因片段，以該基因片段為模板，PCR擴增鹵醇脫鹵酶的基因片段(片段兩端加Hind3和EcoRl內(nèi)切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，并利用Hind3和EcoRl內(nèi)切酶位點將鹵醇脫鹵酶基因插入至Pucl8質(zhì)粒中，將連接后載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中建立鹵醇脫鹵酶基因工程菌。其中，PCR反應擴增鹵醇脫鹵酶引物為正向引物Fl 5 ’ -TACAGTTGGCGTTAACATTG-3 ’( SEQ ID NO. 4 )，反向引物 F2 :5 ’ -CCGGACCATACGGGCTCATC-3 ’(SEQ ID NO. 5)。實施例2鹵醇脫鹵酶突變體基因的獲得本研究利用易錯PCR隨機突變的方法，對鹵醇脫鹵酶進行了蛋白質(zhì)工程改造。易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調(diào)整反應條件，如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機突變體。本研究采用較低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向擴增產(chǎn)物中摻入隨機突變的原理，同時利用Mn2+替代天然輔助因子Mg2+增加易錯概率。IOOu L PCR 體系如下10XPCR Buffer 10 y L，dATP (100mmol/L) 0. 2 y L，dGTP(lOOmmol/L)0. 2u L, dCTP(lOOmmol/L)Iu L, dTTP(IOOmmoI/L)Iu L, MgCl2 (5mmol/L) 20 u L, MnCl2 (0. 2mmol/L) I u L, FlPrimer (10 u mol/L) I u L, F2Primer (10 u mol/L) I u L,大量抽提Pucl8_Hhec質(zhì)粒DNA I U L, Taq DNA Polymerase 2U,再加入滅菌超純水到100 u L。PCR反應條件為95°C預變性IOmin ;94°C變性45s，55°C變性45s及72°C變性90s進行30個循環(huán)；于72°C下繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。實驗流程按照實施例I的方法PCR擴增鹵醇脫鹵酶基因并利用Hind3和EcoRl內(nèi)切酶位點將基因插入至Pucl8質(zhì)粒中得到Pucl8-Hhec質(zhì)粒，作為基因突變模板；易錯PCR擴增鹵醇脫鹵酶的基因，擴增后基因片段鏈接至PuclS-T載體，將連接后載體轉(zhuǎn)入之大腸桿菌DH5 a中建立擴展鹵醇脫鹵酶基因突變文庫；利用大腸桿菌DH5a為宿主，Pucl8質(zhì)粒為載體，表達鹵醇脫鹵酶，通過測定醇脫鹵酶活性(方法見實施例3)，高通量篩選高活性突變株；
突變后高活性鹵醇脫鹵酶基因進行鑒定。篩選出的高活性鹵醇脫鹵酶突變體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。鹵醇脫鹵酶引物為正向引物Fl :5’-TACAGITGGCGITAACAITG-3’ (SEQ ID NO. 4)反向引物F2 :5’-CCGGACCATACGGGCTCATC-3’ (SEQ ID NO. 5)按實施例I所述方法構(gòu)建表達該鹵醇脫鹵酶突變體的基因工程菌，并將其命名為E. coliDH5aHhec 05，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO M 2012320。實施例3鹵醇脫鹵酶的制備及酶活測定將實施例I或?qū)嵤├?所得的重組大腸桿菌接種至含50 U g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，Nacl 10g/L，pH7. 0)中，于37°C，200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)12小時以上。轉(zhuǎn)接2mL菌體培養(yǎng)液于50mL含50 y g/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng) 基中，置于同樣條件下振蕩培養(yǎng)，定時測量菌液在600nm下的吸光值以監(jiān)測菌體生長密度。當菌液的0D600值在0. 8-1. 0時，加入誘導劑IPTG至終濃度為0. 8mmol/L,將培養(yǎng)液置于37°C，200rpm的搖床中誘導表達10h。此后通過離心收集菌體，經(jīng)細胞破碎、離心、濃縮、冷凍干燥等處理得到鹵醇脫鹵酶或鹵醇脫鹵酶突變體的粉末。齒醇脫齒酶酶活力的測定方法為30 V恒溫條件下，在含有5mmol/L(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(2-溴乙醇)的50mM Tris/S04緩沖液(pH8. 0)中，每分鐘降解底物生產(chǎn)I U mol溴離子的酶量定義為一個單位(U)。 據(jù)此測定野生型鹵醇脫鹵酶的酶活為109U，篩選出的鹵醇脫鹵酶突變體的酶活為386U。實施例4重組鹵醇脫鹵酶的發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母提取物20g/L，甘油10g/L，NaCl 6g/L，磷酸氫二鉀4. 2g/L,磷酸二氫鉀8. 5g/L，硫酸銨0. 5g/L，硫酸亞鐵I. Og/L,硫酸鋅七水合物0. 5g/L，氯化鈣二水合物0. 06g/L，硫酸錳二水合物0. 2g/L，硫酸銅七水合物0. 6g/L，氯化鈷六水合物0. 9g/L0發(fā)酵液pH 6. 8-7. 0，罐溫35-37°C，攪拌轉(zhuǎn)速900rpm左右，發(fā)酵過程中控制DO 30%以上，空氣流量I: I. 5vvm,甘油殘余量1%以下。接入0D600為I. 2的保藏號為CCTCC NO M2012320的基因工程菌E. coli DH5 a Hhec 06種子液，接入量為發(fā)酵液體積的6%，發(fā)酵前期即菌體生長階段，控制發(fā)酵液pH 6. 8左右，罐溫28-30°C，當發(fā)酵液0D600達50時加入IPTG至終濃度lmmol/L以誘導鹵醇脫鹵酶的表達，此后繼續(xù)發(fā)酵15小時，控制發(fā)酵液pH7.0左右，罐溫為28-30°C。發(fā)酵過程中用氨水調(diào)節(jié)pH值。當發(fā)酵液中甘油含量低于5g/L時，為維持培養(yǎng)物的生長，補加如下組成的物料甘油200g/L，硫酸亞鐵100mg/L，硫酸鋅七水合物50mg/L,氯化韓二水合物10mg/L,硫酸猛二水合物20mg/L,硫酸銅七水合物50mg/L,氯化鈷六水合物80mg/L，pH 7.0。發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)物冷卻至4°C保存。將保存的發(fā)酵液經(jīng)5000G離心50min、細胞破碎、冷凍干燥等常規(guī)處理，制備得到鹵醇脫鹵酶凍干粉并于_80°C保存。測定生產(chǎn)得到的鹵醇脫鹵酶突變體的酶活為989U/mL。實施例5重組鹵醇脫鹵酶催化制備(R) -4-氰基-3-羥基丁酸叔乙酯在5000L反應釜中，釜內(nèi)加入含有回收的HCN和氰化鈉混合的水溶液(氰基含量I. 95kmol),并用硫酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 0-7. 5，期間始終控制溫度在30°C以下。之后向釜內(nèi)投加實施例4方法制備的鹵醇脫鹵酶(I X IO7U) 10. 1kg，再加入400kg底物
(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(99%，2. 4kmol)。反應過程中，通過補加氰化鈉使反應液一直維持pH6. 8-7. 5，并緩慢升溫至40°C，且始終維持該反應溫度。反應過程中通過氣相色譜法監(jiān)測反應進程，當?shù)孜锖拷抵?0%以下時，再補加鹵醇脫鹵酶(I X 107U)10. 1kg，至底物含量降至1%以下時終止反應。反應終止后經(jīng)脫色、5000G離心50min、萃取等操作，得到產(chǎn)物(R) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯(沸點2700C )，收率93. 6%，ee 99. 5%。
權(quán)利要求
1.一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體編碼的鹵醇脫鹵酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權(quán)利要求I所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體的重組載體。
4.含有權(quán)利要求I所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體或權(quán)利要求3所述的重組載體的基因工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于宿主細胞為大腸埃希氏菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌命名為E. ColiDH5aHhec05,已于2012年8月29日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO M 2012320。
7.一種鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求4 6中任一項所述的基因工程菌，獲得重組表達的鹵醇脫鹵酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)包括藥搖培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)；優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為酵母提取物20g/L，甘油 10g/L，NaCl 6g/L，磷酸氫二鉀 4. 2g/L，磷酸二氫鉀 8. 5g/L，硫酸銨 0. 5g/L，硫酸亞鐵I. Og/L,硫酸鋅七水合物0. 5g/L，氯化鈣二水合物0. 06g/L,硫酸錳二水合物02g/L，硫酸銅七水合物0. 6g/L，氯化鈷六水合物0. 9g/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選的生產(chǎn)罐發(fā)酵條件是罐溫37°C，攪拌轉(zhuǎn)速800 1500rpm，發(fā)酵過程中控制DO 30%以上，空氣流量1:1. 5vvm,甘油殘余量1%以下。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鹵醇脫鹵酶的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵采用兩階段控制策略發(fā)酵前期即菌體生長階段，控制發(fā)酵液PH 6.0-7.0，罐溫35-371;發(fā)酵后期即添加IPTG之后的鹵醇脫鹵酶誘導表達階段，控制發(fā)酵液pH 6. 5-7. 5，罐溫為28_30°C。
10.權(quán)利要求I所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體在鄰鹵醇化合物脫鹵素反應中的應用，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體構(gòu)建基因工程菌，并表達制備鹵醇脫鹵酶，以所述的鹵醇脫鹵酶為催化劑催化鄰鹵醇化合物脫鹵素反應。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應用，其特征在于所述的鄰鹵醇化合物脫鹵素反應的底物的結(jié)構(gòu)式為
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹵醇脫鹵酶基因突變體及其應用。一種鹵醇脫鹵酶基因突變體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的鹵醇脫鹵酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一種鹵醇脫鹵酶的制備方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的含有鹵醇脫鹵酶基因突變體的基因工程菌，獲得重組表達的鹵醇脫鹵酶。利用本發(fā)明所述的鹵醇脫鹵酶基因突變體構(gòu)建基因工程菌，并表達制備鹵醇脫鹵酶，以所述的鹵醇脫鹵酶為催化劑催化鄰鹵醇化合物脫鹵素反應。將制得的鹵醇脫鹵酶應用于(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的生產(chǎn)，在相同的生產(chǎn)條件下，產(chǎn)品的產(chǎn)率也有較大提高，達到93.6%；且鹵醇脫鹵酶用量較少，僅為20.2kg，極大的降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/19GK102827853SQ201210327418
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者陳峻青, 蔡進, 吉民, 石進祥, 石利平, 尹曉龍 申請人:江蘇阿爾法藥業(yè)有限公司, 東南大學