專利名稱：一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法，本發(fā)明涉及一種快速高效構(gòu)建點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退 火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”。通過巧妙設(shè)計(jì)單點(diǎn)突變，將質(zhì)粒定點(diǎn)突變技術(shù)變得簡單有效。設(shè)計(jì)一對包含突變位點(diǎn)的引物(正、反向)，和模板質(zhì)粒退火后用高保真DNA聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個(gè)反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴(kuò)增，不會形成多個(gè)串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。之后用DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模板質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎(DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次)，而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法。本發(fā)明的具體步驟如下I)把兩個(gè)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩條延伸方向相向的引物上；2) PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，但是延伸溫度的時(shí)間設(shè)定與該重組質(zhì)粒的長度有關(guān)，一般含7000b堿基數(shù)的重組質(zhì)粒延伸時(shí)間約為5-8min ；3) PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，但是PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一般約為15_20次；4) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；5)選擇陽性克隆測序。本發(fā)明所述PCR擴(kuò)增步驟與普通PCR —致，只是延伸溫度的時(shí)間設(shè)定要根據(jù)重組質(zhì)粒的長度而定，PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)也要盡量少一些，一般15-20次為宜，盡量減少因PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)過多而引起的其它突變。本發(fā)明的詳細(xì)的步驟為
I)把兩個(gè)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩條延伸方向相向的引物上突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的時(shí)候要注意，突變引物5 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)比3 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)要多一些，一般5 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)為15-30bp，而3 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)為6-15bp。2)設(shè)定PCR擴(kuò)增程序PCR反應(yīng)條件
預(yù)變性94°C4 min 變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最后延伸72°C5 min“變性-退火-延伸”這個(gè)過程進(jìn)行15-20個(gè)循環(huán)。3) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞PCR擴(kuò)增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗(yàn)一下有弱的條帶就可以了。再用DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h，之后可直接轉(zhuǎn)化克隆宿主菌或表達(dá)宿主菌。4)選擇陽性克隆測序本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法。


圖I.快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的原理
具體實(shí)施例方式材料和檢測方法臆水合酶基因B (GenBank U89363. I)來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668 ( “A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase”發(fā)表在 1997的 Biochemistry)。模板質(zhì)粒 pET24a(+)_B。實(shí)施例II)根據(jù)腈水合酶基因序列B(GenBank U89363. I)設(shè)計(jì)引物2)把兩個(gè)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩條延伸方向相向的引物上突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的時(shí)候要注意，突變引物5 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)比3 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)要多一些，一般5 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)為15-30bp，而3 ‘端離突變位點(diǎn)的堿基數(shù)為6-15bp。本實(shí)例希望突變腈水合酶第10位的丙氨酸為半胱氨酸和第172位的丙氨酸為半胱氨酸，根據(jù)上述引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)上游突變引物5 <-tggcattcacgatactggcggat￡ccatggttat-3> (如 SEQ ID NO. I所示)；下游突變引物5 <-gggctgctcgccctttccgtgtgc￡ca￡gtgtcc-3> (如 SEQ ID NO. 2所示)；下劃線的核苷酸為突變位點(diǎn)。
3)設(shè)定PCR擴(kuò)增程序PCR反應(yīng)條件
預(yù)變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min 最后延伸72°C5 min“變性-退火-延伸”這個(gè)過程進(jìn)行15-20個(gè)循環(huán)。4) PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞PCR擴(kuò)增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗(yàn)一下有弱的條帶就可以了。然后再用DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h，之后直接轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)表達(dá)宿主菌。5)選擇陽性克隆測序選擇陽性克隆送生工生物工程上海股份有限公司測序，測序結(jié)果(如SEQ ID NO. 3所示)顯示成功突變了第10位和第172位兩個(gè)位點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法，是采用把兩個(gè)突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩個(gè)特異性引物片段上，通過一步PCR獲得含兩點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒的方法。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，一步PCR擴(kuò)增得到含兩點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒，不需要酶切、連接等傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建方法。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的模板是已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，兩個(gè)突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩個(gè)特異性引物上。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，兩個(gè)引物擴(kuò)增的方向相向。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR延伸時(shí)間為延伸整個(gè)重組質(zhì)粒長度的時(shí)間，一般含7000bp堿基數(shù)的重組質(zhì)粒延伸時(shí)間約為5-8min。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)一般約為15-20次。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增完成后經(jīng)DpnI酶消化模板質(zhì)粒3h后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速高效構(gòu)建兩點(diǎn)突變重組質(zhì)粒的方法，是采用是把兩個(gè)突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在兩個(gè)特異性引物片段上，通過一步PCR獲得含兩點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒的方法，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法操作簡單，具有非常高的效率和成功率。
文檔編號C12N15/64GK102899345SQ20121034524
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者周哲敏, 劉義, 崔文璟, 周麗, 周月涵 申請人:江南大學(xué)