專(zhuān)利名稱(chēng)：焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β1受體基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的是涉及焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
β I腎上腺素受體阻斷藥是能選擇性地與β I腎上腺素受體結(jié)合、從而拮抗神經(jīng)遞質(zhì)和兒茶酚胺對(duì)β受體的激動(dòng)作用的一種藥物類(lèi)型，臨床常用的心血管藥物如阿替洛爾(氨酰心安)、美托洛爾(美多心安)、比索洛爾等均屬于此類(lèi)。美托洛爾在臨床上廣泛用于治療心絞痛、心律失常、高血壓、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、嗜鉻細(xì)胞瘤、心肌梗塞，其血藥濃度療效具有顯著的個(gè)體差異大。β I腎上腺素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，它們以腎上腺素和去甲腎上腺素 為內(nèi)源性配體，與Gs偶聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和L型Ca2+通道的開(kāi)放頻率，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能。Ser49Gly與Gly389Arg多態(tài)性影響β 腎上腺素受體功能，從而影響美托洛爾等藥物治療高血壓的療效和不良反應(yīng)的發(fā)生情況(Clin Pharmacol Ther 2003;73:366-71)。中國(guó)人群中4949Gly和389Arg的發(fā)生頻率分別為16. 2%和76. 4%，此類(lèi)患者對(duì)β I腎上腺素阻斷藥物更為敏感，療效相對(duì)較好。查明患者β I腎上腺受體的基因型，確定患者對(duì)美托洛爾的敏感性，根據(jù)患者β I腎上腺受體基因不同單倍型調(diào)整劑量，對(duì)于不能耐受的患者，建議換藥。研究結(jié)果表明，高血壓病人收縮壓與舒張壓的降低均與腎上腺素受體單倍型相t匕，49Ser389Arg / 49Ser389Arg 與 49Ser389Arg / 49Gly389Arg 單倍型的患者對(duì)美托洛爾的反應(yīng)良好，而 49Ser389Gly / 49Gly389Arg 和 49Ser389Gly / 49Ser389Gly 單倍型患者對(duì)美托洛爾治療無(wú)降壓效應(yīng)。這一結(jié)果揭示，腎上腺素受體單倍型可作為美托洛爾抗高血壓療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)(Clin Pharmacol Ther 2006;80:23-32)。開(kāi)發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的試劑盒將為其底物藥的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。焦磷酸測(cè)序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β I受體(SEQ ID NO. I)多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)其底物β I受體阻斷藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物(I)擴(kuò)增引物:
上游引物5/-TCA ACT GGC TGG GCT ACG C_3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記；(2)測(cè)序引物5/ -GCA AGG CCT TCC AG-3' (SEQ ID NO. 4)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑。一種應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟(I) DNA 提取；(2)聚合酶鏈反應(yīng)配制50μ I PCR擴(kuò)增體系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物1·5μ 1，下游引物 1·5μ l，rTaq0.5y 1，水 35·5μ 1，模板 2·0μ I ;循環(huán)程序?yàn)?95。C 5min預(yù)變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴(kuò)增產(chǎn)物；( 3 )焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。本發(fā)明的試劑盒對(duì)β I受體RS1801253目標(biāo)序列進(jìn)行分析和檢測(cè)，該目標(biāo)序列包括野生型 CCGCAAGGCCTTCCAGCGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 5)和突變型 CCGCAAGGCCTTCCAGGGACTGCTCTGCTGCGCGCGCA (SEQ ID NO. 6)。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)β I受體基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床上β I受體阻斷藥個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明β I受體(rsl801253)突變雜合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果；圖2為本發(fā)明β I受體(rsl801253)突變純合子焦磷酸測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :β 受體-pyroF (上游引物)5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3/ (SEQ IDNO. 2)；β I 受體-pyroR (下游引物):5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3' (SEQ ID NO. 3)；測(cè)序引物5'-GCAAGG CCT TCCAG-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識(shí)處打勾V ； (2)異丙醇(如無(wú)，可用無(wú)水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類(lèi)移液槍頭。
I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；I. 3在I. 5mL Eppendorf管對(duì)應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識(shí)做好標(biāo)記；I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 蓋上 Eppendorf 管蓋，室溫孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室溫離心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；I. 9開(kāi)Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；I. 12 打開(kāi) Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見(jiàn)白色絮狀gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 16打開(kāi)Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；I. 1813, OOOrpm 室溫離心 Imin ；I. 19打開(kāi)Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；I. 20在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開(kāi)蓋側(cè)放風(fēng)干；I. 21 目測(cè)沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22過(guò)夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號(hào)，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；I. 24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；2.聚合酶鏈反應(yīng)2. I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 μ I PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物 上游引物5' -TCA ACT GGC TGG GCT ACG C-3'； 下游引物5' -TCT CCG TGG GTC GCG TG-3'； 其中，下游引物的5'進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2)測(cè)序引物5'-GCA AGG CCT TCC AG-3'。
2.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測(cè)β I受體基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提?。? (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 μ I PCR 擴(kuò)增體系，包含10XPCRbuffer 5. O μ I, dNTP 4. O μ 1，上游引物I. 5μ 1，下游引物 I. 5 μ l,rTaqO. 5 μ I,/Jc 35. 5μ 1，模板 2. O μ I ;循環(huán)程序?yàn)?5° C 5min預(yù)變性；依次在95° C 30S，50° C 30S，72° C 30S，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72° C保持5min，最終保持在4° C，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)β1受體基因多態(tài)性的試劑盒及方法。所述試劑盒β1受體基因多態(tài)性進(jìn)行檢查，具體是指rs1801253單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量β1受體基因多態(tài)性的檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)其底物實(shí)現(xiàn)安全合理有效的個(gè)體化給藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876785SQ20121033876
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月13日
發(fā)明者周宏灝 申請(qǐng)人:周宏灝