西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法
【專利摘要】西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于：包含以下步驟；（1）將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成1厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)；（2）將上述處理后的莖段放置在含有0.2-2.0mg.L-1萘乙酸與0.1-2.0mg.L-16-芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25℃黑暗下培養(yǎng)；（3）兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有0.2-2.0mg.L-1萘乙酸與0.1-2.0mg.L-16-芐氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。該方法采用未分裂的形成層干細(xì)胞進(jìn)行分離及培養(yǎng)西紅柿干細(xì)胞，其形成層干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)限增殖，可有效擴(kuò)大生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蔬菜干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，特別涉及一種西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西紅柿是消費(fèi)量很大的果蔬，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，市場(chǎng)需求量很大。西紅柿含有番茄紅素等多種抗氧化物質(zhì)和其它有效成份，這些有效成分可作為中間產(chǎn)品進(jìn)行開(kāi)發(fā)，用于保健食品和化妝品。目前生產(chǎn)上培育的西紅柿品種豐富，種植面積大，產(chǎn)量也很高，是滿足西紅柿需求的主要途徑。
[0003]雖然傳統(tǒng)的種植技術(shù)及近年來(lái)發(fā)展的反季節(jié)栽培技術(shù)可以大量生產(chǎn)西紅柿，但由于西紅柿不耐儲(chǔ)存，生產(chǎn)過(guò)程中又容易受到環(huán)境條件、病蟲(chóng)害和重金屬污染的影響，所以西紅柿產(chǎn)業(yè)總體上存在產(chǎn)品質(zhì)量難以控制，保鮮期短，即使采用各種方法延長(zhǎng)保存期也難以保持新鮮的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等問(wèn)題，因此不能保持穩(wěn)定的對(duì)西紅柿有效成分進(jìn)行提取，影響該中間產(chǎn)品的生產(chǎn)。
[0004]通過(guò)離體懸浮培養(yǎng)西紅柿的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)西紅柿的相關(guān)成份，這種方法不受生長(zhǎng)季節(jié)的限制就可以通過(guò)規(guī)模化生產(chǎn)來(lái)獲得大量的西紅柿有效成分。在過(guò)去的生產(chǎn)實(shí)踐中，通常取西紅柿的莖或葉片為外殖體在特定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)脫分化階段誘導(dǎo)得到具有分裂能力的愈傷細(xì) 胞，進(jìn)一步將該細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)大生產(chǎn)。
[0005]目前已有的技術(shù)在分離西紅柿的細(xì)胞時(shí)，均采用已經(jīng)分化的組織器官為外殖體，通過(guò)離體培養(yǎng)階段的培養(yǎng)(脫分化過(guò)程)將其誘導(dǎo)為具有分化能力的愈傷細(xì)胞。但這種細(xì)胞的本質(zhì)是來(lái)源于已經(jīng)分化的體細(xì)胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不強(qiáng)。在工業(yè)化量產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞系退化，分裂能力弱，很難進(jìn)行超大體積的培養(yǎng)等缺點(diǎn)。
[0006]針對(duì)已有的西紅柿細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中采用的體細(xì)胞的缺點(diǎn)，本發(fā)明則注重分離和培養(yǎng)西紅柿的形成層干細(xì)胞。因?yàn)樾纬蓪痈杉?xì)胞是處于未分化狀態(tài)的細(xì)胞，具有無(wú)限分裂的能力，所以懸浮培養(yǎng)中如果采用形成層干細(xì)胞將可以避免脫分化體細(xì)胞的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，目的是解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，提供一種提供一種采用未分裂的形成層干細(xì)胞進(jìn)行分離及培養(yǎng)西紅柿干細(xì)胞的方法，該方法僅使形成層干細(xì)胞進(jìn)行無(wú)限增殖，而體細(xì)胞則不會(huì)增殖。
[0008]本發(fā)明解決問(wèn)題采用的技術(shù)方案是:
[0009]西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:包含以下步驟；
[0010](I)將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成I厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)。
[0011](2)將上述處理后的莖段放置在含有萘乙酸與芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25 °C黑暗下培養(yǎng)。[0012](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有萘乙酸與芐氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。
[0013]步驟(2)中MS培養(yǎng)基上含有0.2-2.0mg.卜1萘乙酸與0.1-2.0mg.Μ6-芐氨基腺嘌呤。其中萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.16-芐氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.卜1。
[0014]步驟(3)中MS培養(yǎng)基上含有0.2-2.0mg.卜1萘乙酸與0.1-2.0mg.Μ6-芐氨基腺嘌呤。其中萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.16-芐氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.卜1。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明中采用對(duì)西紅柿的形成層干細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)，由于形成層干細(xì)胞是處于未分化狀態(tài)的細(xì)胞，具有無(wú)限分裂的能力，所以懸浮培養(yǎng)中采用形成層干細(xì)胞可以避免脫分化體細(xì)胞的缺點(diǎn)，能夠進(jìn)行超大體積的培養(yǎng)，而且通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中萘乙酸與6-芐氨基腺嘌呤的濃度限定，可以控制體細(xì)胞的生長(zhǎng)，只有形成層干細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)，能有效穩(wěn)定的對(duì)西紅柿有效成分進(jìn)行生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1中表示的是接種在培養(yǎng)基上的西紅柿莖段；
[0017]圖2中表示的是西紅柿莖段上增殖的干細(xì)胞團(tuán)塊；
[0018]圖3中表示的是西紅柿干細(xì)胞的繼代增殖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0020]本發(fā)明西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0021](I)將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成I厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)，(見(jiàn)圖1)。
[0022](2)將上述處理后的莖段放置在含有0.2-2.0mg.M萘乙酸與0.1-2.0mg.Μ6-芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)。其中萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.卜1，6-芐氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.H。由于形成層的干細(xì)胞分裂速度快，導(dǎo)致形成層干細(xì)胞團(tuán)在外殖體上顯著積累而形成一團(tuán)細(xì)胞(見(jiàn)圖2)，這種干細(xì)胞團(tuán)質(zhì)地致密，表面較光滑平整。
[0023](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有
0.2-2.0mg.η萘乙酸與0.1-2.0mg.Μ6-芐氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細(xì)胞(圖3)。其中萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.H，6-芐氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.H。
[0024]實(shí)施例1
[0025](1)將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成I厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)。
[0026](2)將上述處理后的莖段放置在含有0.2mg.萘乙酸與0.5mg.M6-芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25 °C黑暗下培養(yǎng)。
[0027](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有
0.5mg.η萘乙酸與1.0mg.L_16-節(jié)氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng),每?jī)芍芾^代一次。
[0028]實(shí)施例2
[0029](I)將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成I厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)。
[0030](2)將上述處理后的莖段放置在含有1.0mg.萘乙酸與1.5mg.M6-芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25 °C黑暗下培養(yǎng)。
[0031](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有
2.0mg.η萘乙酸與1.5mg.L_16-節(jié)氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng),每?jī)芍芾^代一次。
[0032]下述表格I中數(shù)值為實(shí)施例3至實(shí)施例15采用的MS培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中萘乙酸和6-芐氨基腺嘌呤的濃度。
[0033]表1
[0034]
【權(quán)利要求】
1.西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:包含以下步驟； (1)將西紅柿的莖經(jīng)過(guò)0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后切成I厘米長(zhǎng)的莖段并從中間縱向剖開(kāi)； (2)將上述處理后的莖段放置在含有萘乙酸與6-芐氨基腺嘌呤的通用MS培養(yǎng)基上，25 °C黑暗下培養(yǎng)； (3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到含有萘乙酸與6-芐氨基腺嘌呤的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。
2.如權(quán)利要求1中所述的西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中MS培養(yǎng)基上含有0.2-2.0mg.η萘乙酸與0.1-2.0mg.^6-芐氨基腺嘌呤。
3.如權(quán)利要求2中所述的西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.η, 6-節(jié)氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.卜1。
4.如權(quán)利要求1中所述的西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)中MS培養(yǎng)基上含有0.2-2.0mg.η萘乙酸與0.1-2.0mg.^6-芐氨基腺嘌呤。
5.如權(quán)利要求4中所述的西紅柿干細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，其特征在于:萘乙酸的含量?jī)?yōu)選0.5mg.η, 6-節(jié)氨基腺嘌呤的含量?jī)?yōu)選1.0mg.卜1。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103667171SQ201210336263
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】亓琴 申請(qǐng)人:鷺港生物藥業(yè)有限公司