專利名稱：一種施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種專用于可導(dǎo)致珊瑚發(fā)生白化現(xiàn)象的病原弧菌一施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細(xì)菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的微生物分類和鑒定方法主要是以微生物的形態(tài)學(xué)和生理生化等特 性作為判斷依據(jù)，雖然結(jié)果可信度高，但是繁瑣且費(fèi)時(shí)?，F(xiàn)階段采用最多的還是分子生物學(xué)的方法，其主要依賴于PCR技術(shù)對(duì)某些特異性的基因進(jìn)行擴(kuò)增?？墒沁@些方法都存在一定的缺陷(I)檢測(cè)耗時(shí)，過(guò)程繁瑣；(2)檢測(cè)靈敏度低，檢測(cè)出病原菌時(shí)往往是發(fā)病晚期；檢測(cè)的目標(biāo)基因過(guò)于單一，容易漏檢由于環(huán)境差異導(dǎo)致的同種不同菌株，不能全面反應(yīng)該種病原菌的潛在致病性。因此，在做病原細(xì)菌的檢測(cè)時(shí)，只有同時(shí)檢測(cè)盡可能多的特異基因，才能使檢測(cè)結(jié)果更加具有可靠性，對(duì)病原細(xì)菌的鑒定更加準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種更為快速準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)致病性的施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)試劑，多基因PCR引物和GeXP多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對(duì)多基因PCR引物和一對(duì)通用引物，具體如下含有熒光標(biāo)記的通用引物對(duì)序列，可按常規(guī)技術(shù)將熒光標(biāo)記加到下述通用引物序列上，所述的熒光標(biāo)記優(yōu)選為CY5熒光標(biāo)記TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為IlObp sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH0100015l. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTA
ompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBIReference Sequence:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA
為毒力基因dnaj (GenBank:ΑΒ263067· I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA，以其作為模板，用上述13對(duì)多基因PCR引物和I對(duì)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物，利用GenomeLabGeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。如果能擴(kuò)增到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，則證明該施羅氏弧菌具有相應(yīng)的毒力基因。本發(fā)明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)方法是用于非診斷目的的。所述的以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用上述13對(duì)多基因PCR引物和I對(duì)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物是以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用上述13對(duì)多基因PCR引物等比例混合，每個(gè)引物終濃度為0. 2-2 μ M，再加入通用引物對(duì)，終濃度為1-20 μ Μ，混合均勻?yàn)橐镱A(yù)混液，其反應(yīng)體系和程序優(yōu)選為2(Γ50μ L的PCR反應(yīng)體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmMdNTP I. 6 4μ L，5M/y L 的 TaqE O. 2 O. 5 μ L，引物預(yù)混液 O. 2 O. 5 μ L，模板 DNA O. 8 2 μ L，ddH2015 37. 5μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C 3min ；94°C 30s、59 62°C 50 60s、72°C 100s，25 35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。 本發(fā)明針對(duì)已知13個(gè)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的毒力基因，設(shè)計(jì)特異性引物，利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，按照本發(fā)明的方法，可以通過(guò)單管反應(yīng)，一次性快速、高效的同時(shí)檢測(cè)13種基因，而得知檢測(cè)出樣品或環(huán)境中是否含有攜帶這些毒力相關(guān)基因、具有潛在致病能力的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)，其檢測(cè)覆蓋面廣，可大大提高施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性,為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性評(píng)價(jià)提供了更為有效的檢測(cè)手段，在對(duì)珊瑚蟲(chóng)白化病害的監(jiān)測(cè)、防治方面具有重大的意義。


圖I是實(shí)施例I的檢測(cè)結(jié)果圖；圖2是實(shí)施例2的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :(I)提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA首先對(duì)珊瑚樣品中的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)進(jìn)行平板的純化分離,再培養(yǎng)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。①在離心管中加入50 μ L10%(w/v)無(wú)菌Chelex-100溶液；②從施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)培養(yǎng)平板上,挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，再充分震蕩IOs ；④12000r/min離心2min,上清液即為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)基因組DNA,置于-20°C冰箱備用。(2)多基因PCR引物的設(shè)計(jì)與合成為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為IlObp
sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH0100015l. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTA
ompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBIReference Sequence:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj (GenBank:AB263067. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTG
rpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA帶有CY5熒光標(biāo)記的通用引物序列，可按常規(guī)技術(shù)將CY5熒光標(biāo)記加到通用引物序列上TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，
·
(3)多重 PCR 擴(kuò)增(XP-PCR)以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為多重PCR反應(yīng)的模板，用上述13對(duì)多基因PCR引物等比例混合，每個(gè)引物終濃度為O. 2 μ M，再加入通用引物對(duì)，終濃度為I μ Μ，混合均勻?yàn)橐镱A(yù)混液，配制25μ L的PCR反應(yīng)體系，包括10 X PCR Buffer
2.5μ L, IOmM dNTP 2 μ L，5M/μ L 的 TaqE O. 25 μ L，引物預(yù)混液 O. 25 μ L，模板 DNAl μ L，ddH2019y L。將反應(yīng)物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增
9 ·Κ7Π η
,Os、
62 0C《Os >_ 3 5 cycles
T i100s
72 0CImm得到XP-PCR 產(chǎn)物。(4)產(chǎn)物檢測(cè)利用貝克曼GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)XP-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，具體操作如下①GeXP 上樣a,制備SLS/DSS混合液取DSS 400 (分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400)，加入80倍體積SLS (上樣緩沖液，甲酰胺)，在渦旋震蕩器上震蕩30S或者用槍頭混勻10次備用；b,在每個(gè)樣本孔中加入40 μ I SLS/DSS混合液，再加入O. 01 μ I XP-PCR產(chǎn)物至GeXP樣品板(不要出現(xiàn)氣泡)，加一滴石蠟油覆蓋樣品；C，在緩沖液板與樣本板對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液；d,進(jìn)入Set Mp程序，輸入樣品名，對(duì)每個(gè)樣本指定Freg-3分離方法,指定默認(rèn)的GeXP分析方法，開(kāi)始運(yùn)行樣本。②GeXP系統(tǒng)操作程序a.調(diào)整 GeXP 系統(tǒng)
I’安裝毛細(xì)管和凝膠。2’將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50° C。3’按照O. 4ml凝膠，重復(fù)3次模式執(zhí)行初級(jí)管路沖洗。4’執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次。5’執(zhí)行光路聚焦。6 ’監(jiān)控儀器基線，低于4000RF M。b.輸入樣本信息 I’輸入樣本名。2’對(duì)每個(gè)樣本指定Freg-3分離方法,指定默認(rèn)的GeXP分析方法。3’保存樣本信息。c. GeXP 樣本分析I’使用蒸餾水清洗水槽。2’放入樣本板和緩沖液板。3’開(kāi)始運(yùn)行樣本。d.查看片段分析結(jié)果I’打開(kāi)片段分析模塊；2’使用分析后結(jié)果(Analyzed Data)建立一個(gè)新的分析(Study)。3’在片段列表(Fragments)窗口中設(shè)定過(guò)濾參數(shù)，過(guò)濾非D4染料峰及其他非產(chǎn)物峰。4’確認(rèn)現(xiàn)有分析結(jié)果正確。5’查看片段分析結(jié)果。6’對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以判讀結(jié)果，每個(gè)峰代表一個(gè)基因，結(jié)果如圖I所示，圖I中具有13個(gè)峰，根據(jù)橫坐標(biāo)size nt數(shù)值大小判斷基因，從左到右分別為sod IlObp, fldA117bp, ompUL 124bp, toxS 131bp,bcp 138bp, dnaj 145bp, mshA 152bp,z2z3 159bp, fimA166bp, pyrH 173bp, toxRL 180bp, rpoA 187bp, recA 195bp,由此表明樣品施羅氏弧菌含有這13個(gè)毒性因子，這個(gè)結(jié)果與本實(shí)施例的樣品施羅氏弧菌按照常規(guī)方法檢查出來(lái)的毒性因子相同?？梢?jiàn)本發(fā)明所提供的方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的13種毒性因子，從而能快速準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性。實(shí)施例2 (I)提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA首先對(duì)珊瑚樣品中的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)進(jìn)行平板的純化分離，再培養(yǎng)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。①在離心管中加入50 μ L 10%(w/v)無(wú)菌Chelex-100溶液；②從施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)培養(yǎng)平板上,挑取單菌落至上述Chelex-100溶液中；③將離心管放置在渦旋混合器上充分震蕩10s，沸水浴lOmin，冷卻至室溫，再充分震蕩IOs ；④12000r/min離心2min,上清液即為施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)基因組DNA,置于-20°C冰箱備用。
(2)多基因PCR引物的設(shè)計(jì)與合成為毒力基因sod(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000140. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為IlObp sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGACTCCACTAACAGA為毒力基因fldA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000151. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為117bp fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfldA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC 為毒力基因ompUL(GenBank:EU727214. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為124bp ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS(GenBank:EU727211. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為131bp toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp(NCBI Reference Sequenc e:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為138bp Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj (GenBank:AB263067. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增的片段大小約為145bp dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA (GenBank:NZ_ABCH01000011. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為152bp mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3 (GenBank:AF009900. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為159bp z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA(NCBI Reference Sequence:NZ_ABCH01000010. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為166bp fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH(GenBank:JN039147. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為173bp pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL(GenBank:EU727208. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAAC
toxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA(GenBank:AJ842695. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為187bp rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA(GenBank:AJ580887. I)設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增片段大小約為195bp recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA 帶有CY5熒光標(biāo)記的通用引物序列，可以按常規(guī)技術(shù)將CY5熒光標(biāo)記加到通用引物序列上TY-F: 5，-AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B: 5，-GTACGACTCACTATAGGGA-3，(3)多重 PCR 擴(kuò)增(XP-PCR)以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為多重PCR反應(yīng)的模板，用上述13對(duì)多基因PCR引物等比例混合，每個(gè)引物終濃度為2 μ M，再加入通用引物對(duì)，終濃度為20 μ Μ，混合均勻?yàn)橐镱A(yù)混液，配制25μ L的PCR反應(yīng)體系，包括10XPCR Buffer2· 5 μ L，IOmM dNTP 2μ L,5M/u L ^ TaqE O. 25 μ L，引物預(yù)混液 0. 25 μ L,模板 DNA I μ L,ddH2019y L。將反應(yīng)物混勻后，放置在PCR儀中，按如下反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增
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-)9 C60s ^>_ 25cycles
72 C100s )
72 0C7min得到XP-PCR 產(chǎn)物。(4)產(chǎn)物檢測(cè)利用貝克曼GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)XP-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，具體操作如下GeXP 上樣a,制備SLS/DSS混合液取DSS 400 (分子量?jī)?nèi)標(biāo)-400)，加入80倍體積SLS (上樣緩沖液，甲酰胺)，在渦旋震蕩器上震蕩30S或者用槍頭混勻10次備用；b,在每個(gè)樣本孔中加入40 μ I SLS/DSS混合液，再加入0. 01 μ I XP-PCR產(chǎn)物至GeXP樣品板(不要出現(xiàn)氣泡)，加一滴石蠟油覆蓋樣品；c,在緩沖液板與樣本板對(duì)應(yīng)孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液；d,進(jìn)入Set Mp程序，輸入樣品名，對(duì)每個(gè)樣本指定Freg-3分離方法,指定默認(rèn)的GeXP分析方法，開(kāi)始運(yùn)行樣本。GeXP系統(tǒng)操作程序a.調(diào)整 GeXP 系統(tǒng)I’安裝毛細(xì)管和凝膠。2’將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50° C。 3’按照O. 4ml凝膠，重復(fù)3次模式執(zhí)行初級(jí)管路沖洗。4’執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次。5’執(zhí)行光路聚焦。6’監(jiān)控儀器基線，低于4000RFM。b.輸入樣本信息I’輸入樣本名。2’對(duì)每個(gè)樣本指定Freg-3分離方法,指定默認(rèn)的GeXP分析方法。3’保存樣本信息。c. GeXP 樣本分析I’使用蒸餾水清洗水槽。2’放入樣本板和緩沖液板。3’開(kāi)始運(yùn)行樣本。d.查看片段分析結(jié)果I’打開(kāi)片段分析模塊；2’使用分析后結(jié)果(Analyzed Data)建立一個(gè)新的分析(Study)。3’在片段列表(Fragments)窗口中設(shè)定過(guò)濾參數(shù)，過(guò)濾非D4染料峰及其他非產(chǎn)物峰。4’確認(rèn)現(xiàn)有分析結(jié)果正確。5’查看片段分析結(jié)果。6’對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)圖譜可以判讀結(jié)果，每個(gè)峰代表一個(gè)基因，結(jié)果如圖2所示，圖2中具有13個(gè)峰，根據(jù)橫坐標(biāo)size nt數(shù)值大小判斷基因，從左到右分別為sod IlObp, fldA117bp, ompUL 124bp, toxS 131bp, bcp 138bp, dnaj 145bp, mshA 152bp, z2z3159bp, fimA166bp, pyrH 173bp, toxRL 180bp, rpoA 187bp, recA 195bp,由此表明樣品施羅氏弧菌含有這13個(gè)毒性因子，這個(gè)結(jié)果與本實(shí)施例的樣品施羅氏弧菌按照常規(guī)方法檢查出來(lái)的毒性因子相同?？梢?jiàn)本發(fā)明所提供的方法能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的13種毒性因子，從而能快速準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)致病性。
權(quán)利要求
1. 一種施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒，包括PCR反應(yīng)試劑，多基因PCR引物和GeXP多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，其特征在于，所述的多基因PCR引物包括13對(duì)多基因PCR引物和一對(duì)通用引物，具體為 為毒力基因sod設(shè)計(jì)的引物sod-F AGGTGACACTATAGAATA CCGTTCATGTAGTCTGGACGsod-R GTACGACTCACTATAGGGA GCAGCGAC TCCACTAACAGA為毒力基因fldA設(shè)計(jì)的引物fIdA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGACATCGTTGAAGCAAfIdA-R GTACGACTCACTATAGGGA AGGCCAACGAATTGTGACTC為毒力基因ompUL設(shè)計(jì)的引物ompUL-F AGGTGACACTATAGAATA TTGGTGCGGGTTATCAGCTAompUL-R GTACGACTCACTATAGGGA CGAATACGGTCTGTTAGGTCG為毒力基因toxS設(shè)計(jì)的引物toxS-F AGGTGACACTATAGAATA CGCGGATATATTCACCACCTtoxS-R GTACGACTCACTATAGGGA CAATGAATGGCAATCCAACA為毒力基因Bcp設(shè)計(jì)的引物Bcp-F AGGTGACACTATAGAATA AACGTTGTGAGCGTCAAGCBcp-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCAACACCGTCACACTACA為毒力基因dnaj設(shè)計(jì)的引物dnaJ-F AGGTGACACTATAGAATA ATTCGGTGATATCTTTGGCGdnaJ-R GTACGACTCACTATAGGGA CTCAACGAGCGTTGGAACTT為毒力基因mshA設(shè)計(jì)的引物mshA-F AGGTGACACTATAGAATA CTGAGCGACGGTTATCAACAmshA-R GTACGACTCACTATAGGGA ATGGTCACGTTAGTTTGCCC為毒力基因z2z3設(shè)計(jì)的引物z2z3-F AGGTGACACTATAGAATA CTCTCATTGGTTAGCCCTCGz2z3-R GTACGACTCACTATAGGGA ATCATCGGAAGATCAGCGTC為毒力基因fimA設(shè)計(jì)的引物fimA-F AGGTGACACTATAGAATA AGCTGTGGTTGATTGGCTCTfimA-R GTACGACTCACTATAGGGA TACCGTTACTGGTGGTGCAA為毒力基因pyrH設(shè)計(jì)的引物pyrH-F AGGTGACACTATAGAATA GACCGTATGGCACAAGAGGTpyrH-R GTACGACTCACTATAGGGA CGCATAGCTAGGCCATTCAT為毒力基因toxRL設(shè)計(jì)的引物toxRL-F AGGTGACACTATAGAATA ACTACGACCATTGCCCAAACtoxRL-R GTACGACTCACTATAGGGA TAGTGTTGAGCGCTCTGTGC為毒力基因rpoA設(shè)計(jì)的引物rpoA-F AGGTGACACTATAGAATA ACGTGTTGAGCAGCGTACTGrpoA-R GTACGACTCACTATAGGGA AATAGGATCGAACTCCGGCT為毒力基因recA設(shè)計(jì)的引物recA-F AGGTGACACTATAGAATA ACCATGGACGTTGAAACCATrecA-R GTACGACTCACTATAGGGA GGCATGTTCTGCATCGATAA 含有熒光標(biāo)記的通用引物對(duì)序列，可按常規(guī)技術(shù)將熒光標(biāo)記加到通用引物序列上TY-F:5， -AGGTGACACTATAGAATA-3，TY-B:5， -GTACGACTCACTATAGGGA-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒，其特在在于，所述的熒光標(biāo)記為CY5熒光標(biāo)記。
3.一種施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟提取施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA，以其作為模板，用權(quán)利要求I所述的13對(duì)多基因PCR引物和一對(duì)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。
4.如權(quán)利要求3所述的施羅氏弧菌(Vibrioshilonii)多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求I所述的13對(duì)多基因PCR引物和一對(duì)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物是以施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的基因組DNA作為模板，用權(quán)利要求I所述的13對(duì)多基因PCR引物等比例混合，每個(gè)引物終濃度為O. 2 2 μ Μ，再加入通用引物對(duì)，終濃 度為1-20 μ Μ，混合均勻?yàn)橐镱A(yù)混液，多重PCR反應(yīng)體系和程序?yàn)?(Γ50 μ L的PCR反應(yīng)體系，包括10XPCR Buffer 2 5 μ L，IOmM dNTP I. 6 4 μ L，5M/μ L 的 TaqE O. 2 O. 5 μ L，引物預(yù)混液O. 2 O. 5 μ L，模板DNA O. 8 2 μ L，ddH20 15 37. 5 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?MV 3min ；94°C 30s、59 62°C 50 60s、72。。100s，25 35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種施羅氏弧菌多重毒力因子GeXP快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。它是先提取施羅氏弧菌的基因組DNA，以其作為模板，用13對(duì)多基因PCR引物和一對(duì)通用引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增得到多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物，利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析。本發(fā)明針對(duì)已知13個(gè)施羅氏弧菌毒力基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)單管反應(yīng)，一次性快速高效的檢測(cè)13種基因而得知檢測(cè)出樣品中是否含有攜帶毒力基因、具有潛在致病能力的施羅氏弧菌，其檢測(cè)覆蓋面廣，可大大提高施羅氏弧菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)珊瑚白化現(xiàn)象的防治提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步保護(hù)我國(guó)珊瑚島嶼，防止其進(jìn)一步退化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102899402SQ20121032855
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者陳償, 高磊, 任春華, 胡超群 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所