專利名稱：一種鑒別肺癌亞型的microRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺癌亞型的診斷，具體地說，涉及鑒別肺癌亞型的microRNA標(biāo)志物及該microRNA的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺癌已成為目前世界上病死率第一位的惡性腫瘤，2011年世界衛(wèi)生組織最新資料顯示，2008年全球約有160萬肺癌新患者，約有140萬肺癌患者死亡。在肺癌患者中，小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCL C)約占 15%,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer, NSCLC)約占 80%, NSCLC 主要包括腺癌(adenocarcinoma lung cancer, AC)及鱗癌(squamous cell lung cancer, SQ)兩大類型。肺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，即便早期(pla-plb)肺癌經(jīng)手術(shù)及放化療治療后的5年復(fù)發(fā)率仍然高達(dá)40%，而大部分患者(約75%)就診時(shí)已處于中晚期，已失去了外科手術(shù)及多學(xué)科根治的最佳時(shí)機(jī)，極易復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，I-IV期患者總體5年生存率僅約10%。造成這種狀況的主要原因是缺乏有效的肺癌早期診斷及早期治療的方法。肺癌治療已進(jìn)入個(gè)體化時(shí)代，不同亞型、不同分期的肺癌治療方案不同。SCLC早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，首選治療方案為全身化療聯(lián)合放療，而非手術(shù)切除。根治性手術(shù)是SQ及AC的首選治療方法，輔助以放化療。分子靶向治療被認(rèn)為是特異性最高的肺癌個(gè)體化治療手段，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)絡(luò)氨酸激酶抑制劑僅對EGFR突變的肺腺癌患者有效，SQ對培美曲賽治療效果不如AC，用貝伐單抗治療可引起致命的大出血。因此，準(zhǔn)確的肺癌病理分型對肺癌患者靶向治療方案的選擇至關(guān)重要，研究肺癌腫瘤標(biāo)志物，并準(zhǔn)確的對肺癌進(jìn)行分子分型，進(jìn)而正確指導(dǎo)靶向治療顯得尤為迫切，并將會帶來巨大的社會效益及經(jīng)濟(jì)效益。microRNA (miRNA)是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大小為20-25個(gè)核苷酸(nt),這些小的microRNA通常祀向一個(gè)或者多個(gè)mRNA,通過翻譯水平的抑制或斷裂革巴標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。它們大約在10年前被發(fā)現(xiàn)，已被認(rèn)為在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用(Bartel, D. P. (2004) Cell 116，281-297，Ambros, V. (2004)Nature 431, 350-355 ；He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5, 522-531)。 microRNA比mRNA在作為腫瘤生物標(biāo)志物方面具有更大的優(yōu)勢，因?yàn)樗鼈冊隗w外非常穩(wěn)定(Lu，J. etal., (2005) Nature 435, 834-838; Lim, L. P. et al., (2005) Nature 433, 769-773)。microRNA 是從初級轉(zhuǎn)錄物(pri-microRNA)產(chǎn)生的，pri-microRNA 被 RNase IIIDrosha加工為含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的前體microRNA(pre-microRNA)。接著，在Dicer(—種RNaseIII)的作用下，發(fā)夾狀的pre-microRNA在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步被切割產(chǎn)生成熟的microRNA,這些成熟的microRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成microRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體(miRNP)。microRNA引導(dǎo)miRNP到達(dá)它們的靶mRNA，在此它們發(fā)揮各自的功能(參見綜述例如Bartel，D. P.(2004) Cell 23, 281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5,522-531)。
根據(jù)microRNA與其祀mRNA之間的互補(bǔ)性程度,microRNA可以指導(dǎo)不同的調(diào)節(jié)過程。那些與microRNA高度互補(bǔ)的靶mRNA通過與RNA干擾(RNAi)相同的機(jī)制被特異降解。因此，在這種情況下，microRNA是擔(dān)當(dāng)小干擾RNA (siRNA)的角色；與microRNA互補(bǔ)性較低的靶mRNA被引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞降解途徑，或者在蛋白質(zhì)翻譯上平上被阻遏而mRNA水平不受影響。高通量microRNA定量技術(shù)如microRNA微陣列，是以實(shí)時(shí)定量PCR為基礎(chǔ)的miCToRNA檢測，為研究癌癥基因組中miCToRNA的表達(dá)譜提供了有力的工具?？色@得的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明miciORNA表達(dá)失調(diào)可能與某種癌癥的發(fā)生和/或發(fā)展相關(guān)。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-l均定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遺傳基因座上，在大約70%的CLL患者中,這兩種microRNA基因缺失或下調(diào)。另外,在結(jié)腸癌中has-miR-143 及has-miR-145表達(dá)下調(diào)；而microRNA let-7的表達(dá)在肺癌中經(jīng)常降低(Michael, Μ. Ζ.et al. (2003) Mol Cancer Res I, 882-891; Mayr, C. et al. (2007) Science 315,1576-1579)。事實(shí)上，常見癌癥經(jīng)常存在相關(guān)microRNA表達(dá)改變，而且microRNA通常定位于與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域，因此可以推測miCToRNA可能發(fā)揮著抑癌基因和癌基因的雙重作用(Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J (2006) Nat Rev Cancer 6, 259-269 ；Calin, G. A. and Croce, C. M. (2007) JClin Invest 117，2059-2066 ；Blenkiron, C.and Miska, E. A. (2007) Hum Mol Genet 16, R106-R113)。已證實(shí)的 microRNA 在人類癌癥中的異常表達(dá)更突出了它們作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值。近年來對肺癌組織的研究表明，在肺癌中約有70個(gè)microRNA表達(dá)異常。但上述前人的結(jié)果都是從未經(jīng)純化肺癌組織的混合細(xì)胞中獲得的，其雜交信號可以來自肺癌細(xì)胞，也可以來自肺癌組織中的炎癥細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞甚至正常肺組織細(xì)胞，而這些非目的細(xì)胞的比例在不同肺癌組織中可以存在很大的差異，從而造成了結(jié)果的不可靠。王漱陽和朱虹光等人發(fā)現(xiàn)，整塊腫瘤組織的microRNA表達(dá)譜與被顯微切割下來的純凈癌細(xì)胞有所不同。因此，只有從純凈的靶細(xì)胞中檢測得到的microRNA表達(dá)，才能正確反映特異性細(xì)胞在體內(nèi)的表達(dá)情況，并可能成為可靠的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。而目前從肺癌組織中分離純凈的靶細(xì)胞獲得的能夠準(zhǔn)確診斷肺癌亞型的microRNA報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種鑒別肺癌亞型的miCToRNA。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種上述microRNA的用途。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種基于上述microRNA的鑒別肺癌亞型的試劑盒。本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種鑒別肺癌亞型的microRNA集。本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供一種上述HiiCT0RNA集的用途。本發(fā)明的第六個(gè)目的是，提供一種基于上述microRNA集的鑒別肺癌亞型的試劑盒。本發(fā)明的第七個(gè)目的是，提供一種鑒別肺癌亞型的microRNA芯片。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種鑒別肺癌亞型的microRNA,所述的microRNA選自
a)序列如SEQ ID No. η所示的microRNA，其中η為2，3，4或7 ;或b)與SEQ ID No. η所不序列互補(bǔ)的microRNA。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
如上所述的鑒別肺癌亞型的microRNA在制備鑒別肺癌亞型的試劑中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種鑒別肺癌亞型的試劑盒，所述的試劑盒中含有如上所述的鑒別肺癌亞型的microRNA。為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種鑒別肺癌亞型的microRNA集，所述的集至少包含下列中的一種
a)包含序列如SEQ ID No. 3所示的microRNA和序列如SEQ ID No. 4所示的microRNA 的集；
b)包含序列如SEQ ID No. 2所不的microRNA和序列如SEQ ID No. 7所不的microRNA的集。為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
如上所述的鑒別肺癌亞型的microRNA集在制備鑒別肺癌亞型的試劑中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述第六個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種鑒別肺癌亞型的試劑盒，所述的試劑盒中含有如上所述的鑒別肺癌亞型的microRNA 集。為實(shí)現(xiàn)上述第七個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種鑒別肺癌亞型的microRNA芯片，所述的microRNA芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應(yīng)于SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和/或SEQ ID No. 7所示的部分或全部序列。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、提供了可用于鑒別診斷肺癌亞型的四種microRNA,該四種microRNA可構(gòu)成兩個(gè)組合SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，可分別用于鑒別診斷小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌、腺癌與鱗癌；
2、四種microRNA是從采用激光捕獲顯微分離系統(tǒng)從鱗癌、腺癌及小細(xì)胞癌組織中分離純凈的癌細(xì)胞，運(yùn)用Agilent芯片技術(shù)進(jìn)行全基因組microRNA差異表達(dá)分析篩選獲得的，能更加準(zhǔn)確地反應(yīng)不同亞型肺癌細(xì)胞中的microRNA的表達(dá)譜，更加準(zhǔn)確地顯示肺癌的microRNA分子表型。且該四種microRNA經(jīng)獨(dú)立驗(yàn)證,證實(shí)其診斷小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌、腺癌與鱗癌結(jié)果準(zhǔn)確可靠，有利于快速、準(zhǔn)確、低成本的鑒別診斷肺癌亞型以對患者進(jìn)行準(zhǔn)確的靶向治療，可制備成診斷芯片或試劑盒，具有廣闊的應(yīng)用前景。


附圖I是石蠟包埋手術(shù)切除肺組織的ROC曲線分析。A :手術(shù)訓(xùn)練樣本中microRNA組合A鑒別SCLC與NSCLC的AUC估算；B :手術(shù)訓(xùn)練樣本中microRNA組合B鑒別SQ與AC的AUC估算。附圖2是石蠟包埋手術(shù)切除肺組織的ROC曲線分析。A :手術(shù)確認(rèn)樣本中microRNA組合A鑒別SCLC與NSCLC的AUC估算；B :手術(shù)確認(rèn)樣本中microRNA組合B鑒別SQ與AC的AUC估算。
附圖3是支氣管活檢樣本的ROC曲線分析。A :支氣管活檢樣本中microRNA組合A鑒別SCLC與NSCLC的AUC估算；B :支氣管活檢樣本中microRNA組合B鑒別SQ與AC的AUC估算。附圖4是支氣管刷檢樣本的ROC曲線分析。A :支氣管刷檢樣本中microRNA組合A鑒別SCLC與NSCLC的AUC估算；B :支氣管刷檢樣本中microRNA組合B鑒別SQ與AC的AUC估算。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例I microRNA的篩選獲取和獨(dú)立驗(yàn)證 總體實(shí)驗(yàn)方案如下
通過收集2008年8月至2011年12月間中山醫(yī)院586例肺癌組織或脫落細(xì)胞樣本，每例均由兩名有經(jīng)驗(yàn)的肺癌病理學(xué)家審核，586份樣本被分配至五組之一，其中各組病例獨(dú)立
不重疊。I.發(fā)現(xiàn)組采用激光捕獲顯微分離技術(shù)從82例(36例AC、30例SQ與16例SCLC)獨(dú)立冷凍組織中提取癌細(xì)胞作微陣列研究，得到用于肺癌分型的候選miCToRNA，并進(jìn)一步經(jīng)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)證實(shí)其價(jià)值。2.訓(xùn)練組人工分離85份石蠟包埋的肺部組織(29例AC、24例SQ與32例SCLC)以確保癌細(xì)胞> 75%。85份手術(shù)訓(xùn)練樣本經(jīng)定量RT-PCR后根據(jù)Logistic回歸模型分別構(gòu)建SCLC與NSCLC和SQ與AC鑒別診斷的microRNA組合。3.驗(yàn)證組人工分離68份石蠟包埋的肺部組織(24例AC、21例SQ與23例SCLC)以確保癌細(xì)胞> 75%。68份手術(shù)確認(rèn)樣本經(jīng)RT-PCR證實(shí)microRNA組合的診斷價(jià)值。4.應(yīng)用組A :從疑似肺癌病人與接受纖維支氣管鏡檢查的病人中獲取支氣管活檢樣本144例(48例AC、48例SQ與48例SCLC)。支氣管鏡活檢診斷結(jié)果均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富病理學(xué)家審核。定量RT-PCR用以證實(shí)兩個(gè)microRNA組合的診斷價(jià)值。5.應(yīng)用組B :從疑似肺癌病人與接受纖維支氣管鏡檢查的病人中獲取支氣管刷檢樣本207份(85例AC、69例SQ與53例SCLC)。顯微鏡檢測癌細(xì)胞后排除未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的纖維支氣管鏡病人。為確保準(zhǔn)確性與公正性，肺癌分型由上海腫瘤醫(yī)院與中山醫(yī)院兩位細(xì)胞病理學(xué)家進(jìn)行，兩人分別有十年以上細(xì)胞學(xué)診斷經(jīng)歷。腫瘤分型經(jīng)纖維支氣管鏡活檢樣本或手術(shù)樣本的組織學(xué)診斷確認(rèn)。定量RT-PCR用以證實(shí)兩個(gè)microRNA組合的診斷價(jià)值。具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下
一、發(fā)現(xiàn)組獲取用于肺癌分型的候選microRNA
I實(shí)驗(yàn)方法
I.I Agilent芯片實(shí)驗(yàn)
I.I. I樣品RNA的放大和標(biāo)記
提取癌細(xì)胞總RNA,總RNA采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒，Low Input QuickAmp Labeling Kit, One-Color (Cat#5190-2305, Agilent technologies, Santa Clara,CA, US)和標(biāo)準(zhǔn)操作流程對樣品總RNA中的mRNA進(jìn)行放大和標(biāo)記，并用RNeasy mini kit(Cat#74106, QIAGEN, GmBH, Germany)純化標(biāo)記后的 cRNA。
I. 2. 2芯片雜交
按照Agilent表達(dá)譜芯片配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和配套試劑盒，Gene ExpressionHybridization Kit(Cat#5188-5242, Agilent technologies, Santa Clara, CA， US)，在滾動雜交爐(Hybridization Oven, Cat#G2545A, Agilent technologies, Santa Clara,CA，US)中65*€，lOrpm，滾動雜交17小時(shí)，雜交cRNA上樣量600ng，并在洗缸(stainingdishes, Cat#121, Thermo Shandonj Waltham, MAj US)中洗片，洗片所用的試劑為 GeneExpression Wash Buffer Kit (Cat#5188_5327， Agilent technologies, Santa Clara,CA，US)。I. I. 3芯片掃描
完成雜交的芯片米用 Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA, Agilenttechnologies, Santa Clara, CA，US)進(jìn)行掃描，軟件設(shè)置 Dye channel: Green,Scan resolution=3μ m，20bito 用 Feature Extraction software 10. 7 (Agilent·technologies, Santa Clara, CA，US)讀取數(shù)據(jù)，最后米用 Gene Spring Software11.0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)進(jìn)行歸一化處理，所用的算法為Quantile01. I. 4芯片信號的檢測與分析
上述微陣列的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析米用分類器PAM (Prediction Analysis of Microarray，可參見文獻(xiàn)Tibshirani R et al (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:6567-6572)和分類器WEKACWaikato Environment for Knowledge Analysis，可參見文獻(xiàn)Frank E et al (2004)Bioinformatics 20:2479-2481)以選取子集及構(gòu)建分類模型。候選microRNA的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析米用 Unpaired Unequal Variance t-test with Benjamini-Hochberg Correction 以分析是否存在可鑒別SCLC與NSCLC和SQ與AC的miciORNA差異性表達(dá)，得到用于肺癌分型的 microRNA。I. 2定量RT-PCR反應(yīng)驗(yàn)證 1.2. I RNA提取和純化
米用 TRIZOL Reagent (Cat#15596_018，Life technologies, Carlsbad, CA，US)，并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的總RNA抽提，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)電泳質(zhì)檢后使用 RNeasy mini kit (Cat#74106, QIAGENj GmBHj Germany)和 RNase-Free DNase Set(Cat#79254, QIAGENj GmBHj Germany)，純化總 RNA。1.2.2內(nèi)參基因及引物
內(nèi)參基因選用小 RNA U47，U47 和 7 個(gè)候選 microRNA (has-miR-25、has-miR-205、has-miR-375、has_miR-29a、has_miR-29b、has_miR-27a、has_miR-34a)的基因的引物均向ABI公司訂做購買成品。引物序列如下
權(quán)利要求
1.一種鑒別肺癌亞型的microRNA,其特征在于,所述的microRNA選自 a)序列如SEQID No. η所示的microRNA，其中η為2，3，4或7 ;或 b)與SEQID No. η所不序列互補(bǔ)的microRNA。
2.權(quán)利要求I所述的microRNA在制備鑒別肺癌亞型的試劑中的用途。
3.一種鑒別肺癌亞型的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權(quán)利要求I所述的microRNAο
4.一種鑒別肺癌亞型的microRNA集，其特征在于，所述的集至少包含下列中的一種a)包含序列如SEQ ID No. 3所示的microRNA和序列如SEQ ID No. 4所示的microRNA 的集； b)包含序列如SEQ ID No. 2所不的microRNA和序列如SEQ ID No. 7所不的microRNA的集。
5.權(quán)利要求4所述的microRNA集在制備鑒別肺癌亞型的試劑中的用途。
6.一種鑒別肺癌亞型的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權(quán)利要求4所述的microRNA 集。
7.一種鑒別肺癌亞型的microRNA芯片,其特征在于,所述的microRNA芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性的對應(yīng)于SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和/或SEQ ID No. 7所示的部分或全部序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒別肺癌亞型的microRNA，所述的microRNA選自a)序列如SEQ ID No.n所示的microRNA，其中n為2，3，4或7；或b)與SEQ ID No.n所示序列互補(bǔ)的microRNA。本發(fā)明還提供了上述microRNA的用途和基于上述microRNA的試劑盒。本發(fā)明另提供了由上述microRNA組成的集、該集的用途和基于該集的試劑盒。其優(yōu)點(diǎn)在于上述microRNA可構(gòu)成兩個(gè)組合SEQ ID No.2和SEQ ID No.7、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，可分別用于鑒別診斷小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌與肺鱗癌，且診斷速度快、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為肺癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確的靶向治療提供了重要依據(jù)。
文檔編號C12N15/113GK102839179SQ201210338988
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者盧韶華, 白春學(xué), 黃威, 侯英勇, 吳瑩, 朱虹光 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院