專利名稱：一種尼泊司他汀生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝。
背景技術(shù)：
尼泊司他汀，英文名稱Lipstatin，白色油狀物，是ー種用于生產(chǎn)新型減肥藥奧利司他的醫(yī)藥中間體。奧利司他是由發(fā)酵物尼泊司他汀經(jīng)ー步加氫還原制得。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長(zhǎng)效和強(qiáng)效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內(nèi)胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價(jià)鍵使酶失活而發(fā)揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單?；视?。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。毒三素鏈霉菌，拉丁學(xué)名Streptomycestoxytricini,為鏈霉菌科、鏈霉菌屬，孢子絲長(zhǎng)，頂端2-3圈緊密大螺旋形。孢子橢圓形至柱形，表面光滑。抑制金黃色葡萄球菌、 枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母、顆粒青霉?，F(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)酵生產(chǎn)尼泊司他汀的エ藝存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價(jià)低的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種生產(chǎn)成本低、發(fā)酵效價(jià)高的尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝。為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝，其特征在于包括如下流程A、用發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水配制發(fā)酵液所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1% -4.5%、黃豆粉2% -6.5%、卵磷脂1.5% -4%、葵花油5% -12%、硫酸鎂O. 01% -O. 15%、碳酸鈣O. 05% -O. 4% ；B、發(fā)酵BI、在發(fā)酵液中接種毒三素鏈霉菌菌種，菌種的接種量為發(fā)酵液的2% -10%，菌種的細(xì)菌濃度為15% -25% ；B2、菌種發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溫度控制在26°C _29°C，發(fā)酵時(shí)間為6_8天；B3、菌種發(fā)酵過程中，采用酸堿自動(dòng)平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在6. 8 7. 8之間；B4、菌種發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在35%以上，所述攪拌速度為60-160rpm ；C、發(fā)酵產(chǎn)物純化，包括如下步驟Cl、發(fā)酵結(jié)束后，酸化處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為1-6，并采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；
C2、將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮溶液中，浸泡4 12小時(shí)，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補(bǔ)加純水，制得丙酮濃度為35% 55%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，并進(jìn)行萃取，萃取后收集正庚烷相；C5、對(duì)正庚烷相進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻后，分層除油；C7、收集こ腈相，并對(duì)其減壓濃縮，至無餾分析出，制得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然后，上硅膠柱進(jìn)行吸附； C9、吸附完畢后，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出；Cl I、二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，制得高純度尼泊司他汀。進(jìn)一步地說所述尼泊司他汀發(fā)酵液培養(yǎng)基中還包含有適量的微量元素。所述B3步驟中，采用氫氧化鈉和鹽酸對(duì)發(fā)酵液的pH值進(jìn)行自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)。所述Cl步驟中，采用25% -45%的硫酸對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酸處理。所述發(fā)酵產(chǎn)物純化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、こ腈均為エ業(yè)級(jí)，含量均大于95%。所述C8步驟中，所述硅膠柱采用的硅膠為80-120目。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要氮源和碳源，并通過調(diào)控發(fā)酵エ藝及培養(yǎng)基組份，采用毒三素鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵、純化、精制而獲得高純度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價(jià)提高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價(jià)低的缺點(diǎn)。下面結(jié)合說明書附圖
和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步的描述。說明書附I是本發(fā)明的實(shí)施例I所述生產(chǎn)エ藝的產(chǎn)物尼泊司他汀含量HPLC圖；圖2是本發(fā)明的實(shí)施例2所述生產(chǎn)エ藝的產(chǎn)物尼泊司他汀含量HPLC圖；圖3是本發(fā)明的實(shí)施例3所述生產(chǎn)エ藝的產(chǎn)物尼泊司他汀含量HPLC圖。
具體實(shí)施例方式以20L發(fā)酵罐為例，對(duì)本發(fā)明所述的尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝作進(jìn)ー步描述。實(shí)施例I :一種尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝，包括如下流程A、把發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水投入20L發(fā)酵罐配制20L發(fā)酵液所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1%、黃豆粉2%、卵磷脂I. 5%、葵花油5%、硫酸鎂O. 01%、碳酸I丐O. 05%,微量元素適量,余量為去離子水。B、發(fā)酵BI、對(duì)配制好發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，然后在發(fā)酵液中接種毒三素鏈霉菌菌種，菌種的接種量為發(fā)酵液的5%，菌種的細(xì)菌濃度為15% ；
B2、菌種發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發(fā)酵時(shí)間為8天；B3、菌種發(fā)酵過程中，采用氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，所述攪拌速度為90rpm ；C、發(fā)酵產(chǎn)物純化，包括如下步驟Cl、發(fā)酵結(jié)束后，用25% -45%的硫酸酸化處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為4，并采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；C2、將干菌絲體加入8倍體積的丙酮溶液中，浸泡10小時(shí)，半框過濾除去菌絲，收 集濾液；C3、在濾液補(bǔ)加純水，制得丙酮濃度為35%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，并進(jìn)行萃取，萃取后收集正庚烷相；C5、對(duì)正庚烷相進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻后，分層除油；C7、收集こ腈相，并對(duì)其減壓濃縮，至無餾分析出，制得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然后，上硅膠柱進(jìn)行吸附；C9、吸附完畢后，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出；C11、二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，制得高純度尼泊司他汀，菌體得率為300克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)，尼泊司他汀效價(jià)為IlSOOmg/升，純度為96.4%，如圖I所示。實(shí)施例2 一種尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝，包括如下流程A、把發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水投入20L發(fā)酵罐配制20L發(fā)酵液所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油3%、黃豆粉4. 5%、卵磷脂3%、葵花油8%、硫酸鎂O. 05%、碳酸I丐O. 2%,微量元素適量,余量為去離子水。B、發(fā)酵BI、對(duì)配制好發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，然后在發(fā)酵液中接種毒三素鏈霉菌菌種，菌種的接種量為發(fā)酵液的8%，菌種的細(xì)菌濃度為20% ；B2、菌種發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發(fā)酵時(shí)間為7天；B3、菌種發(fā)酵過程中，采用氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在45%，所述攪拌速度為IOOrpm ；C、發(fā)酵產(chǎn)物純化，包括如下步驟Cl、發(fā)酵結(jié)束后，用25% -45%的硫酸酸化處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為4，并采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；C2、將干菌絲體加入10倍體積的丙酮溶液中，浸泡8小時(shí)，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補(bǔ)加純水，制得丙酮濃度為45%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，并進(jìn)行萃取，萃取后收集正庚烷相；C5、對(duì)正庚烷相進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻后，分層除油；C7、收集こ腈相，并對(duì)其減壓濃縮，至無餾分析出，制得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然后，上硅膠柱進(jìn)行吸附；C9、吸附完畢后，用己烷洗脫，收集洗脫液；
C10、對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出；C11、二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，制得高純度尼泊司他汀，菌體得率為320克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)，尼泊司他汀效價(jià)為12400mg/升，純度為97. 7%，如圖2所示。實(shí)施例3:一種尼泊司他汀生產(chǎn)エ藝，包括如下流程A、把發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水投入20L發(fā)酵罐配制20L發(fā)酵液所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油4. 5%、黃豆粉6. 5%、卵磷脂4%、葵花油12%、硫酸鎂O. 15%、碳酸I丐O. 4%,微量元素適量,余量為去離子水。B、發(fā)酵BI、對(duì)配制好發(fā)酵液進(jìn)行滅菌，然后在發(fā)酵液中接種毒三素鏈霉菌菌種，菌種的接種量為發(fā)酵液的10%，菌種的細(xì)菌濃度為20% B2、菌種發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發(fā)酵時(shí)間為8天B3、菌種發(fā)酵過程中，采用氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，所述攪拌速度為120rpm ；C、發(fā)酵產(chǎn)物純化，包括如下步驟 Cl、發(fā)酵結(jié)束后，用25% -45%的硫酸酸化處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為I，并采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體；C2、將干菌絲體加入14倍體積的丙酮溶液中，浸泡12小時(shí)，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補(bǔ)加純水，制得丙酮濃度為55%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，并進(jìn)行萃取，萃取后收集正庚烷相；C5、對(duì)正庚烷相進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻后，分層除油；C7、收集こ腈相，并對(duì)其減壓濃縮，至無餾分析出，制得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然后，上硅膠柱進(jìn)行吸附；C9、吸附完畢后，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出；
C11、二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，制得高純度尼泊司他汀，菌體得率為350克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)，尼泊司他汀效價(jià)為14300mg/升，純度為98. 2%，如圖3所示。本發(fā)明所述發(fā)酵液培養(yǎng)基的篩選，是在首先了解單個(gè)因素對(duì)毒三素鏈霉菌生長(zhǎng)及尼泊司他汀表達(dá)的影響后，再通過正交實(shí)驗(yàn)綜合考慮各因素之間的交互作用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后確定發(fā)酵配方，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵エ藝檢驗(yàn)和優(yōu)選，從而選定發(fā)酵エ藝，通過一系列純化工藝檢驗(yàn)與優(yōu)化，從而確定了最終的純化工藝。綜上所述，本發(fā)明具有如下特點(diǎn)I、菌體得率高，可達(dá)到250 350克(菌體濕重)/升(發(fā)酵液)；2、尼泊司他汀表達(dá)量高(包括相對(duì)含量和絕對(duì)含量)，其表達(dá)量可達(dá)到8000mg/升到 14000mg/ 升；3、發(fā)酵時(shí)間短，一般6天即可達(dá)到最大發(fā)酵產(chǎn)量的90% ； 4、發(fā)酵成本低，比當(dāng)前成本低15% ；5、分離エ藝精密，獲得產(chǎn)物純度高，獲得的尼泊司他汀含量可以達(dá)到98%。
權(quán)利要求
1.一種尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于包括如下流程 (A)用發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水配制發(fā)酵液 所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1% _4.5%、黃豆粉2% -6.5%、卵磷脂1.5% _4%、葵花油5% -12%、硫酸鎂O. 01% -O. 15%、碳酸鈣O.05% -O. 4% ； (B)發(fā)酵 (BI)在發(fā)酵液中接種毒三素鏈霉菌菌種,菌種的接種量為發(fā)酵液的2% -10%，菌種的細(xì)菌濃度為15% -25% ； (B2)菌種發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溫度控制在26°C _29°C，發(fā)酵時(shí)間為6_8天； (B3)菌種發(fā)酵過程中，采用酸堿自動(dòng)平衡來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值維持在6. 8 ·7.8之間； (B4)菌種發(fā)酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在35%以上，所述攪拌速度為60-160rpm ； (C)發(fā)酵產(chǎn)物純化，包括如下步驟 (Cl)發(fā)酵結(jié)束后，酸化處理發(fā)酵液，使發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)為1-6，并采用噴霧干燥的方法獲得干菌絲體； (C2)將干菌絲體加入1-14倍體積的丙酮溶液中，浸泡4 12小時(shí)，半框過濾除去菌絲，收集濾液； (C3)在濾液補(bǔ)加純水，制得丙酮濃度為35% 55%的丙酮稀釋液； (C4)向丙酮稀釋液中加入正庚烷，并進(jìn)行萃取，萃取后收集正庚烷相； (C5)對(duì)正庚烷相進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出，制得正庚烷濃縮液； (C6)向正庚烷濃縮液中加入乙腈，冷卻后，分層除油； (C7)收集乙腈相，并對(duì)其減壓濃縮，至無餾分析出，制得乙腈濃縮液； (CS)用己烷稀釋乙腈濃縮液，然后，上硅膠柱進(jìn)行吸附； (C9)吸附完畢后，用己烷洗脫，收集洗脫液； (ClO)對(duì)洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，至無餾分析出； (Cll) 二次結(jié)晶，收集晶體，減壓濃縮，制得高純度尼泊司他汀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于所述尼泊司他汀發(fā)酵液培養(yǎng)基中還包含有適量的微量元素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于所述(B3)步驟中，采用氫氧化鈉和鹽酸對(duì)發(fā)酵液的PH值進(jìn)行自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于所述(Cl)步驟中，采用25 % -45 %的硫酸對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酸處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物純化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均為工業(yè)級(jí)，含量均大于95 %。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，其特征在于所述(CS)步驟中，所述硅膠柱采用的硅膠為80-120目。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尼泊司他汀生產(chǎn)工藝，包括如下流程A、用發(fā)酵液培養(yǎng)基和去離子水配制發(fā)酵液；B、發(fā)酵；C、發(fā)酵產(chǎn)物純化；所述發(fā)酵液培養(yǎng)基采用以下原料制成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配制成的發(fā)酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1％-4.5％、黃豆粉2％-6.5％、卵磷脂1.5％-4％、葵花油5％-12％、硫酸鎂0.01％-0.15％、碳酸鈣0.05％-0.4％。本發(fā)明以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要氮源和碳源，并通過調(diào)控發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基組份，采用毒三素鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵、純化、精制而獲得高純度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生產(chǎn)成本大大降低，發(fā)酵效價(jià)提高，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的生產(chǎn)成本高、發(fā)酵效價(jià)低的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P17/02GK102827892SQ20121034771
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
發(fā)明者李海霞, 朱善超 申請(qǐng)人:李海霞