專利名稱：氨基脲衍生物的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其應用，尤其是氨基脲衍生物的單克隆抗體及其應用，屬于免疫化學技術領域。
背景技術：
呋喃西林(nitrofurazone)屬于硝基呋喃類藥物,是一種廣譜抗菌藥，因價格低廉、效果好，被作為治療藥物和飼料添加劑用于畜、禽、水產養(yǎng)殖中控制疾病。呋喃西林分子中的藥效基團一硝基是其作為藥理作用及毒性產生的主要原因，同時也使得呋喃西林具有致畸、致癌性及誘發(fā)哺乳動物細胞染色體損傷等副作用。歐盟于1995年將呋喃西林列為禁用藥。中國農業(yè)部2002年4月發(fā)布的第193號公告中，呋喃西林被列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》中，在所有食品動物中禁用，2003年又將水產品中硝基呋喃代謝物納入殘留監(jiān)控計劃中。但由于呋喃西林具有很好的治療及預防效果，目前仍在水產養(yǎng)殖、 畜、禽中被廣泛使用，從而導致食品中呋喃西林殘留日趨嚴峻。因此，為保護消費者健康，增強中國動物源性食品檢疫力度、擴大貿易出口，對動物源性食品中氨基脲(SEM)殘留的檢測是非常必要的。
呋喃西林原型藥在動物體內很快代謝成氨基脲，而在組織中結合的代謝產物則能存留較長的一段時間，被視為呋喃西林殘留的標示物，所以通常通過分析其代謝產物SEM 來分析呋喃西林殘留。目前用于呋喃西林殘留標示物SEM的檢測方法有液液萃取-高效液相色譜、固相萃取_高效液相色譜法(SPE-HPLC)、液相色譜質譜聯(lián)用儀等方法。但這些儀器方法所需儀器價格昂貴，耗時長，對操作人員的要求較高，不適合在基層單位推廣，不適合高通量的樣品快速篩選。免疫化學分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(ELISA)具有快速、 靈敏度高、操作簡單、專一性好等優(yōu)點，適合高通量的樣品篩選。
本研究將小分子藥物氨基脲與對醛基苯甲酸進行衍生化實驗，引入活性基團一羧基，并通過混合酸酐法將該衍生物與載體蛋白偶聯(lián)獲得人工合成的完全抗原，該法合成的完全抗原，通過交聯(lián)臂對醛基苯甲酸的作用，可以將小分子藥物氨基脲充分暴露出來，使機體更容易識別抗原決定簇，提高抗原的免疫原性。以制備的完全抗原免疫Balb/c鼠，通過融合篩選得到能夠識別氨基脲衍生物的單克隆抗體，從而為呋喃西林代謝物殘留檢測的免疫學方法奠定基礎。發(fā)明內容
本發(fā)明要解決技術問題是針對以上現(xiàn)有技術存在的缺點，提出一種氨基脲衍生物的單克隆抗體，并將該單克隆抗體應用于檢測呋喃西林代謝物。 該方法具有操作簡便、成本低廉、高通量、特異性強的特點。
本發(fā)明所涉及的雜交瘤細胞株9B10已于2011年7月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC No. 5072，分類命名為抗氨基脲衍生物單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
由以上雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體命名為9B10’，其制備步驟如下a.制備免疫原和包被原采用對醛基苯甲酸法將載體蛋白(BSA)與氨基脲小分子偶聯(lián)，合成免疫原和包被原；b.動物免疫注射以Balb/c鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫原并加強免疫；c.篩選動物免疫血清用間接酶聯(lián)免疫吸附法和競爭間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選免疫鼠血清；d.制備雜交瘤細胞取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合,經過亞克隆獲得可以穩(wěn)定分泌抗氨基脲衍生物單克隆抗體的雜交瘤細胞株9B10 ；e.制備并純化單克隆抗體對小鼠腹腔注射雜交瘤細胞9B10，采集腹水，對腹水進行液相層析純化，獲得氨基脲衍生物單克隆抗體9B10’。
其中，步驟a所述載體蛋白為牛血清白蛋白和卵清白蛋白，對應的免疫原為 SEM-BSA，包被原為SEM-OVA ;所述對醛基苯甲酸法中，交聯(lián)劑活化小分子衍生物的時間為 1-2小時，用氨基脲小分子衍生物與載體蛋白偶聯(lián)反應10-15小時。所述步驟b中的各次免疫注射劑量為50-100 μ g/只。所述步驟e中對免疫小鼠腹腔進行單克隆抗體細胞株的注射量為(1-5) X IO6個/只。
通過亞型鑒定得出本發(fā)明單克隆抗體的亞型為IgGl型。
常規(guī)制備氨基脲衍生物單克隆抗體的方法主要是通過藥物的羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，本發(fā)明將氨基脲小分子通過對醛基苯甲酸進行衍生化并將衍生產物的羧基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)，從而暴露氨基脲的結構，在后期篩選過程中可以獲得針氨基脲衍生物的抗體。
本發(fā)明的再一個目的是提供該單克隆抗體在制備檢測呋喃西林代謝物中的應用， 主要是將其應用于制備檢測呋喃西林代謝物殘留的ELISA試劑盒和膠體金試條紙。
本發(fā)明的有益效果是通過小鼠雜交瘤細胞株9B10產生的單克隆抗體9B10’，該抗體與其它呋喃類藥物交叉反應率低，能夠大量生產，并可用于制備檢測呋喃西林代謝物的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達到快速、特異、且靈敏地檢測蜂蜜及動物組織中的呋喃西林代謝物殘留的目的，為檢測呋喃西林代謝物殘留的ELISA試劑盒、膠體金產品研制奠定基礎。


圖I為本發(fā)明實施例一中免疫原的OD335標準曲線。
圖2為本發(fā)明實施例一中包被原的OD335標準曲線。
具體實施方式
實施例一試劑與材料準備呋喃西林(上海安譜科學儀器有限公司，C15571000)，SEM(上海安譜科學儀器有限公司，C16933500)，對醛基苯甲酸(Sigma 124 91-5)，DMF (sigma, D4551 )，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson,001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503),弗氏完全佐劑(Sigma, F5881)，弗氏不完全佐劑(Sigma, F5506)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Amresco, 0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化鈉(Amresco, 0241)，氯化鉀(Amresco, 0395),磷酸二氫鉀(Sigma, P9791),磷酸氫二鈉(Sigma, 71639),羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二甲基亞砜(DMSO) (Applichem，0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306), DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco, C20270)。
實驗動物與細胞Balb/c小鼠(6-8周齡，雌性)，購自揚州大學動物中心，SP2/0 (小鼠骨髓瘤細胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教授惠贈。
本發(fā)明的實驗步驟如下a. 制備免疫原SEM-BSA和包被原SEM-OVA 本發(fā)明所述的人工抗原采用對醛基苯甲酸將氨基脲衍生化，并利用氨基脲衍生物上的羧基和載體蛋白上的氨基進行偶聯(lián)，從而合成呋喃西林抗原。氨基脲衍生物結構式如下
權利要求
1.一種產生氨基脲衍生物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株9B10，是小鼠雜交瘤細胞系 CGMCC No. 5072。
2.根據權利要求I所述雜交瘤細胞株9B10產生的單克隆抗體9B10’。
3.根據權利要求2所述單克隆抗體9B10’，其特征在于所述單克隆抗體亞型為IgGl型。
4.根據權利要求2所述單克隆抗體9B10’在檢測氨基脲殘留中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其應用，尤其是氨基脲(呋喃西林代謝物)衍生物的單克隆抗體及其應用，屬于免疫化學技術領域。本發(fā)明的氨基脲衍生物單克隆抗體9B10’是由小鼠雜交瘤細胞株9B10產生，其亞型是IgG1型。本發(fā)明的有益效果是通過小鼠雜交瘤細胞株9B10產生的單克隆抗體9B10’，能夠大量生產，可用于制備檢測氨基脲殘留的酶聯(lián)免疫分析試劑盒和膠體金試紙條，達到快速且靈敏地檢測蜂蜜及動物組織中氨基脲殘留的目的。
文檔編號C12N5/20GK102936584SQ20121033607
公開日2013年2月20日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權日2011年9月23日
發(fā)明者唐宏, 崔迎利, 王曉艷 申請人:泰州康正生物技術有限公司