專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有NusA蛋白融合標(biāo)簽的快速克隆及表達(dá)質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，即一種含有NusA蛋白融合標(biāo)簽的快速克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的克隆方法是通過(guò)將質(zhì)粒載體同目的基因片段分別用相同的雙酶切消化后產(chǎn)生2-4個(gè)堿基的粘性末端，利用連接酶將互補(bǔ)的粘性末端進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，表達(dá)純化蛋白。由于粘性末端長(zhǎng)度比較短，后續(xù)必須通過(guò)T4DNA連接酶將載體和目的基因片段進(jìn)行連接，并且在此過(guò)程中可能會(huì)有部分載體發(fā)生自連接。這種方法克隆基因大約需要兩到三天時(shí)間。為了實(shí)現(xiàn)不依賴(lài)于連接酶的克隆方法，就需要構(gòu)建一種更加方便有效的克隆載體。而且，目前市場(chǎng)上的商品化載體能夠利用的融合標(biāo)簽也非常有限，將載體上 設(shè)計(jì)的將目的蛋白同標(biāo)簽分離的蛋白酶價(jià)格也都比較昂貴?；谏鲜鰩追矫娴目紤]，有必要提供一種帶有常用的融合蛋白標(biāo)簽的快速克隆及蛋白表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，即一種在N端含有NusA融合蛋白標(biāo)簽并且能夠?qū)⒛康牡鞍椎幕蜻M(jìn)行快速克隆及蛋白表達(dá)的載體，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的所述的質(zhì)粒載體，包含有一段含有TEV酶識(shí)別位點(diǎn)的，用于編碼NusA蛋白的基因序列；兩側(cè)帶有BsaI酶切位點(diǎn)的GFP基因片段。上述的NusA蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO: I。上述的兩側(cè)帶有BsaI酶切位點(diǎn)的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明的載體，還包括有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列和復(fù)制子片段。本發(fā)明的載體，其遺傳圖譜如圖I所示,核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體用于在大腸桿菌中高效表達(dá)重組蛋白。本發(fā)明構(gòu)建的載體可以在不依賴(lài)于連接酶的情況下實(shí)現(xiàn)目的基因的快速高效克隆及蛋白表達(dá)。并且在載體中引入了 NusA融合蛋白標(biāo)簽和TEV酶切位點(diǎn)，NusA融合蛋白標(biāo)簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分離純化；TEV酶識(shí)別序列位于NusA蛋白的基因序列的下游，通過(guò)TEV酶對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，可以將NusA蛋白標(biāo)簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經(jīng)濟(jì)適用的酶，從而極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。


圖I :本發(fā)明的質(zhì)粒載體PJM-NusA的遺傳圖譜；圖2 :重組蛋白PJM-NusA的表達(dá)純化蛋白圖譜；
其中M、PageRuler PrestainedProtein Ladder ;1、誘導(dǎo)前 BL21/pJM_NusA 的總蛋白；2、誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解并離心后的上清部分；3、誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解并離心后的沉淀部分；4、親和層析流穿液；5、20mM咪唑洗滌液；6、200mM咪唑洗脫液。
具體實(shí)施方式

本發(fā)明的載體以pET_24d為出發(fā)質(zhì)粒，在構(gòu)建過(guò)程中，分別加入了用于編碼NusA蛋白的基因序列，TEV酶切位點(diǎn)以及GFP基因。在GFP基因兩側(cè)各引入了一個(gè)BsaI單酶切位點(diǎn)。一方面，通過(guò)BsaI單酶切，該載體被線性化并在線性化的片段兩側(cè)各產(chǎn)生5'端突出的4個(gè)堿基的粘性末端，通過(guò)T4DNAP0lymeraSe及dTTP處理后，粘性末端的堿基數(shù)各增加至10個(gè)和12個(gè)，利用該粘性末端，能夠方便快速將的目的基因克隆到該載體上并進(jìn)行蛋白的表達(dá)純化。另一方面，為了更快，更方便的控制克隆質(zhì)量，在克隆的酶切位點(diǎn)BsaI位點(diǎn)中間插入的GFP基因，在后續(xù)篩選陽(yáng)性克隆的過(guò)程中，能夠通過(guò)觀察是否產(chǎn)生綠色熒光，來(lái)判斷克隆基因是否插入到載體當(dāng)中。下面對(duì)本發(fā)明的載體構(gòu)建過(guò)程及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。一、表達(dá)質(zhì)粒載體(PJM-NusA)的構(gòu)建第一步，在pET_24d (購(gòu)買(mǎi)自Novogen公司，編號(hào)69772-3)的多克隆位點(diǎn)的N端加上his-Tag-NusA標(biāo)簽及TEV酶切位點(diǎn)。首先全序列合成his-tag-NusA-TEV，合成時(shí)在his-tag-NusA-TEV核酸序列的兩端分別加上XbaI和NcoI的酶切位點(diǎn)，再連接到克隆載體上(其中his-tag-NusA-TEV序列為SEQ ID NO: I)。制備的克隆質(zhì)粒用XbaI和NcoI雙酶切后得到包含有his-Tag-NusA標(biāo)簽的小片段，與pET_24d經(jīng)過(guò)XbaI和NcoI雙酶切處理得到的載體進(jìn)行連接，通過(guò)篩選得到N端帶有his-Tag-NusA標(biāo)簽及TEV酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒，命名為 pET-24d-NusA。第二步，將兩個(gè)BsaI酶切位點(diǎn)引入上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-24d_NuSA當(dāng)中，取代其中的多克隆位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物引物合成時(shí)要求5’端經(jīng)過(guò)磷酸化修飾上游引物5’ -GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3 ’下游引物5’ -CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3 ’以pET-24d_NusA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后利用T4連接酶連接，篩選得到帶有BsaI酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒pET-24d-NusA-2BsaI。第三步，根據(jù)GFP蛋白(SEQ ID NO: 2)的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆載體上。制備的克隆載體用BsaI酶切處理后得到的包含GFP的片段，與PET-24d-NusA-2BsaI經(jīng)過(guò)BsaI酶切處理后的載體進(jìn)行連接，得到最終的質(zhì)粒pJM_NusA。制備的質(zhì)粒pJM-NusA的遺傳圖譜如圖I所示，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3。二、本發(fā)明質(zhì)粒的應(yīng)用效果檢測(cè)本發(fā)明提供的質(zhì)粒載體在其GFP基因外側(cè)各包含一個(gè)BsaI的酶切位點(diǎn)(黑體表示)，該載體經(jīng)BsaI單酶切去除GFP基因后，載體被線性化，并且在線性化的片段兩側(cè)各產(chǎn)生5’端突出的4個(gè)堿基的粘性末端。BsaI酶切后的載體經(jīng)過(guò)T4DNA polymerse和dTTP處理，利用T4DNA polymerse的3' — 5'外切酶活性，可以去除3'端堿基直到遇到T終止，由此質(zhì)粒載體被線性化并且兩端的粘性末端堿基數(shù)目增加至10個(gè)和12個(gè)。該粘性末端可以在不依賴(lài)于連接酶的情況下同互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性的退火。
權(quán)利要求
1.一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于所述的質(zhì)粒載體包含有 O 一段含有TEV酶識(shí)別位點(diǎn)的，用于編碼NusA蛋白的基因片段； 2)兩側(cè)帶有BsaI酶切位點(diǎn)的GFP基因片段。
2.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的編碼NusA蛋白的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:I。
3.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的兩側(cè)帶有BsaI酶切位點(diǎn)的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的質(zhì)粒載體還包括有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列和復(fù)制子片段。
5.權(quán)利要求I所述的載體，其遺傳圖譜如圖I所示。
6.權(quán)利要求I所述的載體，其核苷酸序列為SEQID N0:3。
7.權(quán)利要求I所述的載體用于在原核菌中表達(dá)重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，包含有一段含有TEV酶識(shí)別位點(diǎn)的，用于編碼NusA蛋白的基因序列和兩側(cè)帶有BsaI酶切位點(diǎn)的GFP基因片段。本發(fā)明構(gòu)建的載體可以在不依賴(lài)于連接酶的情況下實(shí)現(xiàn)目的基因的快速高效克隆及蛋白表達(dá)。并且在載體中引入了NusA融合蛋白標(biāo)簽和TEV酶切位點(diǎn)，NusA融合蛋白標(biāo)簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分離純化；TEV酶識(shí)別序列位于NusA蛋白的基因序列的下游，通過(guò)TEV酶對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，可以將NusA蛋白標(biāo)簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經(jīng)濟(jì)適用的酶，從而極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102876701SQ201210336690
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者鄒培建, 蓋園明, 王鵬舉, 景小飛 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所