專利名稱：一種hiv-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種Hiv-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法。
背景技術(shù)：
以整合酶為靶點(diǎn)的HIV-I抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)整合酶3'加工活性的抑制劑在體內(nèi)抗HIV-I活性較差，而針對(duì)整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性的抑制劑具有較好的體內(nèi)抗HIV-I活性，故整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性的抑制被認(rèn)為是抑制劑在體內(nèi)發(fā)揮抗HIV-I活性 的關(guān)鍵(Hazuda DJ, Felock P, Witmer M, Wolfe A, Stillmock K, Grobler JA, EspesethA,Gabryelski L，Schleif W，Blau C，Miller MD. Inhibitors of strand transfer thatprevent integration and inhibit HIV-I replication in cells.Science, 2000, 287(5453):646-650)。目前HIV-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法主要有以下兩大類I、放射自顯影方法Chow根據(jù)整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)中病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA的序列，合成了 4條單鏈DNA，在其中一條鏈或者兩條鏈的末端標(biāo)記放射性同位素32P。4條單鏈DNA退火后形成供體DNA和靶DNA，在整合酶的作用下發(fā)生鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，能夠生成一系列特定長(zhǎng)度的帶有32P標(biāo)記的DNA，可以通過(guò)放射自顯影進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性或待測(cè)樣品的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)(Chow SA. In vitro assays for activities of retroviralintegrase. Methods:A Companion to Methods in Enzymology, 1997，12(4):306-317)。該方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣、通量低、對(duì)檢測(cè)設(shè)備及人員要求較高、易產(chǎn)生放射性污染、成本高。2、酶聯(lián)免疫吸附方法Hazuda等人報(bào)道了一種有代表性的酶聯(lián)免疫吸附方法。該方法是將供體DNA的一個(gè)5'端進(jìn)行磷酸化標(biāo)記，在靶DNA的兩個(gè)3'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；通過(guò)碳二亞胺介導(dǎo)供體DNA的5 /磷酸與微孔板表面的仲氨基連接，將供體DNA包被于微孔板上；在整合酶的作用下，供體DNA插入靶DNA中，從而將生物素基團(tuán)連接于微孔板上；洗板后，用堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)生物素基團(tuán)，并利用堿性磷酸酶的特異性顯色反應(yīng)讀取信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性或待測(cè)樣品的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)(Hazuda DJ, HastingsJC, Wolfe AL, Emini EA. A novel assay for the DNA strand-transfer reaction ofHIV-I integrase. Nucleic Acids Research, 1994，22 (6) : 1121-1122)。該方法的缺點(diǎn)是需要包被和封閉微孔板，耗時(shí)長(zhǎng)；需要使用特殊的微孔板，成本較高。He等人用磁珠吸附DNA技術(shù)對(duì)此類方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了磁珠式HIV-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法這種方法是用鏈親和素磁珠捕獲生物素標(biāo)記的供體DNA,在整合酶的作用下，供體DNA插入地高辛標(biāo)記的靶DNA中，從而將地高辛基團(tuán)連接于微孔板上；洗板后，用堿性磷酸酶或熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗地高辛抗體檢測(cè)地高辛基團(tuán)，并利用堿性磷酸酶的特異性顯色反應(yīng)讀取信號(hào)或直接讀取熒光基團(tuán)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性或待測(cè)樣品的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)(He HQ, Ma XH, Liu B, Chen WZ, Wang CX, ChengSH. A novel high-throughput format assay for HIV-Iintegrase strand transferreaction using magnetic beads. Acta Pharmacologica Sinica，2008，29(3):397-404)。該方法的缺點(diǎn)是顯色反應(yīng)步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡(jiǎn)單、快速且成本低廉的HIV-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法。本發(fā)明所提供的一種Hiv-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法，包括以下步驟(I)HIV-I整合酶蛋白及待測(cè)化合物樣品的制備采用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)并純化HIV-I整合酶蛋白，分裝保存待用，室溫下將待測(cè)化合物樣品用二甲亞砜配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶解后備用；(2)供體DNA與靶DNA的制備用滅菌雙蒸水分別溶解單鏈DNA1、單鏈DNA2、單鏈DNA3、單鏈DNA4，將單鏈DNAl與單鏈DNA2于避光環(huán)境中分別按照等摩爾濃度混勻，于95°C水浴中煮沸3min變性，再緩慢冷卻至室溫，即退火形成供體DNA，將單鏈DNA3與單鏈DNA4于避光環(huán)境中分別按照等摩爾·濃度混勻，于95°C水浴中煮沸3min變性，再緩慢冷卻至室溫，即退火形成靶DNA，單鏈DNA1、單鏈DNA2、單鏈DNA3、單鏈DNA4的序列如下單鏈DNAl j’-ACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-S'，其中 5’ 端標(biāo)記生物素
基團(tuán)，單鏈DNA2 :5’ -ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTAAAAG-3'，單鏈DNA3 :5’ -ATGTGGAAAATCTCTAGCGAT-3’，其中3’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)基團(tuán)，單鏈DNA4 :5，-ATCGCTAGAGATTTTCCACAT-3，；(3)待測(cè)化合物樣品的篩選反應(yīng)在96孔微孔板上進(jìn)行，微孔板設(shè)陰性對(duì)照3孔，每孔分別加入5 μ I 二甲亞砜，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照3孔，每孔分別加入5 μ I 二甲亞砜，但其后所加蛋白為SOOng高溫變性后的整合酶蛋白，其他孔中每孔分別加入5μ I不同濃度的待測(cè)化合物樣品，除陽(yáng)性對(duì)照孔外，每孔均分別加入800ng整合酶蛋白，于37°C孵育20min,再加入I. 5pmol供體DNA和15pmol靶DNA，加入滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積50 μ 1，混勻后于37°C孵育lh，再加入10mg/ml的鏈霉親和素磁珠I. 5 μ I和51. 5 μ I磁珠結(jié)合緩沖液，徹底振蕩混勻后于20°C孵育15min，將微孔板置于板式磁珠收集器靜置90s，棄上清，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗磁珠三次，最后用熒光分析儀檢測(cè)每孔的相對(duì)熒光值(RFU)，并計(jì)算待測(cè)樣品的抑制率。按照以下公式計(jì)算待測(cè)樣品的抑制率
權(quán)利要求
1. 一種HIV-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法，其特征在于包括以下步驟 (1)HIV-I整合酶蛋白及待測(cè)化合物樣品的制備 采用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)并純化HIV-I整合酶蛋白，分裝保存待用，室溫下將待測(cè)化合物樣品用二甲亞砜配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶解后備用； (2)供體DNA與靶DNA的制備 用滅菌雙蒸水分別溶解單鏈DNA1、單鏈DNA2、單鏈DNA3、單鏈DNA4，將單鏈DNAl與單鏈DNA2于避光環(huán)境中分別按照等摩爾濃度混勻，于95°C水浴中煮沸3min變性，再緩慢冷卻至室溫，即退火形成供體DNA，將單鏈DNA3與單鏈DNA4于避光環(huán)境中分別按照等摩爾濃度混勻，于95°C水浴中煮沸3min變性，再緩慢冷卻至室溫，即退火形成靶DNA ； (3)待測(cè)化合物樣品的篩選· 反應(yīng)在96孔微孔板上進(jìn)行，微孔板設(shè)陰性對(duì)照3孔，每孔分別加入5 Ul 二甲亞砜，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照3孔，每孔分別加入5 Ul 二甲亞砜，但其后所加蛋白為SOOng高溫變性后的整合酶蛋白，其他孔中每孔分別加入5 Ul不同濃度的待測(cè)化合物樣品，除陽(yáng)性對(duì)照孔外，每孔均分別加入800ng整合酶蛋白，于37°C孵育20min，再加入I. 5pmol供體DNA和15pmol靶DNA,加入滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積50 u 1，混勻后于37°C孵育lh，再加入10mg/ml的鏈霉親和素磁珠I. 5 和51. 5 磁珠結(jié)合緩沖液，徹底振蕩混勻后于20°C孵育15min，將微孔板置于板式磁珠收集器靜置90s，棄上清，并用含0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗磁珠三次，最后用熒光分析儀檢測(cè)每孔的相對(duì)熒光值，并計(jì)算待測(cè)樣品的抑制率。2、根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種HIV-I整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法，其特征在于用于制備供體DNA與靶DNA單鏈DNA1、單鏈DNA2、單鏈DNA3、單鏈DNA4的序列如下 單鏈 DNAl :5’-ACCCTITTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-3’，其中 5’ 端標(biāo)記生物素基團(tuán)，單鏈 DNA2 :5’ -ACTGCTAGAGATITTCCACACTGACTAAAAG-3’， 單鏈DNA3 :5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCGAT-3’，其中3’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素基團(tuán)，單鏈 DNA4 :5’ -ATCGCTAGAGATITTCCACAT-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法是用異硫氰酸熒光素(FITC)基團(tuán)標(biāo)記靶DNA，通過(guò)檢測(cè)FITC基團(tuán)的熒光信號(hào)來(lái)對(duì)整合酶的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性或待測(cè)樣品的抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)有的HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)抑制劑體外篩選方法整個(gè)過(guò)程至少需要約4h，而本發(fā)明方法可將整個(gè)篩選過(guò)程縮短至2h以內(nèi)，同時(shí)大大降低了篩選成本。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851378SQ201210345219
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者劉昕, 劉斌, 李杉, 何紅秋, 許先進(jìn), 譚建軍, 張小軼, 李春華, 王存新 申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)