專利名稱：一種快速篩選抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物學(xué)方法，特別涉及ー種快速篩選抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
一直以來，微生物來源的天然產(chǎn)物在人類疾病的治療過程中發(fā)揮著重要作用。近20多年來，隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，病原菌的耐藥性迅速増加，而從傳統(tǒng)的土壌微生物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物卻出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)，在探索具有生物活性天然產(chǎn)物新來源的過程中，海洋微生物引起了廣泛的關(guān)注。海洋微生物與傳統(tǒng)制藥業(yè)主要前體來源的陸生微生物具有顯著不同的生長(zhǎng)環(huán)境，能通過新穎的代謝方式來適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境，從 而可能產(chǎn)生異于陸生微生物的新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且海洋微生物資源豐富。因此我們可以從海洋微生物發(fā)酵提取物中尋找新的抗病原菌的藥物。由于海洋微生物資源豐富，進(jìn)行篩選時(shí)比較困難，采用傳統(tǒng)篩選方法費(fèi)時(shí)而且低效。黑曲霉可引起植物方面的疾病，使植物發(fā)生霉變，進(jìn)ー步造成農(nóng)業(yè)方面的損失,例如黑曲霉感染可導(dǎo)致洋蔥的霉變，當(dāng)條件有利于其生長(zhǎng)，黑曲霉的感染會(huì)遍及全部，同時(shí)會(huì)引起ー個(gè)普遍的采后的災(zāi)害，可以觀察到黑曲霉的孢子存在于洋蔥的鱗片之間。不僅是洋蔥，黑曲霉同時(shí)也能引起花生和葡萄的采后災(zāi)害等。另一方面，黑曲霉也可引起人類和動(dòng)物方面的疾病，相比于其他曲霉囷，黑曲霉不太可能引起人體和動(dòng)物方面的疾病，但如果吸入大量孢子，可能發(fā)生了嚴(yán)重的肺病。黑曲霉是耳霉菌癥的最常見的原因之一(真菌的耳部感染)，這可能會(huì)導(dǎo)致疼痛，臨時(shí)聽カ的損失，并在嚴(yán)重的情況下，損傷耳道和鼓膜。因此，目前需要一種從資源豐富的海洋微生物發(fā)酵提取物中快速篩選新的抗黑曲霉的藥物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種從海洋微生物的發(fā)酵提取物中快速篩選新的抗黑曲霉的藥物的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供以下具體技術(shù)方案
ー種快速篩選抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟
將待篩選樣品，刃天青，黑曲霉孢子菌懸液加入到96微孔板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，其中設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；優(yōu)選培養(yǎng)12 — 36h ;
得到結(jié)果；即得到微孔板的顔色，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值，和抑制率根據(jù)結(jié)果篩選。篩選微孔板的顔色為藍(lán)色或紫色，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值低于15000，抑制率為40%以上。其中所述酶標(biāo)儀測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)550nm發(fā)射波長(zhǎng)590nm處的熒光值。所述抑制率的計(jì)算公式為
抑制率％=100%_ (實(shí)驗(yàn)孔熒光值-陽性對(duì)照熒光值)/ (陰性對(duì)照熒光值-陽性對(duì)照熒光值)*100%。陰性對(duì)照為無菌水代替待篩選樣品；陽性對(duì)照為176ulRPMI_1640培養(yǎng)基代替黑曲霉孢子菌懸液。具體為將4微升待篩選樣品，20微升200ug/ml刃天青和176微升
2.5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌懸液加入到96微孔板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；
24h后觀察微孔板的顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)550nm發(fā)射波長(zhǎng)590nm處的熒光值，然后在由熒光值計(jì)數(shù)出抑制率；取顏色為藍(lán)色或紫色、熒光值低于15000，抑制率為40%以上的微孔，并顯微鏡觀察。所述的待篩選樣品為海洋微生物發(fā)酵液提取物。本發(fā)明的檢測(cè)原理是活細(xì)胞中的乳酸脫氫酶能將刃天青(藍(lán)色)轉(zhuǎn)化為熒光 物質(zhì)試鹵靈(粉紅紅色)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。試鹵靈會(huì)繼續(xù)被細(xì)胞還原為無熒光的物質(zhì)ニ氫試鹵靈(白色)，使熒光信號(hào)下降，無活性的或死亡的細(xì)胞喪失了代謝能力而不能還原刃天青使刃天青產(chǎn)生顏色變化，也就不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，所以該法能通過顏色和熒光信號(hào)兩方面的變化來特異性檢測(cè)活性細(xì)胞。本發(fā)明提供了從海洋微生物發(fā)酵液提取物中快速篩選或檢測(cè)抗黑曲霉活性物質(zhì)的方法，關(guān)鍵步驟為(1)制備海洋微生物發(fā)酵液；(2)從發(fā)酵液中提取，分離和純化組分；
(3)將甸種待測(cè)組分，刃天青溶液和黑曲霉抱子囷懸液加入到96微孔板中；(4)在黑曲霉的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h ；(5)根據(jù)刃天青的顏色、在激發(fā)波長(zhǎng)為550nm發(fā)射波長(zhǎng)為590nm熒光值以及有熒光值計(jì)數(shù)出抑制率判斷組分對(duì)黑曲霉的抑制作用大小；(6)在顯微鏡下觀察由刃天青得出對(duì)黑曲霉有抑制作用的組分，由此判斷組分抑制黑曲霉的哪個(gè)階段。本發(fā)明實(shí)施例提供了 3株海洋微生物發(fā)酵液提取物分離的87個(gè)餾分中篩選出6個(gè)餾分有抗黑曲霉活性。本發(fā)明用刃天青指示劑作為指示黑曲霉生長(zhǎng)情況的指示劑，以刃天青顏色變化，熒光值的大小以及由熒光值得出的抑制率，直觀地、準(zhǔn)確地的反應(yīng)了黑曲霉的生長(zhǎng)情況。由于刃天青指示劑顏色變化明顯，易于肉眼觀察；由刃天青得到的熒光值以及由熒光值計(jì)算得出的抑制率能準(zhǔn)備的反應(yīng)黑曲霉的生長(zhǎng)情況，使得刃天青作為抗黑曲霉活性實(shí)驗(yàn)的指示劑較其他指示劑，如XTT，甲基橙等更具有優(yōu)勢(shì)。刃天青在該方法中的運(yùn)用，使得該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確。本發(fā)明還提供了用黑曲霉的形態(tài)來檢測(cè)由刃天青指示劑得出的活性物質(zhì)對(duì)黑曲霉抑制作用的強(qiáng)弱。在顯微鏡觀察下由黑曲霉孢子或孢子萌發(fā)形態(tài)來判斷活性物質(zhì)對(duì)黑曲霉抑制作用強(qiáng)弱以及活性物質(zhì)抑制黑曲霉哪個(gè)階段。由于該方法更易于觀察，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠、精確。本發(fā)明通過刃天青顏色變化，熒光值的大小以及由熒光值計(jì)算得出抑制率的大小來判斷樣品有無抗黑曲霉作用。以及通過刃天青顏色變化，熒光值大小以及由熒光值計(jì)算得出抑制率判斷出餾分對(duì)黑曲霉有抑制率作用；然后在倒置顯微鏡下觀察有抗黑曲霉活性的96微孔從而進(jìn)一歩判斷活性餾分對(duì)黑曲霉抑制作用的大小以及對(duì)黑曲霉抑制作用階段。本發(fā)明的判斷方法具體為通過刃天青的顔色來判斷組分對(duì)黑曲霉有無活性；96孔中顏色呈藍(lán)色，則代表樣品對(duì)黑曲霉有抑制活性；96孔中顏色呈粉紅色或紅色，則代表樣品對(duì)黑曲霉沒有抑制活性。熒光值在5000以下或由熒光值得出的抑制率為70%以上，則代表樣品對(duì)黑曲霉有很強(qiáng)的抑制作用；熒光值在5000到15000或由熒光值得出的抑制率在40%-70%，則代表樣品對(duì)黑曲霉有較好的抑制作用；熒光值在15000以上或抑制率在40%以下，則代表樣品對(duì)黑曲霉有微弱或無抑制作用。本發(fā)明的方法比傳統(tǒng)的平板篩選法具有操作簡(jiǎn)單、工作量少、能進(jìn)行高通量篩選、能判斷活性樣品對(duì)黑曲霉是抑菌還是殺菌作用等優(yōu)點(diǎn)。由于該方法采用了多重指標(biāo)來判斷對(duì)黑曲霉的抑制作用，使得結(jié)果更加精確可靠。本發(fā)明從海洋微生物發(fā)酵液提取物中快速篩選或檢測(cè)抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法，可以大批量的篩選海洋微生物發(fā)酵液提取物。該方法操作簡(jiǎn)單，所需的實(shí)驗(yàn)器材和藥品簡(jiǎn)單，工作量較少；同時(shí)該方法采取刃天青顏色變化、熒光值、抑制率以及黑曲霉形態(tài)變化的多重判斷標(biāo)準(zhǔn)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確可靠。本方法快速易行，可以從大量的海洋微生物發(fā)酵液提取物中篩選出抗黑曲霉的活性物質(zhì)，為研究抗黑曲霉的藥物奠定基礎(chǔ)。


圖I為經(jīng)刃天青顔色，熒光值和抑制率判斷得出的活性強(qiáng)的I個(gè)瓶霉發(fā)酵樣品抗黑曲霉活性狀況在顯微鏡下的圖片，用Nikon TE2000-S倒置顯微鏡拍攝的(100X); 圖2為圖I的陰性對(duì)照?qǐng)D片，用Nikon TE2000-S倒置顯微鏡拍攝(100X)。
具體實(shí)施例方式 下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋。需要說明的是，下列實(shí)施例僅僅是說明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明。另外，下列實(shí)施例中所采用的所有儀器、材料等均為市售可得的，如在下列實(shí)施例中沒有明確指出的操作，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的操作方法進(jìn)行。實(shí)施例I :海洋微生物發(fā)酵液提取物樣品的制備；
實(shí)驗(yàn)材料三批提取物樣品共87個(gè)，分別來自耐堿朽1檬球菌(Citricoccusalkalitolerans)，保藏于中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號(hào)MCCC1A00280;平臺(tái)資源號(hào)1535C0001000000149;采自太平洋；該菌生物危害程度四類；非致命菌；革蘭氏陽性好氧菌，過氧化氫酶陽性，氧化酶陰性；菌落成黃色球形或者近似球形。聚多曲霉(Aspergillus sydowii)，保藏于中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號(hào)MCCC 3A00240 ;平臺(tái)資源號(hào)1535C0001000011892 ;采自西太平洋；菌落質(zhì)地為絲絨狀至絮狀，致密；顏色呈灰藍(lán)色至暗藍(lán)色，初期稍淡，老后漸深，近于暗藍(lán)灰緑色，有輻射形溝紋；通常具大量滲出液，褐色至暗褐色無氣味或具輕微霉味；菌落反面呈淡褐或暗褐色至醬色，近于栗色或醬紅色。該菌為非致病菌。瓶霉(Phialophora sp. http://www.mccc.org.cn/detailRecord.asp auto_id =740),保藏于中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號(hào)MCCC 3A00108;平臺(tái)資源號(hào)1535C0001000000942 ;采自太平洋；該菌生物危害程度四類；菌落質(zhì)地為絲絨狀至絮狀，致密；顏色成青緑色，孢子青緑色，基絲淡黃緑色，孢子成團(tuán)。該菌為非致病菌。取上述菌種進(jìn)行活化，發(fā)酵，所得的發(fā)酵液進(jìn)行提取和分離。PDA液體培養(yǎng)基馬鈴薯提取液I. 0L，酵母膏I. 0克，蛋白胨3. 0克，葡萄糖15. 0克，瓊脂17. Og；
馬鈴薯提取液的制備取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加海水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，PH自然。實(shí)驗(yàn)步驟
一、聚多曲霉發(fā)酵液提取物樣品的制備1、取菌株聚多曲霉接種入PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，28°C搖床培養(yǎng)24小吋，活化后的菌株接種至大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基(大米105g,小米45g,葡萄糖3g,蛋白胨3g,酵母粉I. 5g，PH自然)中，室溫放置兩周；
2、發(fā)酵兩周后，取發(fā)酵樣品先進(jìn)行水洗，所得的樣品進(jìn)行離心(12，OOOrpm，lOmin)，得到上清液水樣，發(fā)酵液中ー些蛋白質(zhì)，糖類物質(zhì)等進(jìn)入水樣部分，將水樣做廢棄處理，這樣就去除了蛋白質(zhì)，糖類等物質(zhì)，然后用甲醇進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取3次，萃取的方法是將甲醇加入離心后去除水樣的沉積物中，采用高速彌散機(jī)(購買自德國(guó)IKA艾卡集團(tuán)廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司產(chǎn)品編號(hào)T25 DS25)將沉積物打成勻漿，離心(12，000rpm，10min)，取上清甲醇樣，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(購買自德國(guó)Heidolph公司，產(chǎn)品編號(hào)Hei_VAP value)濃縮成浸膏，然后用甲醇復(fù)溶至3mL。4°C保存?zhèn)溆茫?br> 3、用反相高效液相色譜儀分析步驟2所得樣品，采用甲醇與 水混合比例(甲醇水=5 % 95%, 2 分鐘；甲醇水=25 % - 60 % :75% — 40%, 42 分鐘；甲醇水=60 % 一100% :40% 一 0%, 50分鐘)等度洗脫，根據(jù)圖譜上出峰的時(shí)間接洗脫液。原則是ー個(gè)洗脫液對(duì)應(yīng)ー個(gè)信號(hào)峰，但圖譜上出峰時(shí)間接近的信號(hào)峰可合并。洗脫液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后得到提取物樣品共34個(gè)；
ニ、耐堿檸檬球菌發(fā)酵液提取物樣品的制備
1、取菌株耐堿檸檬球菌接種入TSB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，購買自海博生物有限公司，產(chǎn)品編號(hào)HB4114)中進(jìn)行活化，28°C搖床培養(yǎng)24小時(shí)，活化后的菌株接種至AM12液體發(fā)酵培養(yǎng)基(魚粉8g/L，淀粉10g/L，玉米粉10g/L，蛋白胨5g/L，甘油6g/L, CaC03 2 g/L, 3%海鹽或陳海水，pH 7. 5)中，28°C搖床培養(yǎng)7天；
2、發(fā)酵7天后離心(12，OOOrpmIOmin)去除菌體，取上清與こ酸こ酯加入到分液漏斗中進(jìn)行反復(fù)萃取3次，取漏斗中こ酸こ酯相，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏后，用こ酸こ酯復(fù)溶至3mL。4°C保存?zhèn)溆茫?br> 3、用反相高效液相色譜分析步驟2所得樣品，采用甲醇與こ酸こ酯混合比例(甲醇水=5%:95%，2 分鐘;甲醇水=20% 60%:80% 40%，45分鐘;甲醇:水=60% 100% :40% 0%，60分鐘)等度洗脫，根據(jù)圖譜上出峰的時(shí)間接洗脫液。原則是ー個(gè)洗脫液對(duì)應(yīng)ー個(gè)信號(hào)峰，但譜圖上出峰時(shí)間接近的信號(hào)峰可合井。洗脫樣采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后得到提取物樣品共27個(gè)。三、瓶霉發(fā)酵液提取物樣品的制備
1、取菌株瓶霉接種入PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，28°C搖床培養(yǎng)24小吋，活化后的菌株接種至大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基(大米105g,小米45g,葡萄糖3g,蛋白胨3g,酵母粉I. 5g,PH自然)中，室溫放置兩周；
2、發(fā)酵兩周后，取發(fā)酵樣品先進(jìn)行水洗，所得的樣品進(jìn)行離心(12，OOOrpm，lOmin)，得到水樣，發(fā)酵液中ー些蛋白質(zhì)，糖類等物質(zhì)進(jìn)入水樣部分，將水樣做廢棄處理，這樣就去除了蛋白質(zhì)，糖類等物質(zhì)，然后用甲醇進(jìn)行萃取，反復(fù)萃取3次，萃取的方法是將甲醇加入離心后的去除水樣的沉積物中，采用高速彌散機(jī)(購買自德國(guó)IKA艾卡集団廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司產(chǎn)品編號(hào)T25 DS25)將沉積物打成勻漿，離心(12，000rpm，10min)，取上清甲醇樣，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(購買自德國(guó)Heidolph公司，產(chǎn)品編號(hào)Hei_VAP value)濃縮成浸膏，然后用甲醇復(fù)溶至3mL。4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3、用反相高效液相色譜儀分析步驟2所得樣品，采用甲醇與水混合比例(甲醇冰=5%:95%，2 分鐘;甲醇:水=25% 60%:75% 40%，35分鐘;甲醇:水=60% 100% :40% 0%，45分鐘)等度洗脫，根據(jù)圖譜上出峰的時(shí)間接洗脫液。原則是ー個(gè)洗脫液對(duì)應(yīng)ー個(gè)信號(hào)峰，但圖譜上出峰時(shí)間接近的信號(hào)峰可合井。洗脫液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后得到提取物樣品共26個(gè)。實(shí)施例2 活性樣品的篩選
樣品 黑曲霉孢子菌懸液挑取在新鮮PDA平板上培養(yǎng)了 2-3d的黑曲霉孢子到0. 5%吐溫-20生理鹽水中搖勻；然后用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過顯微鏡下計(jì)數(shù)計(jì)算出黑曲霉孢子菌懸液的各個(gè)濃度，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基把黑曲霉孢子菌懸液稀釋到2. 5 X 104spores/ml o刃天青溶液用無菌水配置200ug/ml的刃天青溶液
試驗(yàn)步驟
1、將176微升2.5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌懸液、20微升200ug/ml刃天青溶液和4微升發(fā)酵液提取物(實(shí)施例所得到87個(gè)提取物樣品，分別加入)同時(shí)加入到96微孔板中；在96微孔板中設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照和兩個(gè)陽性對(duì)照。(陰性對(duì)照為4ul的無菌水代替4ul發(fā)酵液提取物；陽性對(duì)照為176微升RPMI-1640培養(yǎng)基(購買于sigma公司)代替黑曲霉孢子菌懸液)；
2、將96微孔板放入到37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
3、24h后觀察96微孔板中各個(gè)孔的顔色；并與陰性和陽性孔做對(duì)比。然后將96微孔板在酶標(biāo)儀中測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)為550nm發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處的熒光值并通過公式計(jì)數(shù)出抑制率。將96微孔板顏色顯示為藍(lán)色、熒光值在15000以下和抑制率在70%的孔在倒置顯微鏡下觀察黑曲霉的形態(tài)；
4、從顯微鏡下的黑曲霉的形態(tài)進(jìn)一歩判斷活性物質(zhì)對(duì)黑曲霉的抑制作用以及判斷活性物質(zhì)抑制黑曲霉的哪個(gè)階段(黑曲霉孢子的萌發(fā)或黑曲霉菌絲的生長(zhǎng))。抑制率公式
抑制率％=100%_ (實(shí)驗(yàn)孔熒光值-陽性對(duì)照熒光值)/ (陰性對(duì)照熒光值-陽性對(duì)照熒光值)*100%，結(jié)果87個(gè)海洋微生物發(fā)酵液提取物中，由聚多曲霉發(fā)酵得來的34個(gè)樣品中其中只有I個(gè)活性強(qiáng)的抗黑曲霉活性樣品刃天青顯示為藍(lán)色、熒光值為9002. 47、抑制率在72. 2% ;將其進(jìn)ー步在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果為該樣品中黑曲霉的菌絲較短。由耐堿檸檬球菌發(fā)酵得來的27個(gè)樣品中其中有5個(gè)活性好的抗黑曲霉活性樣品，進(jìn)ー步經(jīng)顯微鏡觀察后有3個(gè)活性較強(qiáng)的抗黑曲霉活性刃天青顯示為藍(lán)色或藍(lán)紫色，熒光值為15000以下，抑制率為65%以上的樣品有5個(gè)；將其進(jìn)一歩在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果為2個(gè)樣品中黑曲霉的菌絲很短，I個(gè)樣品中黑曲霉菌絲較短，2個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照來說菌絲沒有那么密集。由瓶霉發(fā)酵得來的26個(gè)樣品，其中只有I個(gè)活性強(qiáng)的抗黑曲霉活性樣品刃天青顯示為藍(lán)色，熒光值為1375. 937，抑制率為98. 7% ;將其進(jìn)ー步在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果為該樣品中黑曲霉的菌絲較短。見圖I和圖2。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
權(quán)利要求
1.ー種快速篩選抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟 將待篩選樣品，刃天青，黑曲霉孢子菌懸液加入到96微孔板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，其中設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；優(yōu)選培養(yǎng)12 — 36h ; 得到結(jié)果； 根據(jù)結(jié)果篩選。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述的得到結(jié)果為微孔板的顔色，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值，和抑制率。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述的根據(jù)結(jié)果篩選為微孔板的顔色為藍(lán)色或紫色，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值低于15000，抑制率為40%以上。
4.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述酶標(biāo)儀測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)550nm發(fā)射波長(zhǎng)590nm處 的熒光值。
5.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述抑制率的計(jì)算公式為 抑制率％=100%_ (實(shí)驗(yàn)孔熒光值-陽性對(duì)照熒光值)/ (陰性對(duì)照熒光值-陽性對(duì)照熒光值)*100%。
6.權(quán)利要求I的方法，其特征在于，所述陰性對(duì)照為無菌水代替待篩選樣品；陽性對(duì)照為176ulRPMI-1640培養(yǎng)基代替黑曲霉孢子菌懸液。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其特征在干， 將4微升待篩選樣品，20微升200ug/ml刃天青和176微升2. 5X 104SpOreS/ml黑曲霉孢子菌懸液加入到96微孔板中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ； 24h后觀察微孔板的顏色變化，并用酶標(biāo)儀測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)550nm發(fā)射波長(zhǎng)590nm處的熒光值，然后在由熒光值計(jì)數(shù)出抑制率；取顏色為藍(lán)色或紫色、熒光值低于15000，抑制率為40%以上的微孔，并顯微鏡觀察。
8.權(quán)利要求I一 7任一方法,其特征在于,待篩選樣品為海洋微生物發(fā)酵液提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速篩選抗黑曲霉的活性物質(zhì)的方法。包括將待篩選樣品，刃天青，黑曲霉孢子菌懸液加入到96微孔板中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，其中設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；優(yōu)選培養(yǎng)12-36h；得到結(jié)果；然后根據(jù)結(jié)果篩選出抗黑曲霉的活性物質(zhì)。當(dāng)微孔板的顏色為藍(lán)色或紫色，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值低于15000，抑制率為40%以上時(shí)，所檢測(cè)的樣品為抗黑曲霉的活性物質(zhì)。該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK102851351SQ201210346418
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者陳建明, 胡彬, 王蔚, 陳卓, 李芊, 楊慧 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所