Mek1基因突變的快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種絲裂原活化蛋白激酶1（Mitogen?Activated?protein?Kinase?Kinase?1，MEK1/MAPKK1）基因突變的快速檢測(cè)方法，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟：在MEK1基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物；分別設(shè)計(jì)了MEK1第2號(hào)外顯子（MEK1-E2）和第3號(hào)外顯子（MEK1-E3）的野生型引物和突變型，引物分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對(duì)兩種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段；不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分；與其它方法相比，本發(fā)明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn)；而且通量更高，單次成本更低。
【專利說(shuō)明】MEK1基因突變的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是分子生物學(xué)，分子診斷，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。
【背景技術(shù)】:
[0002]MEKl基因位于人染色體15q22.1-22.33，基因全長(zhǎng)約104kb，轉(zhuǎn)錄后mRNA長(zhǎng)2603bp，編碼一個(gè)由393個(gè)氨基酸殘基組成的絲裂原活化蛋白激酶激酶，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。
[0003]MEKl蛋白參與MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)，其受MAPKKK激活，活化后的MEKl通過(guò)共價(jià)修飾即雙位點(diǎn)磷酸化激活MAPK。MAPK活化后，磷酸化下游底物(轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、酶、結(jié)構(gòu)蛋白等)，以此調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和粘附、遷移等過(guò)程，繼而影響腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性。
[0004]MEKl基因的突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。其突變位點(diǎn)分布廣泛，熱點(diǎn)突變位點(diǎn)集中于外顯子2和外顯子3，如圖1所示。Estep等研究顯示，卵巢癌中易發(fā)生外顯子2上D67N的突變。Marks等研究顯示，在肺癌中存在外顯子2上K57N突變。Murugan等研究顯示，在結(jié)腸癌中存在D67N突變，在黑素瘤中存在K57N突變。這些結(jié)果顯示，針對(duì)MEKl基因突變的檢測(cè)對(duì)多種腫瘤的預(yù)防和早期診斷有重要意義。 [0005]高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門(mén)的分析算法。使我們可以不必測(cè)序直接篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在遺傳學(xué)變異(SNPs, mutations)。
[0006]SYBRTM Green I 對(duì) PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因?yàn)樗欠秋柡蛻B(tài)結(jié)合，染料在熔解過(guò)程中可重新結(jié)合，使其無(wú)法適用于HRM。
[0007]羅氏開(kāi)發(fā)了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三個(gè)優(yōu)點(diǎn):飽和染料毒性低；高濃度可以使DNA達(dá)到飽和；降低了染料位置重組的可能。
[0008]而，PCRPCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的高分辨率溶解曲線HRM的要求:
[0009]儀器:高分辨率高均一性的儀器，確保結(jié)果差異僅受DNA模板的影響
[0010]試劑:穩(wěn)定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線
[0011]軟件:高分辨率熔解曲線分析專用軟件
[0012]羅氏突光定量PCR系統(tǒng)LightCycler Nano System具有光源好、溫控好、檢測(cè)好、加熱快的優(yōu)點(diǎn)，完全能滿足檢測(cè)的要求，這臺(tái)儀器也于近期通過(guò)了國(guó)家藥監(jiān)局的審批，適用于臨床診斷檢測(cè)。
[0013]LightCycler Nano System是LightCycler 480 System 的縮小版,ightCyc ler?480在HRM領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)是當(dāng)前發(fā)表文獻(xiàn)最多的實(shí)時(shí)定量PCR
[0014]系統(tǒng):應(yīng)用領(lǐng)域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等；影響因子 10 分以上 5 篇，包括 Nature, Nature Methods, Nature Genetics,影響因子 5 — 10分10篇，5分以上文章占總數(shù)的18%逐年上升趨勢(shì)明顯，已經(jīng)成為當(dāng)前qPCR擴(kuò)展應(yīng)用的熱點(diǎn)目前常常使用測(cè)序法來(lái)檢測(cè)是否存在突變，但是總結(jié)下來(lái)，現(xiàn)有的測(cè)序法有三個(gè)缺點(diǎn):
[0015]第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無(wú)法檢測(cè)；
[0016]第二:耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要2-3天；
[0017]第三:成本高。
[0018]鑒于以上的問(wèn)題，一種靈敏度高、耗時(shí)短、成本低、可操作性能更高的實(shí)MEKl基因突變的快速檢測(cè)方法的發(fā)明是勢(shì)在必行的。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0019]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題主要是:現(xiàn)有的測(cè)序法有三個(gè)缺點(diǎn):
[0020]第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無(wú)法檢測(cè)；
[0021]第二:耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要2-3天；
[0022]第三:成本高。
[0023]為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種絲裂原活化蛋白激酶I (MitogenActivated protein Kinase Kinase 1，MEK1/MAPKK1)基因突變的快速檢測(cè)方法,本發(fā)明技術(shù)在突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物，兩者分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對(duì)兩種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型(Tm的不同):PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量.[0024]高Tm G: C>A: T>G: G>G: T=G: A > T:T=A: A>T:C>A: OC: C 低 Tm
[0025]純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；當(dāng)然，包括野生型純合子或突變純合子。
[0026]雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0027]本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了 MEKl第2號(hào)外顯子(MEK1-E2)和第3號(hào)外顯子(MEK1-E3)的野生型引物和突變型引物，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
[0028]即，為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種MEKl基因突變的快速檢測(cè)方法，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟:
[0029]在MEKl基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物；
[0030]分別設(shè)計(jì)了 MEKl第2號(hào)外顯子(MEK1-E2)和第3號(hào)外顯子(MEK1-E3)的野生型引物和突變型，引物分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對(duì)兩種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段；
[0031]不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
[0032]所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于 GC 含量；所述高 Tm G: OA: T>G: G>G: T=G: A>T:T=A: A>T:C>A: OC: C低Tm。
[0033]所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0034]所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
[0035]所述的一種MEKl基因突變的快速檢測(cè)方法，其包括如下步驟:
[0036]樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻,4°C保存；
[0037]DNA提取:取200 μ L抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對(duì)DNA純度和濃度作檢測(cè)；
[0038]qPCR-HRM檢測(cè)，包括:對(duì)照孔的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔；10 μ L反應(yīng)體系構(gòu)成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)-LightCycler Nano儀器中進(jìn)行程序性檢測(cè)；
[0039]結(jié)果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽(yáng)性對(duì)照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽(yáng)性對(duì)照孔的判定為突變型，差異小于陽(yáng)性對(duì)照孔的判定為野生型。
[0040]所述qPCR-HRM檢測(cè)的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65 °C，每個(gè)循環(huán)降低1°C，時(shí)間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個(gè)循環(huán)；95°C變性60秒鐘；40°C
[0041]變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.05°C /s)。
[0042]所述MEK1-E2突變型目的片段的獲取包括:利用帶有突變位點(diǎn)的突變引物(MEK1-E2 L42F F，MEK1-E2 L42F R)獲得突變位點(diǎn)前后兩段突變片段；將這兩段突變片段連接起來(lái)，構(gòu)成MEK1-E2突變型目的片段。
[0043]所述MEK1-E2突變型目的片段的獲取包括:
[0044]突變第一步PCR:以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以MEK1-E2 F+MEK1-E2L42F R, MEK1-E2 L42F F+MEK1-E2 R為引物進(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)，獲得兩個(gè)條帶單一的片段；
[0045]突變第一步產(chǎn)物稀釋:將突變第一步獲得的兩段PCR產(chǎn)物稀釋I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為IOng/ μ L ；
[0046]突變第二步PCR:以稀釋后的第一步兩段產(chǎn)物為模板，以ΜΕΚ1-Ε2 F+MEK1-E2R為引物進(jìn)行第二步PCR，獲得條帶單一的片段；
[0047]突變第二步產(chǎn)物稀釋:將突變第二步獲得的PCR產(chǎn)物稀釋I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為 IOng/μ L ；
[0048]所述M/W = 1/10、1/100、1/1000陽(yáng)性對(duì)照模板的獲取包括:混合9 μ L野生型模板和IyL突變型模板，配制10 μ L突變型/野生型(M/W) =1/10的混合模板，作為檢測(cè)用1/10陽(yáng)性對(duì)照模板；將此模板用野生型模板作10倍稀釋，分別獲得突變型/野生型(Μ/W) =1/100、1/1000的混合模板，作為檢測(cè)用1/100、1/1000陽(yáng)性對(duì)照模板。
[0049]所述野生型目的片段的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，ΜΕΚ1-Ε2F+MEK1-E2 R為引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得條帶單一的特異性野生型目的片段；將目的片段稀釋至
I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為IOng/μ L，作為檢測(cè)野生型陰性對(duì)照模板用。
[0050]所述IOyL反應(yīng)體系構(gòu)成如下:
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種MEKl基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟:在MEKl基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物； 分別設(shè)計(jì)了 MEKl第2號(hào)外顯子(MEK1-E2)和第3號(hào)外顯子(MEK1-E3)的野生型引物和突變型，引物分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型模板，再用野生型引物對(duì)兩種模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段； 不同比例混合這兩種片段，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MEKl基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟: 樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存； DNA提取:取200 μ L抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對(duì)DNA純度和濃度作檢測(cè)； qPCR-HRM檢測(cè)，包括 :對(duì)照孔的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔；10μ L反應(yīng)體系構(gòu)成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)儀器中進(jìn)行程序性檢測(cè)； 結(jié)果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽(yáng)性對(duì)照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽(yáng)性對(duì)照孔的判定為突變型，差異小于陽(yáng)性對(duì)照孔的判定為野生型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測(cè)的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65°C，每個(gè)循環(huán)降低1°C，時(shí)間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個(gè)循環(huán);95°C變性60秒鐘；40°C變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.05°C /s)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一所述的方法，其特征在于:所述MEK1-E2突變型目的片段的獲取包括: 利用帶有突變位點(diǎn)的突變引物(MEK1-E2 L42F F，MEK1-E2 L42F R)獲得突變位點(diǎn)前后兩段突變片段； 將這兩段突變片段連接起來(lái)，構(gòu)成MEK1-E2突變型目的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述MEK1-E2突變型目的片段的獲取包括: 突變第一步PCR:以稀釋后的野生型目的片段為模板，分別以MEK1-E2 F +MEK1-E2L42F R, MEK1-E2 L42F F+MEK1-E2 R為引物進(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)，獲得兩個(gè)條帶單一的片段； 突變第一步產(chǎn)物稀釋:將突變第一步獲得的兩段PCR產(chǎn)物稀釋I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為 IOng/μ L ； 突變第二步PCR:以稀釋后的第一步兩段產(chǎn)物為模板，以ΜΕΚ1-Ε2 F+MEK1-E2R為引物進(jìn)行第二步PCR，獲得條帶單一的片段； 突變第二步產(chǎn)物稀釋:將突變第二步獲得的PCR產(chǎn)物稀釋I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為IOng/μ L0
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一所述的方法，其特征在于:所述M/W= 1/10、1/100、1/1000陽(yáng)性對(duì)照模板的獲取包括:混合9 μ L野生型模板和I μ L突變型模板，配制10 μ L突變型/野生型(M/W) =1/10的混合模板，作為檢測(cè)用1/10陽(yáng)性對(duì)照模板；將此模板用野生型模板作10倍稀釋。 分別獲得突變型/野生型(M/W) =1/100、1/1000的混合模板，作為檢測(cè)用1/100、1/1000陽(yáng)性對(duì)照模板。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一所述的方法，其特征在于:所述野生型目的片段的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，ΜΕΚ1-Ε2 F+MEK1-E2 R為引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得條帶單一的特異性野生型目的片段；將目的片段稀釋至I萬(wàn)-10萬(wàn)倍，終濃度約為IOng/ μ L，作為檢測(cè)野生型陰性對(duì)照模板用`。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525901SQ201210335559
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月11日
【發(fā)明者】王明, 彭南求 申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司