專利名稱：一種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法。
背景技術(shù)：
大豆[Glycine max (L. ) Merr.]作為世界上最重要的經(jīng)濟作物之一，是人類蛋白質(zhì)和脂肪的重要來源，在食品、飼料、エ業(yè)上具有廣泛的用途。大豆種子的子葉顔色分為黃、綠兩色。我國大豆種質(zhì)資源豐富，但是具有綠子葉性狀的大豆種質(zhì)資源較少，僅占2. 77%。隨著經(jīng)濟水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對大豆的需求正逐步趨向多元化、多用途的方向發(fā)展，綠子葉大豆以其獨特的外觀品質(zhì)及特殊的食用、加工特性正逐步受到人們的關(guān)注及加工企業(yè)的青睞。因此，加快綠子葉大豆種質(zhì)資源的利用和新品種的選育，成為大豆遺傳 育種工作中的重要研究內(nèi)容之一。常規(guī)育種是通過性狀的表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇，這種選擇方法雖然可行，但是由于目的基因位點有純合和雜合之分，需要多年自交鑒別，故育種年限較長。近年來，隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，分子標記輔助育種和分子設(shè)計育種等現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)運而生，使人們能夠直接對基因型進行選擇，選擇結(jié)果更加客觀、準確，大大提高育種的效率和縮短育種的年限。因此，利用分子標記技術(shù)對選擇性狀進行分子標記，是分子標記輔助育種和分子設(shè)計育種等工作的基礎(chǔ)，同時主要農(nóng)藝性狀分子標記的獲得，對于控制該性狀基因的研究也具有十分重要的理論和實際意義。SSR (Simple Sequence Repeat)標記是一種操作簡便的分子標記,屬于顯性標記，在基因組中分布平均、多態(tài)性高、結(jié)果準確，在許多農(nóng)作物的遺傳多樣性研究、分子標記、基因定位和分子標記輔助育種等方面廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法。本發(fā)明提供了ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法(方法甲)，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對進行PCR擴增；如果所述PCR擴增在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果所述PCR擴增在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或所述PCR擴增在180-220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了 190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還提供了所述Satt408引物對在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用。本發(fā)明同時提供了所述Satt408引物對在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用。所述Satt408引物對或所述方法(方法甲)可用于篩選具有綠子葉性狀的大豆。
所述Satt408引物對或所述方法(方法甲)可用于綠子葉性狀大豆的育種，即將所述方法鑒定為的綠子葉性狀大豆用于育種。在方法甲的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了另ー種準確度更高的輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法(方法こ)，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，分別用Satt408引物對和Sattl29引物對進行PCR擴增；如果同時滿足特定條件甲和特定條件こ，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果不同時滿足特定條件甲和特定條件こ，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；所述特定條件甲如下采用Satt408引物對進行PCR擴增時，在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物；所述特定條件こ如下采用Sattl29引物對進行PCR擴增時，在120-160bp區(qū)間內(nèi)只得到了 130bp±5bp的產(chǎn)物；所述Satt408引物對由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還保護所述Satt408引物對和所述Sattl29引物對在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護所述Satt408引物對和所述Sattl29引物對在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用。引物組合物或所述方法(方法こ)可用于篩選具有綠子葉性狀的大豆；所述引物組合物由所述Satt408引物對和所述Sattl29引物對組成。所述引物組合物或所述方法(方法こ)可用于綠子葉性狀大豆的育種，即將所述方法鑒定為的綠子葉性狀大豆用于育種。本發(fā)明還保護ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒，包括所述Satt408引物對。所述試劑盒還可包括所述Sattl29引物對。本發(fā)明提供的方法中，利用分子標記鑒定植株幼苗中是否存在綠子葉基因，同時 可鑒定出控制子葉的基因型，進而推斷植株將產(chǎn)生何種顏色的子葉，其后代是否會發(fā)生子葉顔色分離，對育種具有重大價值。本發(fā)明可應(yīng)用于綠子葉品種的分子標記輔助育種和分子設(shè)計育種，能夠大大減少田間選擇的工作量、縮短育種年限。同時由于所獲得的綠子葉的分子標記Satt408_19(lbp標記和Sattl29_13(lbp標記與綠子葉基因之間的遺傳距尚只有2. IcM,可利用該標記對綠子葉基因進行進一歩深入研究。


圖I為Satt408引物對在部分‘科豐14’ X ‘丹豆6號’的F2代分離群體中的PCR擴增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號’ ；3-12 F2代分離群體中的黃子葉單株；13-20 F2代分離群體中的綠子葉單株。圖2為Sattl29引物對在部分‘科豐14’ X ‘丹豆6號’的F2代分離群體中的PCR擴增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號’ ；3-13 F2代分離群體中的黃子葉單株；14-20 F2代分離群體中的綠子葉單株。圖3為實施例2中采用Satt408引物對時部分樣本的PCR擴增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號’ 3-10 :黃子葉性狀大豆(依次為中黃4號、中黃7號、中黃10號、中黃14號、中黃18號、中黃27號、中品662、中品661) ；11-20綠子葉性狀大豆(依次為T41、PI157416、黑皮青瓤、大青仁、魯莊大黑豆、開江黑豆、仙游綠心豆、7904、L62-1027、L69-4663)。圖4為實施例2中采用Sattl29引物對時部分樣本的PCR擴增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號’ 3-10 :黃子葉性狀大豆(依次為中黃4號、中黃7號、中黃10號、中黃14號、中黃18號、中黃 27號、中品662、中品661) ; 11-18綠子葉性狀大豆(依次為T41、PI157416、黑皮青親、大青仁、魯莊大黑丑、開江黑丑、仙游綠心丑、7904)。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例I、輔助鑒定大豆綠子葉性狀的SSR引物對及相應(yīng)分子標記的發(fā)現(xiàn)以黃子葉大豆品種‘科豐14’為母本，綠子葉大豆品種‘丹豆6號’為父本，進行雜交，獲得Fl代，F(xiàn)l代自交，獲得子葉顔色性狀分離的F2代種子。F2代種子的子葉顔色分析表明，黃子葉和綠子葉種子的比例分別為5968粒1957粒，為3:1，符合經(jīng)典遺傳學(xué)I對基因分離規(guī)律，證實為黃/綠子葉性狀由I對基因控制，黃子葉對綠子葉為顯隱性關(guān)系。選取同I株Fl植株上收獲的子葉顔色分離的F2代種子，總粒數(shù)為246粒，具有黃子葉的187粒，具有綠子葉的59粒，黃、綠分離比為3. 17 :1，接近3 :1，經(jīng)卡平方檢測，X2=0. 1348 < X20.05jl = 3. 84，符合由I對顯性基因控制的3黃I綠的理論比例。將F2代種子按照子葉顔色分別種植，獲得123個F2代單株的幼苗(102株為黃子葉、21株為綠子葉；部分種子沒有出苗)。分別提取F2代單株幼苗的基因組DNA，利用集群分離分析法(BulkedSegregant Analysis, BSA),以大豆SSR引物對為DNA擴增反應(yīng)的引物，篩選與綠子葉性狀(基因)緊密連鎖的分子標記。經(jīng)PCR擴增和擴增產(chǎn)物的凝膠電泳，在840對SSR弓丨物的篩選結(jié)果中，有2對SSR引物(Satt408引物對和Satt129引物對)在綠子葉幼苗的DNA中能夠各自擴增出I條特異的DNA片段，分子量分別為190bp±5bp和130bp±5bp (部分結(jié)果見圖I和圖2)。Satt408引物對(該引物對的退火溫度為60°C，靶序列位于Dla染色體位點)對于具有綠子葉性狀大豆的特異性靶序列為190bp±5bp，將該特異性靶序列命名為Satt408_19一標記。Satt408引物對對于具有黃子葉性狀且黃子葉基因為純合型的大豆的特異性靶序列為210bp±5bp。Satt408引物對對于具有黃子葉性狀且黃子葉基因/綠子葉基因為雜合型的大豆來說，同時具有上述兩種特異性靶序列。Sattl29引物對(該引物對的退火溫度為60°C，靶序列位于Dla染色體位點)對于具有綠子葉性狀的大豆的靶序列為130bp±5bp，將該特異性靶序列命名為Sattll29_13(lbp.記。Sattl29引物對對于具有黃子葉性狀且黃子葉基因為純合型的大豆的特異性靶序列為145bp±5bp。Sattl29引物對對于具有黃子葉性狀且黃子葉基因/綠子葉基因為雜合型的大豆來說，同時具有上述兩種特異性靶序列。同吋，收獲F2代植株產(chǎn)生的種子，分析每個植株種子子葉的顔色，確定每個植株子葉的基因型，并與分子標記測定的基因型比較。表I為試驗材料中各個單株實際的基因型及SSR引物Satt408和Sattl29擴增產(chǎn)生的分子標記帶型統(tǒng)計表。Satt408列中，A表示采用Satt408引物對擴增僅具有與‘科豐14’具有相同的帶型，B表示采用Satt408引物對擴增僅具有與‘丹豆6號’具有相同的帶型，H表示采用Satt408引物對擴增同時具有‘科豐14’和‘丹豆6號’的帶型，-表示采用Satt408引物對擴增不具有‘科豐14’的帶型且不具有‘丹豆6號’的帶型。Sattl29列中，A表示采用Sattl29引物對擴增僅具有與‘科豐14’具有相同的帶型，B表示采用Sattl29引物對擴增僅具有與‘丹豆6號’具有相同的帶型，H表示采用Sattl29引物對擴增同時具有‘科豐14’和‘丹豆6號’的帶型，-表示采用Sattl29引物對擴增不具有‘科豐14’的帶型且不具有‘丹豆6號’的帶型。因為黃色子葉相對綠色子葉為顯性，且單株中可能發(fā)生了標記位點交換,如果Satt408列和Sattl29列中至少有ー個為H且子葉性狀為黃色，基因型填寫為H，如果子葉性狀為綠色、基因型填寫為B，如果Satt408列和Sattl29列均為A且子葉性狀為黃色，基因型填寫為A。表1F2代分離群體中各個單株的實際子葉基因型及Satt408和Satt129擴增產(chǎn)生的分子標記帶型統(tǒng)計

權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對進行PCR擴增；如果所述PCR擴增在180_220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果所述PCR擴增在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或所述PCR擴增在180_220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了 190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大ii ;所述Satt408引物對由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
2.Satt408引物對在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
3.Satt408引物對在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
4.Satt408引物對或權(quán)利要求I所述的方法在篩選具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。
5.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，分別用Satt408引物對和Sattl29引物對進行PCR擴增；如果同時滿足特定條件甲和特定條件乙，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果不同時滿足特定條件甲和特定條件乙，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆； 所述特定條件甲如下采用Satt408引物對進行PCR擴增時，在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物； 所述特定條件乙如下采用Sattl29引物對進行PCR擴增時，在120-160bp區(qū)間內(nèi)只得到了 130bp±5bp的產(chǎn)物； 所述Satt408引物對由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
6.Satt408引物對和Sattl29引物對在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
7.Satt408引物對和Sattl29引物對在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
8.引物組合物或權(quán)利要求5所述的方法在篩選具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述引物組合物由Satt408引物對和Sattl29引物對組成；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
9.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒，包括Satt408引物對；所述Satt408引物對由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括Sattl29引物對；所述Sattl29引物對由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對進行PCR擴增；如果在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或在180-220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；Satt408引物對由序列1和2所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明的方法中利用分子標記鑒定植株幼苗中是否存在綠子葉基因，進而推斷植株將產(chǎn)生何種顏色的子葉，其后代是否會發(fā)生子葉顏色分離，對育種具有重大價值。
文檔編號C12Q1/68GK102851367SQ20121033029
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者謝皓, 陳學(xué)珍, 倪資園, 郭蓓, 楊柳, 張嬌, 薛樹鵬, 郭遠 申請人:北京農(nóng)學(xué)院