一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物DNA甲基化技術(shù)，具體地說是一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法。將基因組DNA經(jīng)酶切純化，純化后加入亞硫酸鹽修飾液進(jìn)行解鏈與修飾；修飾后純化回收測序，即實(shí)現(xiàn)基因組DNA的測序；所述亞硫酸鹽修飾液為500-550ul、100-120μLNaOH、0.5-0.6mg水溶性維生素E（Trolox）、10-15μL三烯丙基氰脲酸酯、0.037-0.040g四乙烯五胺五鹽酸鹽（TETRAEN）、37.5-40.0μL鹽酸胍溶液、0.3422-0.3800g偏重亞硫酸鈉、20-30μL對苯二酚和100-120ul無菌水；PH=5.0-5.1。本發(fā)明的測序方法所得基因組，提高了生物基因組DNA?CG位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、轉(zhuǎn)化率高。
【專利說明】一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物DNA甲基化技術(shù)，具體地說是一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對于生物DNA甲基化的研究，有很多報(bào)道，包括高效液相色譜法、亞硫酸鹽測序法、甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶結(jié)合Southern雜交分析法和MSAP (methylation-sensitive ampIi fied polymorphism)法等(南楠，曾凡鎖等)。高效液相色譜(HPLC)法是目前測定基因組DNA中5-mC總量最標(biāo)準(zhǔn)的方法，但不能了解甲基化的位置和狀態(tài)信息且對DNA純度要求較高(周翠蘭，殷宇芳等)。甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶聯(lián)用Southern印跡雜交法，此法不能反映出整個CpG島甲基化狀態(tài)。亞硫酸鹽測序(bisulfite DNAsequencing)，利用該方法時要注意DNA應(yīng)被亞硫酸氫鈉充分處理，有報(bào)道稱靠近甲基化CpG位點(diǎn)的非甲基化胞嘧啶具有對亞硫酸氧鈉的抵制作用(范保星)。關(guān)于基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾，大多參考Frommer等(1992)經(jīng)典修飾方法(單存海，鐘鳴等)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法，將基因組DNA經(jīng)酶切純化，純化后加入亞硫酸鹽修飾液進(jìn)行解鏈與修飾；修飾后純化回收測序，即實(shí)現(xiàn)基因組DNA的測序；所述亞硫酸鹽修飾液為 500-550ul、100-120 μ LNa0H、0.5-0.6mg 水溶性維生素 E (Trolox)、10-15 μ L 三烯丙基氰脲酸酯、0.037-0.040g四乙烯五胺五鹽酸鹽(TETRAEN)、37.5-40.0 μ L鹽酸胍溶液、0.3422-0.3800g 偏重亞硫酸鈉、20-30 μ L 對苯二酚和 100_120ul 無菌水；ΡΗ=5.0-5.1。
[0006]將基因組DNA中加入EcoR I酶、Hind III酶、緩沖液以及無菌水于常溫下水浴24-30h，經(jīng)水浴酶切后加入酶切體系等體積的氯仿與異戊醇的混合液混勻后離心收集上清液；
[0007]其中緩沖液為IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0008]而后在上清液中加入其體積1/10-1/5的3M NaAC,40-60 μ g糖原和3.5-4倍所述上清液體積的預(yù)冷無水乙醇混勻后，于_20°C沉淀過夜培養(yǎng)；
[0009]過夜培養(yǎng)后離心收集沉淀，并在沉淀中加入預(yù)冷的無水乙醇間歇混勻，再離心收集沉淀，通風(fēng)干燥后加入無菌水，待用。
[0010]所述經(jīng)酶切純化后DNA在93-95°C經(jīng)PCR處理5_10min使其變?yōu)閱捂?，將裂解液于冰中靜止1-5分鐘，離心5-6S后，加入NaOH混勻后于42_45°C水浴20_30min ;水浴后30 μ L裂解液中加入500 μ L亞硫酸鹽修飾液混勻進(jìn)行PCR處理修飾。在PCR儀器中95°C反應(yīng)3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重復(fù)三遍，最后保存溫度為20°C。
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):[0012]1.本發(fā)明所得亞硫酸鹽修飾液時添加了催化劑和抗氧化劑(三烯丙基氰脲酸酯(TAC)、水溶性維生素E (Trolox)、四乙烯五胺五鹽酸鹽(TETRAEN)、鹽酸胍溶液。從而縮短了測序方法的修飾時間，使修飾時間從16h縮短到1.5h ;同時加入Trolox具有抗氧化性質(zhì)的試劑，可以預(yù)防過氧化亞硫酸鹽導(dǎo)致的氧化脅迫；加入的鹽酸胍水溶液具有變性蛋白功能，在后續(xù)PCR中，可以有效的防止蛋白的影響。
[0013]2.采用本發(fā)明測序方法所得基因組，提高了生物基因組DNA CG位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化率。
[0014]3.雙鏈DNA在修飾之前需要變性，只有位于單鏈DNA上的甲基化胞嘧啶才能被亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化，因此，DNA部分變性是引起假陽性常見的原因，要實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，溫度和時間的控制至關(guān)重要。在原始的修飾方法中，55°C修飾12至16h，該條件下，大部分DNA的完整性要被破壞，大約有84% -96%的DNA被降解。之后進(jìn)行PCR檢測甲基化，有諸多缺點(diǎn):首先，擴(kuò)增CG含量高的啟動子區(qū)域非常困難；其次，用亞硫酸氫鈉處理后增加了后續(xù)PCR反應(yīng)的難度，表現(xiàn)為:①處理后DNA大量減少，模板量少；②大量的脲嘧啶使DNA雙鏈不能完全互補(bǔ)，不穩(wěn)定性增加引物針對正義DNA鏈設(shè)計(jì)，相當(dāng)于單鏈擴(kuò)增，且引物易與模板錯配，產(chǎn)生大量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0015]采用本發(fā)明修飾時間只有約I小時30分鐘，而且中間增加了三次95°C 30s的變性時間。此種修飾法，既大大縮短了修飾的時間，同時在保證完全修飾的基礎(chǔ)上，有效的保護(hù)了 DNA的完整性。之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性和重復(fù)性均增加。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為采用經(jīng)典修飾方法，甲基化位點(diǎn)圖。對比標(biāo)準(zhǔn)可知，Cd濃度為0、0.5,5.0的脅迫，甲基化位點(diǎn)分別為5、5、4。如圖所示(共11個CG位點(diǎn)，其中黑色的圓圈表示此位點(diǎn)發(fā)生甲基化)沒有明顯的變化趨勢。
`[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用改進(jìn)的修飾方法，甲基化位點(diǎn)圖。對比標(biāo)準(zhǔn)可知，Cd濃度為0、0.5,5.0的脅迫，甲基化位點(diǎn)分別為2、3、4?？梢钥闯?，隨著Cd脅迫濃度的增加，甲基化程度呈上升趨勢。如圖所示(共11個CG位點(diǎn)，其中黑色的圓圈表示此位點(diǎn)發(fā)生甲基化)。
[0018]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的2%瓊脂糖凝膠電泳圖，其中從左到右的孔道依次為:CdO、Cd0.5、Cd5.0、markerDL2000o
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
[0020]1.在約 IOyg 的基因組 DNA 中加入 10 μ L EcoR I 酶、10 μ L Hand III 酶和 20 μ L緩沖液，并加無菌水至200 μ L，于37°C水浴24小時，進(jìn)行酶切處理。
[0021]所述其中緩沖液為IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0022]2.首先水浴結(jié)束后，加入酶切體系等體積200ul的氯仿與異戊醇混合液，間歇混勻10分鐘；然后于4°C，12000r/min離心IOmin,吸取上清液180 μ L轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中。
[0023]其次加入上清液1/10體積的3M的NaAC (約20ul) ,40 Ug糖原和上清液3.5倍體積(650 μ L-700U1)的預(yù)冷的無水乙醇混勻后，于-20°c沉淀2— 3個小時(或過夜)；而后以4°C, 12000r/min 離心 30min。
[0024]棄上清液,在沉淀中加入Iml預(yù)冷的無水乙醇，間歇混勻5min ;再以4°C, 12000r/min離心20min ;所得沉淀再經(jīng)預(yù)冷的無水乙醇混勻重復(fù)離心操作。
[0025]最后再將沉淀常溫下離心8s，將附著在EP管內(nèi)壁上的乙醇?xì)堃弘x至管底，用滅過菌的濾紙吸干沉淀周圍的液體，通風(fēng)干燥3min，時間不要太長，否則不易回溶。干燥后的DNA中加入50 μ L無菌水。
[0026]3.亞硫酸鹽修飾液的配制:在2ml的離心管中，加入600 μ L無菌水，同時在加入100 μ L新配的6Μ Na0H、0.5mg水溶性維生素E (配好后終濃度是0.5mg/ml)、10 μ L三烯丙基氰脲酸酯(終濃度是lmM)、0.037g四乙烯五胺五鹽酸鹽(TETRAEN)(終濃度是0.1M)、37.5μ L鹽酸胍溶液(終濃度是0.3Μ)、加入0.3422g偏重亞硫酸鈉(終濃度是3.6M)和20 μ L新配的對苯二酚；調(diào)節(jié)PH為5.0-5.1，加入無菌水100 μ L，即定容到1ml。
[0027]所述6M NaOH的配制為:0.24g NaOH溶于Iml無菌水；同時現(xiàn)用現(xiàn)配。320mM對苯二酚的配制為:0.007g對苯二酚溶于200 μ L無菌水；并在錫箔包裹，避光，55°C下水浴保存待用。0.1M三烯丙基氰脲酸酯的配制:0.0034g三烯丙基氰脲酸酯溶于200 μ L無菌水。
[0028]4.將步驟3)酶切純化后的DNA溶液25 μ L置于PCR儀中，在95°C處理5min使其變?yōu)閱捂湥粚⑸鲜鰡捂淒NA拿出，置于冰中I分鐘，離心5-6S后，向管中加入5yL 6M的NaOH,用槍混勻，42°C下水浴20min (終體積30ul)。[0029]水浴結(jié)束后，向30 μ L解鏈后的DNA溶液中，加入上述步驟3)配制的亞硫酸鹽修飾液修飾液500ul，此時總體積為530 μ L ;而后分裝PCR管中，短暫離心之后進(jìn)行修飾，修飾程序?yàn)?在PCR儀器中95°C反應(yīng)3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重復(fù)三遍，最后保存溫度為20°C。
[0030]5.將修飾后DNA的純化回收使用洗脫純化回收DNA系統(tǒng)進(jìn)行純化回收處理
[0031]具體為:1)修飾之后合管于1.5mLEP管中，管中加入200-250 μ L洗脫純化回收DNA樹脂，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合。Clean-up resin在使用前應(yīng)劇烈搖勻，否則樹脂沉降在溶液的底層，影響回收質(zhì)量(洗脫純化回收DNA系統(tǒng)，按照Wi zard? DNA純化系統(tǒng)公司所提供系統(tǒng)進(jìn)行，具體為Promega，A7280)。
[0032]2)將一只2.5mL醫(yī)用注射器的針筒與試劑盒(購自Wizard? DNA純化系統(tǒng)公司)提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用微量移液器移至針筒內(nèi)，取一個小量度的玻璃燒杯放置在小柱下部以方便接收廢液。加針?biāo)?，輕輕加壓，將液體緩慢擠出，此時可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積。
[0033]3)將注射器與小柱分尚后拔出針?biāo)?再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2mL80%的異丙醇溶液，插入針?biāo)?，輕輕加壓，將液體緩慢擠出。此為洗滌步驟。洗滌后再重復(fù)洗漆I次。
[0034]4)將注射器與小柱分離，將小柱置于一廢棄1.5mL的EP管上，常溫10000g/min(g是相對離心力，不是轉(zhuǎn)速r)，離心2min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時，修飾后DNA處于與樹脂結(jié)合的狀態(tài)。
[0035]5)將小柱取下置于另一潔凈1.5mL EP管上，并用微量移液器吸取50 μ L事先70°C預(yù)熱好的無菌水置于EP管，室溫放置5min，常溫10000g/min離心20s進(jìn)而洗脫下小柱內(nèi)經(jīng)修飾的DNA溶液，洗脫過程重復(fù)操作2次(每次50ul，兩次之后保證總體積是lOOul)。洗脫后EP管內(nèi)修飾后DNA溶液終體積為100 μ L0
[0036]6.脫磺化:向上述100 μ L洗脫溶液中加入5 μ L新鮮配制的6Μ NaOH溶液，于42°C水浴20min。水浴后吸取160 μ L 4Μ的NH4AC加入其中，混勻，使溶液pH值穩(wěn)定在8.0附近，進(jìn)行脫磺化。(此步為脫磺化，終體積為265 μ L)。
[0037]脫磺化后加入其3倍體積(約800μ L)的_20 °C低溫預(yù)冷的無水乙醇，再加入40 μ g糖原，后置于_20°C沉淀3小時(或過夜)。而后以4°C下12000r/min離心30min，倒去上清液，收集沉淀于EP管中并加入Iml異丙醇，輕柔傾斜EP管，旋轉(zhuǎn)一圈，洗滌沉淀，后40C 12000r/min離心lOmin。而后再重復(fù)操作離心處理I次。
[0038]倒掉上清，在于常溫離心8s，將附著在EP管內(nèi)壁上的乙醇?xì)堃弘x至管底，用無菌濾紙條小心將殘余液體吸凈，并于室溫下通風(fēng)干燥3min。當(dāng)沉淀由不透明變?yōu)橥该鲿r，用微量移液器加入60 μ L無菌水，溶解5-10min，此處即為修飾后的DNA溶液。
[0039]7.將上述修飾后DNA溶液進(jìn)行met—PCR ;采用25 μ L體系。即DNA用量分別為150ng。PCR 體系成分為:2.5ul 10*buffer、2.0ul DNTP、0.5ul rTaq、0.8ul 引物和 150ngDNA(5ul)，加水至 25ul。
[0040]PCR 程序?yàn)?941:預(yù)變性51^11;941: 30s, 55。。30s, 72。。Imin 2 圈;采用降落 PCR，將退火溫度每兩圈降低一度。直至退火溫度降低到47°C，將47°C退火設(shè)置為19圈，72°C延伸1Omin ;4°C中斷，共計(jì)35圈。而后將擴(kuò)增產(chǎn)物用常規(guī)克隆測序。
[0041]實(shí)施例2
[0042]1.提取基因組DNA:
[0043]首先用0.1% HgCl2溶液對選取好的飽滿擬南芥種子進(jìn)行IOmin表面消毒，然后用去離子水清洗3次，每次5min。洗凈后，將種子浸泡于去離子水中，于4°C放置3d，以打破種子休眠。將相同數(shù)量的擬南芥種子(約20~30粒)置于滅菌后的三角瓶中，加入IOOmL分別含 0、0.5 和 5.0mg.L 1Cd (CdCl2 配制)的 MS 營養(yǎng)液(Murashige and Skoog BasalSalt Mixture)，密封。置于搖床中進(jìn)行光照培養(yǎng)(溫度19~20°C，光暗周期14/10h，光強(qiáng)30001x)，21d后取樣，用刀片分離擬南芥幼苗葉及其根，經(jīng)蒸餾水與無菌水分別清洗3次后用濾紙擦干，冷藏于_80°C冰箱中待用。
[0044]而后以CTAB法提取經(jīng)不同濃度鎘(0、0.5,5.0mg.l-1)脅迫的擬南芥幼苗基因組DNA (提取過程參見鐘鳴馬慧，2008，生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，ISBN:9787811172768),
[0045]2.在約10 μ g的上述提取所得基因組DNA中加入10 μ L EcoR I酶、10 μ L HindIII酶和20 μ L M buffer,并加無菌水至200 μ L，于37°C水浴24小時，進(jìn)行酶切處理。
[0046]所述其中緩沖液為IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0047]3.首先水浴結(jié)束后，加入酶切體系等體積200ul的氯仿與異戊醇混合液，間歇混勻10分鐘；然后于4°C，12000r/min離心IOmin,吸取上清液180 μ L轉(zhuǎn)移到一新1.5ml離心管中。
[0048]其次加入上清液1/10體積的3M NaAC (約20ul)、40 μ g糖原和上清液3.5倍體積(650 μ L-700U1)的預(yù)冷的無水乙醇混勻后，于-20°c沉淀2— 3個小時(或過夜)；而后以4°C, 12000r/min 離心 30min。[0049]棄上清液,在沉淀中加入Iml預(yù)冷的無水乙醇，間歇混勻5min ;再以4°C, 12000r/min離心20min ;所得沉淀再經(jīng)預(yù)冷的無水乙醇混勻重復(fù)離心操作。
[0050]最后再將沉淀常溫下離心8s，將附著在EP管內(nèi)壁上的乙醇?xì)堃弘x至管底，用滅過菌的濾紙吸干沉淀周圍的液體，通風(fēng)干燥3min，時間不要太長，否則不易回溶。干燥后的DNA中加入50 μ L無菌水。
[0051]4.亞硫酸鹽修飾液的配制:在2ml的離心管中，加入600 μ L無菌水，同時在加入
100μ L新配的6Μ NaOH,0.5mg水溶性維生素E (配好后終濃度是0.5mg/ml)、10 μ L三烯丙基氰脲酸酯(終濃度是ImM)、0.037gTETRAEN(終濃度是0.1M)、37.5 μ L鹽酸胍溶液(終濃度是0.3M)、加入0.3422g偏重亞硫酸鈉(終濃度是3.6M)和20 μ L新配的對苯二酚；調(diào)節(jié)PH為5.0-5.1，加入無菌水100 μ L，即定容到Iml。
[0052]所述6Μ NaOH的配制為:0.24g NaOH溶于Iml無菌水；同時現(xiàn)用現(xiàn)配。320mM對苯二酚的配制為:0.007g對苯二酚溶于200 μ L無菌水；并在錫箔包裹，避光，55°C下水浴保存待用。0.1M三烯丙基氰脲酸酯的配制:0.0034g三烯丙基氰脲酸酯溶于200 μ L無菌水。
[0053]5.將步驟4)酶切純化后的DNA溶液25 μ L置于PCR儀中，在95°C處理5min使其變?yōu)閱捂湥粚⑸鲜鰡捂淒NA拿出，置于冰中I分鐘，離心5-6S后，向管中加入5yL 6M的NaOH,用槍混勻，42°C下水浴20min (終體積30ul)。
[0054]水浴結(jié)束后，向30 μ L解鏈后的DNA溶液中，加入上述步驟3)配制的亞硫酸鹽修飾液修飾液500ul，此時總體積為530 μ L ;而后分裝PCR管中，短暫離心之后進(jìn)行修飾，修飾程序?yàn)?在PCR儀器中95°C反應(yīng)3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重復(fù)三遍，最后保存溫度為20°C。
[0055]6.將修飾后DNA的純化回收使用Wizard Clean-up DNA (洗脫純化回收DNA)系統(tǒng)進(jìn)行純化回收處理。
[0056]具體為:1)將上述修飾好的DNA合管于1.5mLEP管中，加入200-250 μ L WizardDNA Clean-up resin (洗脫純化回收DNA樹脂),輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合。(Clean-up resin在使用前應(yīng)劇烈搖勻,否則樹脂沉降在溶液的底層,影響回收質(zhì)量)。
[0057]2)將一只2.5mL醫(yī)用注射器的針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后，將上述混合物用微量移液器移至針筒內(nèi)，取一個小量度的玻璃燒杯放置在小柱下部以方便接收廢液。加針?biāo)?，輕輕加壓，將液體緩慢擠出，此時可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積。
[0058]3)將注射器與小柱分尚后拔出針?biāo)?再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2mL80%的異丙醇溶液，插入針?biāo)ǎp輕加壓，將液體緩慢擠出。此為洗滌步驟。洗滌后再重復(fù)洗漆I次。
[0059]4)將注射器與小柱分離,將小柱置于一廢棄1.5mL的EP管上,常溫10000g/min(g是相對離心力，不是轉(zhuǎn)速r)，離心2min，以甩去殘余異丙醇成分，使樹脂干燥。此時，修飾后DNA處于與樹脂結(jié)合的狀態(tài)。
[0060]5)將小柱取下置于另一潔凈1.5mL EP管上，并用微量移液器吸取50 μ L事先70°C預(yù)熱好的無菌水置于EP管，室溫放置5min，常溫10000g/min離心20s進(jìn)而洗脫下小柱內(nèi)經(jīng)修飾的DNA溶液，洗脫過程重復(fù)操作I次。洗脫后EP管內(nèi)修飾后DNA溶液終體積為100 μ L。
[0061]7.脫磺化:向上述IOOyL洗脫溶液中加入5μ L新鮮配制的6Μ NaOH溶液，于42°C水浴20min。水浴后吸取160 μ L 4Μ的NH4AC加入其中，混勻，使溶液pH值穩(wěn)定在8.0附近，進(jìn)行脫磺化。(此步為脫磺化，終體積為265 μ L)。
[0062]脫磺化后加入其3倍體積(約800μ L)的-20 °C低溫預(yù)冷的無水乙醇，再加入40 μ g糖原，后置于_20°C沉淀3小時(或過夜)。而后以4°C下12000r/min離心30min，倒去上清液，收集沉淀于EP管中并加入Iml異丙醇，輕柔傾斜EP管，旋轉(zhuǎn)一圈，洗滌沉淀，后40C 12000r/min離心lOmin。而后再重復(fù)操作離心處理I次。
[0063]倒掉上清，常溫離心8s，將附著在EP管內(nèi)壁上的乙醇?xì)堃弘x至管底，用無菌濾紙條小心將殘余液體吸凈，并于室溫下通風(fēng)干燥3min。當(dāng)沉淀由不透明變?yōu)橥该鲿r，用微量移液器加入60 μ L無菌水，溶解5-10min，此處即為修飾后的DNA溶液。
[0064]8.將上述修飾后DNA溶液進(jìn)行met — PCR ;采用25 μ L體系。即DNA用量分別為150ng。PCR 體系成分為:2.5ul 10*buffer、2.0ul DNTP、0.5ul rTaq、0.8ul 引物和 150ngDNA(5ul)，加水至 25ul。
[0065]PCR 程序?yàn)?94°〇預(yù)變性51^11;941: 30s, 55。。30s, 72°C Imin 2 圈;采用降落 PCR，將退火溫度每兩圈降低一度。直至退火溫度降低到47°C，將47°C退火設(shè)置為19圈，72°C延伸IOmin ;4°C中斷，共計(jì)35圈；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離(參見圖3)
[0066]另，將上述所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行甲基化位點(diǎn)分析，重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，用不含任何CpG位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以免擴(kuò)增時區(qū)別甲基化或非甲基化DNA。擴(kuò)增后尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，根據(jù)堿基變化(CG位點(diǎn)發(fā)生甲基化的則仍為CG，未發(fā)生甲基化的則為TG)判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
`[0067]可見重金屬Cd脅迫對擬南芥幼苗錯配修復(fù)基因MutL-homologuel (MLHl)啟動子甲基化的影響。(參見圖2)
[0068]由圖2與對比標(biāo)準(zhǔn)相比可知，Cd濃度為O、0.5、5.0的脅迫，甲基化位點(diǎn)分別為2、
3、4?？梢钥闯?，隨著Cd脅迫濃度的增加，甲基化程度呈上升趨勢。且CG位點(diǎn)的變化與Cd脅迫濃度有較明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。如圖所示共11個CG位點(diǎn)，其中黑色的圓圈表示此位點(diǎn)發(fā)生甲基化。
[0069]9.將上述所得產(chǎn)物常規(guī)克隆測序，得到:
[0070]CGCACCAATGACTGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAAATTATAATTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAAAAAAATCATTTCTAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTAATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAAAAACTATAATAATCATAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAATATCATCAACTTTAATCCATCTATAAAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTT
TATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTA
TTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAT
TGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACAT
[0071]得出的Cd脅迫濃度為O的MLHl基因啟動子的序列圖譜
[0072]CCCACATGACTGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAMTTATAATTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAGAAAAATCATTTCTAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTAATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAGAGACTATAATAATCATAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAATATCGTCAACTTTAATCCATCTATAAAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCT
[0073]得出的Cd脅迫濃度為0.5的MLHl基因啟動子的序列圖譜
[0074]ATGGACATGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAAATTATACTTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAAAAAAATCATTTCCAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTGATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAGAAACTATAATAATCACAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAGTATCGTCGACTTTAATCCATCTATAGAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGT
[0075]得出的Cd脅迫濃度為5.0的MLHl基因啟動子的序列圖譜。
[0076]實(shí)施例3
[0077]同時采用現(xiàn)有的原始亞硫酸鹽測序進(jìn)行同樣測序Marianne Frommer (1992), Agenomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosineresidues in individual DNA strands, Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA 89，1827-1831.)，(參見圖1)
[0078]由圖1與對比標(biāo)準(zhǔn)相比可知，Cd濃度為0、0.5、5.0的脅迫，甲基化位點(diǎn)分別為5、5、4。如圖所示(共11個CG位點(diǎn)，其中黑色的圓圈表示此位點(diǎn)發(fā)生甲基化)沒有明顯的變化趨勢。
【權(quán)利要求】
1.一種改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法，其特征在于:將基因組DNA經(jīng)酶切純化，純化后加入亞硫酸鹽修飾液進(jìn)行解鏈與修飾；修飾后純化回收測序，即實(shí)現(xiàn)基因組DNA的測序；所述亞硫酸鹽修飾液為500-550ιι1、100-120μ LNa0H、0.5-0.6mg水溶性維生素E(Trolox)、10-15y L三烯丙基氰脲酸酯、0.037-0.040g四乙烯五胺五鹽酸鹽(TETRAEN)、37.5-40.0 μ L鹽酸胍溶液、0.3422-0.3800g偏重亞硫酸鈉、20-30 μ L對苯二酚和100-120ul 無菌水；PH=5.0-5.1。
2.按權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法，其特征在于:將基因組DNA中加入EcoR I酶、Hind III酶、緩沖液以及無菌水于常溫下水浴24_30h，經(jīng)水浴酶切后加入酶切體系等體積的氯仿與異戊醇的混合液混勻后離心收集上清液； 其中緩沖液為 IOOmM Tris-Hcl (ρΗ7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ； 而后在上清液中加入其體積1/10-1/5的3M NaAC,40-60 μ g糖原和3.5-4倍所述上清液體積的預(yù)冷無水乙醇混勻后，于_20°C沉淀過夜培養(yǎng)； 過夜培養(yǎng)后離心收集沉淀，并在沉淀中加入預(yù)冷的無水乙醇間歇混勻，再離心收集沉淀，通風(fēng)干燥后加入無菌水，待用。
3.按權(quán)利要求1所述的改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法，其特征在于:所述經(jīng)酶切純化后DNA在93-95°C經(jīng)PCR處理5-10min使其變?yōu)閱捂?，將裂解液于冰中靜止1_5分鐘，離心5-6S后，加入NaOH混勻后于42-45°C水浴20_30min ;水浴后30 μ L裂解液中加入500 μ L亞硫酸鹽修飾液混勻進(jìn)行PCR處理修飾。
4.按權(quán)利要求3所述的改進(jìn)的亞硫酸鹽測序方法，其特征在于:在PCR儀器中95°C反應(yīng)3min，55°C 20min,之 后95°C 30s, 55°C 20min重復(fù)三遍，最后保存溫度為20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667432SQ201210351597
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】馬珊珊, 趙曉輝, 孫曉霞, 劉宛, 孫梨宗, 李照令, 鞏宗強(qiáng), 賈春云 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所