專利名稱：一種鮸微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于鯢的微衛(wèi)星分子標(biāo)記領(lǐng)域，特別涉及一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)廣泛存在于真核生物基因組中，由1-6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR),微衛(wèi)星具有數(shù)量多、隨機(jī)分布、多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、呈共顯性遺傳及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，被廣泛地應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)與管理、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位等領(lǐng)域中。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在許多重要水產(chǎn)動(dòng)物中開(kāi)發(fā)了微衛(wèi)星標(biāo)記。如ΖΗΑΝ等開(kāi)發(fā)了海參的45個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；Gen等開(kāi)發(fā)了鯉魚(yú)的36個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；CRISP0等開(kāi)發(fā)了雜色褶唇麗魚(yú)的18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記；K0IZUMI等開(kāi)發(fā)了短棘九刺魚(yú)的25個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；這些多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等研究中。鏡(Miichthysmiiuy)屬脊索動(dòng)物門(Chordata),硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes),魚(yú)盧形目(Perciformes),石首魚(yú)科(Sciaenidae),鯢屬(Miichthys),分布在西北太平洋區(qū)，包括中國(guó)、日本、韓國(guó)、越南等國(guó)海域。在我國(guó)沿海均有分布，但以東、黃海較多。其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)。其鰾俗稱“魚(yú)肚”，為高級(jí)滋補(bǔ)品，具有較高的食用和藥用價(jià)值。由于其生長(zhǎng)快、自然抗逆性強(qiáng)、市場(chǎng)潛力大等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)其人工繁殖與養(yǎng)殖在我國(guó)南方沿海正蓬勃發(fā)展，有望成為深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。為了弄清野生鯢群體的遺傳多樣性和種質(zhì)資源狀況，從而促進(jìn)鯢的資源保護(hù)和人工養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展，需對(duì)其遺傳背景及多樣性狀況進(jìn)行研究。目前，可利用的鯢微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量非常少，嚴(yán)重限制了相關(guān)遺傳學(xué)研究的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，該方法操作安全、簡(jiǎn)單、陽(yáng)性率高、結(jié)果真實(shí)可靠，可快速獲得鯢遺傳變異的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，包括(I)鯢基因組DNA的提取并稀釋備用；(2 )設(shè)計(jì)5 ’錨定引物及PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序；(4)序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)；(5)使用上述微衛(wèi)星特異引物對(duì)鯢不同地理群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(6)使用質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)步驟(5)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，共獲得9個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，從而獲得鯢遺傳變異的多態(tài)性圖譜。所述步驟(I)中的鯢基因組DNA的提取包括以下步驟剪取鯢(采集于浙江舟山市近海海域)少量肌肉組織100-150mg，置于500 μ L組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/mL的蛋白酶K和終濃度為100 μ g/mL的RNase A, 55 °C消化2_3個(gè)小時(shí)；用體積比為25 24 1的苯酚氯仿異戊醇混合液抽提兩次；然后用900 μ L的無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為IOOng/μ L，并保存在-20°C備用。所述步驟(2)中的設(shè)計(jì)5’錨定引物包括以下步驟設(shè)計(jì)含有兼并堿基及重復(fù)堿基的引物，其中兼并堿基部分具有錨定作用，防止引物與模板的結(jié)合發(fā)生滑動(dòng)，重復(fù)堿基部分為2個(gè)堿基6次重復(fù)，用于與基因組DNA中的重復(fù)堿基結(jié)合；采用的5’錨定引物有PAC6 5，-KKDBDBD (AC) 6_3，， PAG6 5，-KKHBHBH (AG) 6_3，，PCT6 5 ’ -KKVRVRV (CT) 6_3 ’，PGT6 :5，-KKRVRVR(GT)6_3，；所述的PCR擴(kuò)增包括以下步驟每個(gè)5’錨定引物以鯢基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、5’錨定引物終濃度為O. 8 μ mol/L、Mg2+終濃度為 I. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 O. 2mmol/L、Taq DNA 聚合酶 O. 75U、I X PCRbuffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、弓丨物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收大小在200-750bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。所述步驟(3)中的克隆及測(cè)序包括以下步驟首先是將步驟(2)得到的回收的PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體(TaKaRa)中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，接種到LB (Amp+)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，再利用載體通用引物和PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性克隆，挑取插入片段大小在200-750bp的陽(yáng)性克隆利用ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。所述步驟(4)中的序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)包括以下步驟首先利用生物學(xué)軟件DNAMAN 4. O對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行比對(duì)分析，去掉相同的序列；然后利用生物學(xué)軟件SSRHUNTER I. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列；再利用BLAST方法搜索上述含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5. O對(duì)含有完整側(cè)翼區(qū)的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；其中，所述的鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的特異引物序列，如下所示Miml1CATCTAATCT TCCCTTACCT CTGCAGCTGC GTGTGATATC CTTTGGGACAAAAAACGTAG61TGGGGAGAAA ACTTCAGCTT CAACAGCACT GCTACAGATC CTCACTTTCTAGCTCTTTCC121AAGGTAACGT ATCTTTCAGC CCAAACACAC ACACGCACTT CAGTCCACTATGACAGCGCT
181CTGTCTACCT GCGTGAGCTT GTGTAAATGT ATCCTAGATG GTGATGAATAGTGGTGAGTG241AAAGCAGAAT ACTMiml標(biāo)記的特異引物序列F:CATCTAATCTTCCCTTACCTCTGR:AGTATTCTGCTTTCACTCACCACMim21AGAAAGAAGA GTCCGACCAC CAACCGGGTT TTGATCAGCT GTTGTTGGAG TTTGCGCCGG61AGTGATGTTC CTGCGCTCTT AGCGAGAGGA GAAACAGACG GAGAGAGAGAGAGGGAGAGA121GACAGAGAGA GAGAGGGAGA GAGAGGAGGT GAAGACGCCG GTTTGTTGTTGTCGCCTTGT181CCGCTGGACT GACATCGCAT GGGGACATGA ACAGTGTGGA TCMim2標(biāo)記的特異弓丨物序列F:AGAAAGAAGAGTCCGACCACCAACCR:GATCCACACTGTTCATGTCCCCATGMim31GGAAGGACAG GGAGAAAGAA AATATGGAAG GAAGGAAGGA AGGAAGGAAGGAAGGAAGGA61AGGAAGGAGG GAGGGGAAGA GAGTCACGCT GTGTGGCATT AATCCGACTGACCCGGATTA121TTTATATCTA ACAGTTATTA ACATTTTATG CCAMim3標(biāo)記的特異引物序列F:GGAAGGACAGGGAGAAAGAAAR:TGGCATAAAATGTTAATAACTGTTMim41GTTTGAAAAT GGAGTTGGCT GCGGTGTTTATATGAGCTGT GGTTGCCTATGAGTGTGTGT61GTCTGTGTGT GTGTGCGGGT GTTTGGCACC AGACTGGAGG GTTGCTGTGGGTCCACGCTG121GCGTAGTTGG GGCTGGAAMim4標(biāo)記的特異引物序列F:GTTTGAAAATGGAGTTGGCTGCGR:TTCCAGCCCCAACTACGCCAGMim51GCAAAGAGAA GAGCCAAAGA AAAAAAAAAA AGAAAGAAGA GTCCGACCACCAACCGGGTT6ITTGATCAGCT GTTGTTGGAG TTTGCGCCGG AGTGATGTTC CTGCGCTCTT
AGCGAGAGGA121GAAACAGACG GAGAGAGAGA GAGGGAGAGA GACAGAGAGA GAGAGGGAGAGAGAGGAGGT181GAAGACGCCG GTTTGTTGTT GTCGCCTTGT CCGCTGGACT GACATCGCATGGGGACATGA24IACAGTGTGGA TCCAGCCTCT AACAAACTGT TGACTTTCAA TCAGCGGMim5標(biāo)記的特異引物序列F:GCAAAGAGAAGAGCCAAAGAAAA R:CCGCTGATTGAAAGTCAACAGTTMim61CAGGTCAGAT GAGTGCAGCG ACGGGCGAGC GAGCAACTGT CTGCATTACAGAGAGAGAGA61AAAGAGAGCG AGCAATGGAG CATGGAGATG CGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGACCT121TGTCTGGCTG TGTGTGCGTG AGCCAGAGAG AGAGACGGCG AGTGTAGCGGGCGAGCGAGC181GAATAGGAAA GGGGAGCCTT GAAACCGTCC TGACTMim6標(biāo)記的特異引物序列F:CAGGTCAGATGAGTGCAGCGACR:AGTCAGGACGGTTTCAAGGCTCMim71TCTCGGCAGC CCCTGAATGT AAACAGATTA TTAGATTAGT GGCCATGAGAAGGAGACGAC61TGAAGAGAGG ACTGTCACTC TGTCTCCTTC CCTCCGTCTC TCTCTCTATCTCTTTTTCTT121TCTGTCAGTG CTGATGGGGC TGTGTCCTTT TTCTTTGTGA TTTAGCTGGTGCTGGTGAAA181CCGGAGAAAC TTCTCGCTGG ACCGAGGAGG AGATGGAGGT CGCCAAMim7標(biāo)記的特異引物序列F:TCTCGGCAGCCCCTGAATGTAAR:TTGGCGACCTCCATCTCCTCCTMim81GTGAGGGGAA TGGCACCAAA CGAGGAGGAG GGGGAGGTGA AGAAGCTGAAATAGGCAGTG61TGAATCATTG CTGTCCCGTT TCCACATGCT AATAAGAGCT CTGTAACACGGACACACGCA121CACACACAGG CGCTCACACA CATTCTGACA GCTAGAAAGC CTTGCTGTACAAGCGTTGTC181TCACTTTGGT GAGAGGGACA TTTATGCACA GAGCTGTCAA TAGGAGGAGG
ACTTACTTAA241TAAAGAACAC AAAGAAATTA GTGTAGCTCA CTCTCACACA CACACACACACACACATACA301TGCACACACA AACACACACA AACAGCCCCC AGCGTTGCTG CTTATTTGCTATTATTGTTTT361GCCGTGTTGG TGGAGMim8標(biāo)記的特異弓I物序列 F:GTGAGGGGAATGGCACCAAACGR:CTCCACCAACACGGCAAAACAAMim91TACAAGCGTT TGTGCTATAT GTAGTGTGTG TGTGTGTGTG CATATATGTGTGGGAGGTGT61AGAGGAGAGT TTTATCTGTA AAAGGGGGGA AAAAAGACCA CCCAGGAGAGGTGACAGGAG121AGTAATTCTT ATTCAGAGTA AATTTCTTGA GAGCACCACA CACACCACTACTACCCCACC181TTCMim9標(biāo)記的特異引物序列FTACAAGCGTTTGTGCTATATGTARGAAGGTGGGGTAGTAGTGG本發(fā)明的微衛(wèi)星核苷酸序列和引物序列，其中Miml為253個(gè)核苷酸、Mim2為222個(gè)核苷酸、Mim3為153個(gè)核苷酸、Mim4為138個(gè)核苷酸、Mim5為287個(gè)核苷酸、Mim6為215個(gè)核苷酸、Mim7為226個(gè)核苷酸、Mim8為375個(gè)核苷酸、Mim9為183個(gè)核苷酸。所述步驟(5)中的使用引物對(duì)鯢不同地理群體或群體內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ L,包括基因組DNA模板I μ L、上下游引物終濃度均為
O.4 μ mol/L、Mg2+ 終濃度為 I. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 O. 2mmol/L、Taq DNA 聚合酶 O. 75U、
IXPCRbuffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。所述步驟(6)中的使用質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將PCR產(chǎn)物95°C變性后，上樣約3yL于質(zhì)量濃度6%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳；經(jīng)染色、顯色后獲得了鯢的PCR產(chǎn)物電泳圖像。本發(fā)明包括錨定引物的設(shè)計(jì)，陽(yáng)性克隆的鑒定及測(cè)序，序列分析及微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)，最終獲得9個(gè)擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，將這9個(gè)多態(tài)性標(biāo)記用于鯢不同地理群體或群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳學(xué)分析，獲得鯢的遺傳變異的多態(tài)性圖譜。有益效果(I)本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏，一周內(nèi)可完成一個(gè)過(guò)程，大大提高了篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的效率；(2)按照本發(fā)明的方法，一次可獲得幾百、甚至上千條微衛(wèi)星序列，并且所獲得的大多數(shù)的微衛(wèi)星序列均可設(shè)計(jì)引物，本發(fā)明的篩選方法主要應(yīng)用于鯢遺傳變異及遺傳多樣性分析。


圖I篩選的引物Mim6對(duì)鯢30個(gè)個(gè)體的檢測(cè)圖譜，其中M是分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-30為鯢個(gè)體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例I I、鯢基因組DNA的提取剪取鯢少量肌肉組織(約100-150mg)，置于500 μ L組織提取液(10mmol/LTris-Cl, pH 8. O; 100mmol/L EDTA, ρΗ8· O; 100mmol/L NaCl; 0. 5%SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K (終濃度為20mg/ml)和RNaseA (終濃度為100 μ g/mL)，充分混勻，55°C消化2_3個(gè)小時(shí)至澄清；用苯酚氯仿異戊醇混合液(體積比為25:24:1)抽提兩次；然后用900 μ L的無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50 μ LTE (10mmol/L Tris-HCl, pH8. 0;10mmol/L EDTA, pH 8.0)中；最后將DNA濃度稀釋為IOOng/μ L，并保存在_20°C備用。2、設(shè)計(jì)5’錨定引物及PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)含有兼并堿基及重復(fù)堿基的引物，其中兼并堿基部分具有錨定作用，防止引物與模板的結(jié)合發(fā)生滑動(dòng)，重復(fù)堿基部分為2個(gè)堿基6次重復(fù)，用于與基因組DNA中的重復(fù)堿基結(jié)合；采用的引物有 PAC6 :5’ -KKDBDBD(AC)6-3’，PAG6 :5’ -KKHBHBH(AG)6_3’，PCT6 5’ -KKVRVRV(CT)6-3’，PGT6 :5’ -KKRVRVR(GT)6_3’，由生物公司合成。PCR擴(kuò)增是每個(gè)5’錨定引物以鯢基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、5’錨定引物終濃度為0. 8 μ mol/L、Mg2+終濃度為
I.5mmol/L、dNTP 終濃度為 0. 2mmol/L、Taq DNA 聚合酶 0. 75UUXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收大小在200-750bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。3、T載體連接將上述回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中，連接體系為IOyL,包括solution I5. O μ L、PMD19-T 載體(TaKaRa) I. O μ L 及 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 4. O μ L, 4°C過(guò)夜。4、克隆、測(cè)序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，使用載體通用引物(M13_47 :5，- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC - 3，；M13_48 :5’ - AGCGGATAACAATTTCACACAGGA - 3，)對(duì)克隆進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為25 μ L，包括菌液I μ L、上下游引物終濃度均為0. 4μ mol/L、Mg2+終濃度為 I. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 0. 2mmol/L、Taq DNA聚合酶 1U、1XPCR buffer,最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、55°C退火50秒、72°C延伸50秒，25個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。最后，挑選插入片斷長(zhǎng)度在200-750bp之間的陽(yáng)性克隆，用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。5、微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)。首先使用軟件SSRHUNTER I. 3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列，查找標(biāo)準(zhǔn)為2_5個(gè)堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)> 4次。然后利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5. O對(duì)含有完整側(cè)翼序列的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)(I)引物長(zhǎng)度在18-25bp之間；(2)GC含量在40-60%之間；(3)退火溫度在50-60°C之間；(4)PCR產(chǎn)物的預(yù)期長(zhǎng)度在100_400bp之間。引物信息詳見(jiàn)表I。6、微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴(kuò)增
利用上述微衛(wèi)星引物對(duì)鯢群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、上、下游引物終濃度均為O. 4μ mol/L、Mg2+終濃度為I. 5mmol/L、dNTP終濃度為O. 2mmol/L、Taq DNA聚合酶IU、I XPCRbuffer,最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度(表I)退火50秒、72 °C延伸50秒，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)向PCR產(chǎn)物中加入約12. 5 μ L的變性劑(98. 0%甲酰胺，IOmmoI/LEDTA，O. 25%溴酚藍(lán)，O. 25% 二甲苯氰)，于95°C變性5分鐘，快速冷卻；然后上樣約3 μ I于質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)為pBR322/MspI，電泳液為IXTBErgS35-40V/cm,電泳約 1-1. 5 小時(shí)。電泳完成后進(jìn)行染色和顯色，其操作過(guò)程為首先用70%乙醇固定10分鐘，蒸餾水洗5分鐘；然后用I. 5%。硝酸銀染色10分鐘，蒸餾水洗8秒鐘；最后用顯色液(2%的NaOH+4%。的甲醛)顯色至帶型清晰，再用蒸餾水將凝膠沖洗干凈，便獲得了鯢遺傳變異的多態(tài)性圖譜。表I本發(fā)明所篩選的鯢的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，包括 (1)鯢基因組DNA的提取并稀釋備用； (2)設(shè)計(jì)5’錨定引物及PCR擴(kuò)增； (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序； (4)序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)； (5)使用上述微衛(wèi)星特異引物對(duì)鯢基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (6)使用質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)步驟(5)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，共獲得9個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，從而獲得鯢遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(1)中的鯢基因組DNA的提取包括以下步驟剪取鯢少量肌肉組織100-150mg，置于500μ L組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/mL的蛋白酶K和終濃度為100 μ g/mL的RNaseA，55°C消化2-3個(gè)小時(shí)；用體積比為25 24 1的苯酚氯仿異戊醇混合液抽提兩次；然后用900 μ L的無(wú)水乙醇沉淀DNA，經(jīng)70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為IOOng/μ L，并保存在-20°C備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)中的設(shè)計(jì)5’錨定引物包括以下步驟設(shè)計(jì)含有兼并堿基及重復(fù)堿基的引物，其中兼并堿基部分具有錨定作用，防止引物與模板的結(jié)合發(fā)生滑動(dòng)，重復(fù)堿基部分為2個(gè)堿基6次重復(fù)，用于與基因組DNA中的重復(fù)堿基結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所采用的5’錨定引物有PAC6 5，-KKDBDBD (AC) 6_3，，PAG6 5，-KKHBHBH (AG)「3，，PCT6 :5’ -KKVRVRV(CT) 6_3’，PGT6 :5’ -KKRVRVR(GT) 6-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增包括以下步驟每個(gè)5’錨定引物以鯢基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、5’錨定引物終濃度為O. 8 μ mol/L、Mg2+終濃度為I. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 O. 2mmol/L、Taq DNA 聚合酶 O. 75UUXPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收大小在200-750bp之間的擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(3)中的克隆及測(cè)序包括以下步驟首先是將步驟(2)得到的回收的PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α中，接種到LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，再利用載體通用引物和PCR擴(kuò)增法鑒定陽(yáng)性克隆，挑取插入片段大小在200-750bp的陽(yáng)性克隆利用ABI3730自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(4)中的序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)包括以下步驟首先利用生物學(xué)軟件DNAMAN4. O對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行比對(duì)分析，去掉相同的序列；然后利用生物學(xué)軟件SSRHUNTER·1.3查找含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列；再利用BLAST方法搜索上述含有微衛(wèi)星核心重復(fù)的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5. O對(duì)含有完整側(cè)翼區(qū)的微衛(wèi)星序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； 其中，所述的鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其對(duì)應(yīng)的特異引物序列，如下所示MimlI C ATCXA ATCT TCCCTTACCT CTGCAGCTGC GTGTGATATC CTTTGGGACAAAAAACGTAG·61 TGGGGAG A AA ACTTCAGCTT CA AC AGC ACT GCTAC AG ATC CTCACTTTCTAGCTCTTTCC·121 AAGGTAACGT ATCTTTCAGC CCAAACACAC ACACGCACTT CAGTCCACTATGACAGCGCTISI CTGTCTACCT (XXn’GAGCTT GTGTAAATGT ATXTTAGATG CiTGATGAATAGTGGTGAGTG·241 AAAGCAG AAT ACT Miml標(biāo)記的特異引物序列F:CATCTAATCTTCCCTTACCTCTGR:AGTATTCTGCTTTCACTCACCAC ；Mim2I Λ(' ΛΛΛ< ΛΛ( ,\ ( i'H 'C (i/\('CA( ( ΛΛΓ('( i( i( ITT C i (IAi('AC1C ITTT.GCGCCGG·61 Ai:r「GATGTTC CTGCGCTCTT AGCGAGAGGA GAAACAGACG GAGAGAGAGAG.AGGGAGAGA·121 GACAGAGAGA GAGAGGGAGA GAGAGGAGGT GAAGACGCCG GTTTGTTGTTGICGCCTTGT·ISI CCGCTGGACT GACATC'GC'/Vr GGGGACAi'CiA ACAGTGTGGΛ TC Mim2標(biāo)記的特異引物序列F:AGAAAGAAGAGTCCGACCACCAACCR:GATCCACACTGTTCATGTCCCCATG ；Mim3·I (;(,ΛΛ(;(.;Λ(_Λ(; Uj.'G.VAAU'A A.VI Λ! (Κ,ΛΛΟ (iAACK ΙΛΛ( K iA ACKiAAiiCjAACiGAAGGAAGGA·6i AGGAAGGAGG GAGGGGAAGA GAGTCACGCT GTGTCiGCATT AATCCGACTGACCCGGATTA·121 TTTATATCTA ACAGTTATTA ACATTTTATG CCA Mim3標(biāo)記的特異引物序列F:GGAAGGACAGGGAGAAAGAAAR:TGGCATAAAATGTTAATAACTGTT ；Mim4
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(5)中的使用弓丨物對(duì)鯢基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、上下游引物終濃度均為O. 4 μ mol/L、Mg2+終濃度為I. 5mmol/L、dNTP終濃度為O. 2mmol/L、Taq DNA聚合酶O. 75U、I XPCR buffer,最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、引物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸7分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鯢微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，其特征在于所述步驟(6)中的使用質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將PCR產(chǎn)物95°C變性后，上樣約3μ L于質(zhì)量濃度6%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳；經(jīng)染色、顯色后獲得了鯢的PCR產(chǎn)物電泳圖像。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鮸微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選方法，包括(1)鮸基因組DNA的提取并稀釋備用；(2)設(shè)計(jì)5’錨定引物及PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測(cè)序；(4)序列分析及微衛(wèi)星特異引物設(shè)計(jì)；(5)使用上述微衛(wèi)星特異引物對(duì)鮸基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(6)使用質(zhì)量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)步驟(5)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離確定每個(gè)個(gè)體的基因型，共獲得9個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，從而獲得鮸遺傳變異的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、安全、陽(yáng)性率高、結(jié)果真實(shí)可靠，可快速獲得鮸遺傳變異的多態(tài)性圖譜，主要應(yīng)用于鮸遺傳變異及遺傳多樣性分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925552SQ201210328588
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月6日
發(fā)明者馬春艷, 馬洪雨, 馬凌波, 宋煒, 張鳳英, 蔣科技 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所