表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒e蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗，其保藏號為CCTCC?V201214，命名為rDEV-TE-tPAS，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含SV40啟動子、鴨坦布蘇病毒E蛋白和tPA(Tissue?plasminogen?activator)信號肽序列的基因片段SV40-E-tPA插入到鴨病毒性腸炎病毒的US7和US8基因之間的間隔區(qū)中，構(gòu)建獲得在US7和US8基因之間插入SV40-E-tPA表達(dá)框架的粘粒，由其拯救獲得表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗CCTCC?V201214。本發(fā)明還涉及構(gòu)建該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，以及該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病的疫苗的應(yīng)用。
【專利說明】表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗的構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地屬于重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201214,命名為rDEV-TE-tPAS，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV),又稱鴨病毒性腸炎病毒。能引起鴨、鵝和其它雁形目禽類發(fā)生急性、熱性、敗血性為特征的烈性傳染病。與其它皰疹病毒相比，針對DEV的研究較少。第八次國際病毒學(xué)分類委員會報告將其分類為皰疹病毒[1]，而具體屬分類仍未確定；直至最近，其基因組全序列才被全部測序完成[2]。自2007年，本研究室開始了 DEV疫苗株基因組的測序工作，通過構(gòu)建DEV疫苗株全基因組粘粒文庫，分段對其進(jìn)行了測序和分析，至2009年中期，已將DEV疫苗株全基因組序列解析完成。幾乎同時，Li等也報道了 DEV疫苗株全基因組的測序和分析結(jié)果，其基因組大小約為158Kb，約編碼78個蛋白。通過對DEV疫苗株基因組基因構(gòu)成及結(jié)構(gòu)分析，DEV被認(rèn)為是α皰疹病亞科中的中間型病毒，與水痘病毒屬成員更為相近[2]。而同為禽類皰疫病毒的馬立克病毒(MDV)和火雞皰疫病毒(HTV)屬于馬立克病毒屬，雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和鶴踏皰疫病毒(PsHV)為傳染性喉氣管炎病毒屬。
[0003]自上世紀(jì)80年代成功利用痘病毒為載體表達(dá)單純皰疹病毒的TK基因以來，人們開始嘗試用各種不同DNA病毒為載體，表達(dá)不同外源基因，并將構(gòu)建的重組疫苗用于人和各種不同動物疾病的預(yù)防。大量的研究結(jié)果表明，皰疹病毒因其基因組大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被認(rèn)為是一種良好的構(gòu)建重組活疫苗的病毒載體。截止目前，在常見畜禽皰疹病毒疾病中，已有大量的相關(guān)研究報道；如以偽狂犬病毒(PRV)為載體，分別在gD、gE、gG和TK等基因中插入豬瘟(CSF)的E2等外源基因，并用其免疫豬，取得了良好的免疫效果[4_11]。用在雞傳`染性喉氣管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分別插入不同HA基因構(gòu)建成功的重組病毒免疫雞，均效果良好[11_13]。同樣，Sakaguchi M(1993 ；1994)和Sonoda K(1996)等分別在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫I日齡無特定病原雞(SPF雞)，I周后用vMDV、vvMDV攻毒，其對SPF雞的保護(hù)效率為80~100% [14_16]；在MDVl的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重組病毒對MDV強(qiáng)毒的保護(hù)效率與對照MDVl相當(dāng)[17’18] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作為傳染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的啟動子插入火雞皰疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之間成功構(gòu)建重組病毒，用其免疫的SPF雞足以抵抗IBDV強(qiáng)毒的攻擊[19]。當(dāng)前，我國用于鴨瘟預(yù)防的疫苗主要是上世紀(jì)60年代研究成功的雞胚弱化活疫苗。作為α皰疹病亞科一員，DEV也應(yīng)該是一種良好的構(gòu)建重組活疫苗的病毒載體。
[0004]DEV的基因組成及結(jié)構(gòu)與MDV等有著較大的差異，如MDV的基因組結(jié)構(gòu)為TRL-UL-1RL-1RS-US-TRS,而DEV基因組的結(jié)構(gòu)是UL-1RS-US-TRS。且DEV與同亞科的另外幾種畜禽皰疹病毒在動物體內(nèi)生長復(fù)制的生物學(xué)特點也不盡相同。因此，在PRV、MDV、ILTV中可穩(wěn)定插入外源基因的位點不一定適用于DEV。由于對DEV的研究相對滯后，國內(nèi)外關(guān)于DEV基因中復(fù)制非必需區(qū)的研究報道仍是空白。常用于構(gòu)建皰疹病毒重組病毒的方法有三種。一種是同源重組；第二種是將病毒基因組插入BAC中，然后在BAC上構(gòu)建突變，用其轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞拯救出重組病毒；第三種是將含有相互重疊區(qū)的皰疹病毒基因片段分別插入粘粒中，并在其相應(yīng)區(qū)段上構(gòu)建突變，再用其共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞拯救出重組病毒。然而對于DEV這種基礎(chǔ)研究缺乏、分類不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二種方法構(gòu)建重組病毒工作量大，且效率低。而第三種方法的難點在于多粘粒感染性克隆的建立，如果這個平臺構(gòu)建成功，將能快速有效的構(gòu)建重組病毒。至今，皰疹病毒的這種感染性克隆構(gòu)建技術(shù)已比較成熟，且已見諸報道[2°_27]。
[0005]本研究室在前期研究中，在鴨病毒性腸炎病毒的基因組中鑒定出可供外源基因穩(wěn)定插入的復(fù)制非必需區(qū)。在此基礎(chǔ)之上，本研究將鴨坦布蘇病毒PTD2010株的保護(hù)性基因E基因表達(dá)框架插入DEV基因組的US7和US8基因之間，用其免疫無特定病原鴨(SPF鴨)能使SPF鴨產(chǎn)生良好的對抗鴨坦布蘇病毒的抗體，且不影響DEV的免疫效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提 供一種表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為CCTCC V201214，命名為rDEV-TE-tPAS，及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0007]具體地，本發(fā)明利用重組克隆技術(shù)，將包含鴨坦布蘇病毒E基因和SV40啟動子序列的基因片段SV40-E(SEQ ID NO:1)插入到鴨病毒性腸炎病毒(duck enteritis virus,DEV)的US7和US8基因之間的間隔區(qū)(US7和US8基因之間的間隔區(qū)的核苷酸序列見SEQID NO:5)中，構(gòu)建獲得在US7和US8基因之間插入SV40E表達(dá)框的粘粒pF0S5us78 SV40E，由其拯救獲得表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201214，命名為rDEV-TE-tPAS。本發(fā)明還涉及構(gòu)建該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，以及該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病的疫苗的應(yīng)用。
[0008]在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供一種表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為CCTCC V201214，命名為rDEV-TE-tPAS，其于2012年4月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072)。所述表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201214在鴨腸炎病毒DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)(SEQ ID NO:5)中插入包含鴨坦布蘇病毒E基因和SV40啟動子序列的基因片段SV40-E(SEQ ID N0:1)。
[0009]在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供構(gòu)建表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201214的方法，所述方法包括下述步驟:
[0010](I)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒(DEV)基因組的Fosmid文庫，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pF0S5粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)；
[0011](2)利用步驟(1)中獲得的包含DEV基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)的粘粒PF0S5，在該粘粒的US7和US8基因之間插入包含鴨坦布蘇病毒E蛋白和SV40啟動子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)，構(gòu)建重組突變粘粒；和
[0012](3)利用步驟(2)中獲得的重組突變粘粒和步驟(1)中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的pF0Sl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCCV201214，將其命名為 rDEV-TE-tPAS。
[0013]在優(yōu)選的實施方案中，上述步驟(1)中得到的5粘?？寺∷镍啿《拘阅c炎病毒DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組(它們的重疊和覆蓋模式可參見圖9)。
[0014]在優(yōu)選的實施方案中，上述步驟(2)中的鴨坦布蘇病毒E蛋白來源于鴨坦布蘇病毒PTD2010株，鴨坦布蘇病毒PTD2010株由本發(fā)明人于2010年從福建莆田鴨群中分離得到，由獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室暨農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室保存；上述步驟(2)中的SV40啟動子序列來源于包含SV40啟動子的質(zhì)粒，例如，pSI質(zhì)粒(購自PiOmega公司)
坐寸ο
[0015]本發(fā)明所用的鴨病毒性腸炎病毒為DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBankEU082088)(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)，目錄編號AV1222 ;購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。
[0016]在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，E蛋白的插入位置不影響所構(gòu)建的重組疫苗株對鴨病毒性腸炎病毒的免疫效果(數(shù)據(jù)未顯示)。但E蛋白插入其他位置，是否會影響其抗鴨病毒性腸炎病毒的保護(hù)效果需要實驗來證明。
`[0017]在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供所述表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201214的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病的疫苗。
[0018]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒在家禽中引起的傳染病，例如，由鴨病毒性腸炎病毒DEV引起的鴨病毒性腸炎，由鴨坦布蘇病毒引起的鴨坦布蘇病毒病等。
[0019]在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗，其包括本發(fā)明所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及藥用佐劑、賦形劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述疫苗的應(yīng)用目的、進(jìn)行免疫的禽類等因素，可以容易地選擇適合的藥用佐劑、賦形劑等。
[0020]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述疫苗可以有效用于預(yù)防由鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒在家禽中引起的傳染病，例如，有效用于預(yù)防由鴨病毒性腸炎病毒DEV引起的鴨病毒性腸炎，由鴨坦布蘇病毒引起的鴨坦布蘇病毒病等。所述疫苗可用于家禽，例如，鴨、鵝、雞等。
[0021]因此，本發(fā)明提供下述:
[0022]1.表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為 CCTCC V201214，命名為 rDEV-TE-tPAS。
[0023]2.根據(jù)第I項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中在鴨腸炎病毒DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)中插入包含鴨坦布蘇病毒E蛋白和SV40啟動子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)。[0024]3.根據(jù)第I項或第2項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述鴨坦布蘇病毒E蛋白由鴨坦布蘇病毒PTD2010株擴(kuò)增得到。
[0025]4.根據(jù)第2項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述SV40啟動子序列來源于包含SV40啟動子的質(zhì)粒。
[0026]5.根據(jù)第4項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述包含SV40啟動子的質(zhì)粒包括pSI質(zhì)粒。
[0027]6.構(gòu)建第I項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟:
[0028](I)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的Fosmid文庫，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pF0S5粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)；
[0029](2)利用步驟⑴中獲得的包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)的粘粒PF0S5，在該粘粒的US7和US8基因之間的間隔區(qū)中插入包含鴨坦布蘇病毒E蛋白和SV40啟動子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)，構(gòu)建重組突變粘粒；和
[0030](3)利用步驟(2)中獲得的重組突變粘粒和步驟⑴中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的pF0Sl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCCV201214，將其命名為 rDEV-TE-tPAS。
[0031]7.根據(jù)第6項所述的方法，其中步驟(1)中得到的5粘粒組合系統(tǒng)中的每一個粘粒克隆所包含的DEV DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，相互重疊，且拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組。
[0032]8.第I項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸`炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病的疫苗。
[0033]9.根據(jù)第8項所述的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎和鴨坦布蘇病毒病。
[0034]10.一種疫苗，其包括第I項所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及藥用佐劑、賦形劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中:
[0036]圖1:PCClFos 粘粒圖譜；
[0037]圖2:拯救的病毒dDEV與親本DEV疫苗株病毒基因組分別用BamH 1、EcoR 1.BbvCI酶切后的脈沖電泳圖譜，其中DEV:親本DEV疫苗株(即用于構(gòu)建重組病毒的親本病毒疫苗株)，dDEV:由本發(fā)明人構(gòu)建和篩選的5粘粒系統(tǒng)(參見實施例1-3)拯救出的三株病毒，Ml:低范圍PFG分子標(biāo)記(Low Range PFG Marker) ；M2:DL15000分子標(biāo)記；M3: λ -Hind III消化分子標(biāo)記(λ-Hind III digest Marker)；
[0038]圖3:pUC ccdB kan 質(zhì)粒圖譜；
[0039]圖4:pF0S5 us78 Kan ccdB 粘粒圖譜；
[0040]圖5: pENTR MCS 質(zhì)粒圖譜；
[0041]圖6:pSIE質(zhì)粒圖譜；[0042]圖7:pENTR sv40_E 質(zhì)粒圖譜；
[0043]圖8:pF0S5us78 SV40 E 粘粒圖譜；
[0044]圖9:鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆拯救重組病毒示意圖；
[0045]圖10:重組病毒E蛋白在CEF中的表達(dá)免疫熒光檢測(A和B，B為陰性對照)及蛋白質(zhì)印跡(western blot) (C)檢測結(jié)果圖；
[0046]圖11:PCR檢測外源表達(dá)框架在rDEV-TE-tPAS中的情況；
[0047]圖12:免疫重組病毒后，在SPF鴨體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體的情況；
[0048]圖13:SEQ ID NO:1:SV40_E表達(dá)框架，其中斜體加粗部分為鴨坦布蘇病毒E基因。
【具體實施方式】
[0049]以下通過實施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0050]實施例1.DEV疫苗株基因組Fosmid文庫的構(gòu)建
[0051]按EPICENTRE 公司“CopyControI Fosmid Library Production Kit”試劑盒說明書構(gòu)建DEV基因組的Fosmid文庫。
[0052]方法如下:將DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，目錄編號AV1222 ;購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)DNA用物理方法即用25號針頭(購自上海治宇`醫(yī)療器械有限公司)抽吸多次進(jìn)行切斷處理，用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase,購自 New England Biolabs)及喊性憐酸酶(AlkalinePhosphatase,購自New England Biolabs)對DNA片段進(jìn)行末端平滑化及去磷酸化處理,脈沖電泳(用Bio-Rad公司CHEF Mapper? XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為:電泳緩沖液為0.5xTBE,瓊脂糖膠濃度為I %，程序為2K-80K)，回收38kbp_48kbp之間的DNA片段。將回收后的DEV DNA片斷兩端用T4連接酶連接上Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，精制后連接到pCClFos (購自EPICENTRE，圖譜見圖1)載體上，4°C過夜連接。對混和液進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI300-T1 (購自EPICENTRE)。對文庫滴度進(jìn)行確認(rèn)，其試驗過程如下:將包裝好的混和液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10_2，?ο-4, ?ο-5,10_6四個稀釋度的稀釋液10 μ I感染100 μ I ΕΡΙ300-Τ1細(xì)胞，將此菌涂于含12.5μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計菌落數(shù)量，并計算其滴度，結(jié)果為3.8xl05cfu/lib。即成功構(gòu)建DEV的fosmid文庫。
[0053]實施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的選擇
[0054]文庫構(gòu)建成功后，挑取286個克隆提取粘粒，用堿裂解法[5]提取粘粒，送大連寶生物公司對插入PCCl Fos中的DEV DNA片段末端進(jìn)行測序，測序引物序列如下:
[0055]Primer 1:5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
[0056]Primer 2:5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’
[0057]經(jīng)過末端測序的分析，共得到插入片段兩端都連接有完整Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭的克隆250個。從這250個克隆中選取多組用于拯救DEV的5粘粒組合。其中每組中克隆的DEV DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV
基因組。[0058]實施例3.病毒拯救
[0059]用Qiagen公司的中量提取試劑盒提取所選擇的粘粒的DNA。用Fse 1、Sbf I或Pme I內(nèi)切酶(均購自New England Biolabs)對所選擇的粘粒進(jìn)行線性化處理,反應(yīng)條件如下:Sbf I內(nèi)切酶20U (也可以使用Fse I或Pme I內(nèi)切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用I小時，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制備轉(zhuǎn)染用DEV DNA。
[0060]參照Reddy SM (2002)的磷酸鈣方法將5段DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) [28]，經(jīng)多次重復(fù)，其中有3組5粘粒組合轉(zhuǎn)染4-6天后可見CEF出現(xiàn)DEV病毒典型病變，選取重復(fù)性較好的一組5粘粒組合進(jìn)行后續(xù)實驗。收獲此組5粘粒共轉(zhuǎn)染拯救的病毒，命名為dDEV，用此dDEV與親本DEV病毒(即用于構(gòu)建該感染性克隆的親本病毒)分別接種次代CEF。
[0061]CEF的制備方法如下:取9-10日齡SPF雞胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭氣室部位，脫碘后無菌取出雞胚，放置到盛有Hank’ s液(購自HyClone)的平皿中洗滌，并去除頭、四肢和內(nèi)臟，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分鐘，棄去胰酶，用Hank’s液洗滌2次。加入適量的含血清與雙抗(青霉素100u/mL，鏈霉素IOOmg/mL)的M199營養(yǎng)液(購自HyClone)，吹打使細(xì)胞分散，用四層紗布過濾后制成IO6-1O7細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液，最后分裝于培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。36-48小時后，按毒種:細(xì)胞培養(yǎng)液體積比為1: 1000將病毒接種于CEF。待細(xì)胞病變達(dá)到100%時，收集培養(yǎng)液；4°C 6000g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片；取上清50000g離心2小時富集病毒；然后經(jīng)20%和60%蔗糖密度梯度離心，50000g離心2小時，回收20%和60%中間層；之后經(jīng)50000g離心2小時超速離心脫糖處理獲得純化好的病毒。提取病毒全基因組DNAt29]，分別用BamH 1.EcoR I和BbvC 1(均購自New England Biolabs)對原疫苗株DEV和dDEV進(jìn)行酶切。反應(yīng)條件如下:分別取BamH I,EcoR I和BbvC I各20U，分別與DEV基因組DNA 8 μ g混和，于50 μ I體系中37°C作用I小時。用Bio-Rad公司CHEF Mapper? XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為:電泳緩沖液位0.5x TBE，瓊脂糖膠濃度為1%，程序為2K-70K。
[0062]拯獲的病毒酶切圖譜和親本病毒相同，如圖2所示。說明所選擇的5粘粒組成功拯救DEV病毒。本發(fā)明人將所選擇的5粘粒組成員分別命名為pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、PF0S5，該5粘?？寺∷腄EV DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV基因組(它們的重疊和覆蓋模式可參見圖9)，并且其中pF0S5包含DEV基因組的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)(US7和US8基因之間的間隔區(qū)的核苷酸序列參見SEQ ID N0:5)。關(guān)于該5粘粒系統(tǒng)本發(fā)明人已經(jīng)申請專利，申請?zhí)枮?01010207207.8，題目為“鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性克隆系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”， 申請日期:為2010年6月13日。
[0063]實施例4.在DEV基因組的US7、US8基因之間的間隔區(qū)中插入SV40-E表達(dá)框架(SEQ ID NO:1)的重組突變粘粒的構(gòu)建
[0064]基于上述實施例1-3結(jié)果，在所選擇的5粘粒組成員pF0S5中DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)(SEQ ID NO:5)中，具體地，US7和US8基因之間的間隔區(qū)共223bp，本研究中，該間隔區(qū)缺失了其中第108至111位的四個核苷酸，代之以插入SV40-E表達(dá)框架(SV40-E表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，其中包含SV40啟動子，參見圖13，其中斜體加粗部分為E基因(SEQ ID NO:4))，構(gòu)建I個重組突變粘粒，pF0S5us78 SV40 E (該突變粘粒的圖譜如圖8所示，其構(gòu)建模式可參見圖9)。在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，E基因的插入位置不影響其對鴨病毒性腸炎病毒的免疫效果。但E基因插入其他位置，是否會影響其對鴨病毒性腸炎病毒的保護(hù)效果需要實驗來證明。
[0065]pF0S5us78 SV40 E粘粒的構(gòu)建過程簡述如下:
[0066]4.1 pUC ccdB kan 的構(gòu)建:
[0067]用表1所示的三對引物(由TaKaRa公司合成)分別對Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 TlCompetent Cells試劑盒中提供的“RfA”(其中基因為aatRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO:2)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
[0068]表1:用于克隆“Rfkan” (其中基因為aatRl-卡那霉素-ccdB_aatR2)基因的PCR引物
[0069]
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為CCTCC V201214。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中在鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)中插入包含鴨坦布蘇病毒E基因和SV40啟動子序列的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列為SEQ IDNO:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述鴨坦布蘇病毒E基因來源于PTD2010株病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述包含鴨坦布蘇病毒E基因和SV40啟動子序列的基因片段替換所述鴨病毒性腸炎病毒基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)的第108至111位的四核苷酸片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其中所述SV40啟動子序列來源于包含SV40啟動子的質(zhì)粒,例如pSI質(zhì)粒。
6.構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟: (1)構(gòu)建鴨病毒性腸炎病毒DEV基因組的Fosmid文庫，并從中選擇用于拯救鴨病毒性腸炎病毒的5粘粒組合系統(tǒng)，將它們分別命名為pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中PF0S5粘粒包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)； (2)利用步驟(1)中獲得的包含鴨病毒性腸炎病毒基因組中的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)的粘粒PF0S5，在該粘粒的US7和US8基因之間的間隔區(qū)中插入包含鴨坦布蘇病毒E基因和SV40啟動子序列的基因片段SEQ ID NO:1，構(gòu)建重組突變粘粒；和 (3)利用步驟(2)中獲得的重組突變粘粒和步驟(1)中獲得的5粘粒組合系統(tǒng)中的pFOSl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞CEF，拯救出重組病毒株CCTCCV201214，將其命名為 rDEV-TE-tPAS。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(1)中得到的5粘粒組合系統(tǒng)中的每一個粘?？寺∷镍啿《拘阅c炎病毒DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，相互重疊，并且拼接覆蓋鴨病毒性腸炎病毒全基因組。
8.權(quán)利要求1所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的應(yīng)用，其用于制備預(yù)防鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病的疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒和鴨坦布蘇病毒引起的傳染病包括鴨病毒性腸炎和鴨坦布蘇病毒病。
10.一種疫苗，其包括權(quán)利要求1所述的表達(dá)分泌型鴨坦布蘇病毒E蛋白的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及藥用佐劑、賦形劑。
【文檔編號】C12N15/34GK103667198SQ201210331134
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月10日
【發(fā)明者】陳化蘭, 柳金雄, 陳普成, 姜永萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所