專利名稱：miRNA 222在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微小RNA (micro RNA，miRNA，miR) 222在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostate carcinoma, PCa)為歐美國家男性常見惡性腫瘤和主要死亡原因之一。隨著我國人均壽命延長(zhǎng)和生活方式的西化，PCa發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，它被列為中國21世紀(jì)增長(zhǎng)最快的腫瘤之一。本項(xiàng)目在前期工作中篩選出的19個(gè)在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)其在臨床血清樣本中的含量，尋找人前列腺癌轉(zhuǎn)移患者的血清學(xué)生物標(biāo)志物。 目前前列腺癌診斷指標(biāo)的研究工作主要集中在以下幾個(gè)方面=(I)PSA亞型和其它的激肽釋放酶(如血清KLK2) ; (II)DNA生物標(biāo)志物，包括一些表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物(如GSTPi甲基化)，基因融合(如TMPRSS2:ERG融合)和雜合性缺失等；(III)RNA生物標(biāo)志物，如非編碼的前列腺特異的RNA PCA3 (曾被稱為DD3)和α -甲基?；o酶A消旋酶(Alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)mRNA在前列腺癌中的表達(dá)；(IV)蛋白分子標(biāo)志物，如 PSA,前列腺特異膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA),前列腺干細(xì)胞抗原(prostatestem cell antigen, PSCA) [14]等。盡管許多候選的生物學(xué)標(biāo)志物在不斷地被發(fā)現(xiàn)，尚無新的指標(biāo)和方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)。miRNAs是一種新的不編碼蛋白的內(nèi)源性小RNAs，它們通過抑制蛋白質(zhì)翻譯過程在細(xì)胞增殖、凋亡以及分化等生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過miRNAs微列陣、Northern blot和實(shí)時(shí)PCR等手段,在多種類型人腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些miRNAs表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的現(xiàn)象。有研究報(bào)道了 miRNA在乳腺癌和肝癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，人血漿和血清中存在其它組織來源的miRNAs，它們可以以一種可抵抗內(nèi)源性RNA酶活性的形式存在。測(cè)定血漿或血清中腫瘤來源miRNAs的含量可以作為腫瘤檢測(cè)的手段之一。近年有研究者報(bào)道從血清和其它一些體液中miRNA的水平可以診斷一些處于早期的疾病。2008年Mitchell報(bào)道，miR-141在前列腺癌組患者血清中比對(duì)照組高46倍，而且其靈敏度為60%，特異性為100%。對(duì)于血清中miRNAs的深入研究可為尋找疾病生物標(biāo)志物提供新的獨(dú)特視角。有研究報(bào)道，miR-222在肝癌、胰腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤等大部分人類腫瘤中頻繁高表達(dá)。它通過靶向作用于抑癌基因如p27、p57，PTEN，前凋亡因子Bim、Bmf等，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。目前的研究結(jié)果提示miRNA-222可能是一種致癌miRNA，在人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展階段扮演著至關(guān)重要的角色
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)血液中miR-222的試劑在制備用于前列腺癌血清學(xué)診斷的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明利用我們發(fā)明的異種移植模型和新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移前列腺癌異種移植組織系中miRNAs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了深入的研究，初步發(fā)現(xiàn)miR — 222與前列腺癌的惡性程度相關(guān)(ffatahiki et al. , PLOS One 2011)。我們優(yōu)化了從血清中提取miRNA的方法以及用實(shí) 時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA的方法；整理和收集了百余份前列腺癌患者的病理資料和血清樣本；對(duì)用異種移植模型篩選出的在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織中上調(diào)的19個(gè)miRNA序列進(jìn)行了臨床血清樣本的檢測(cè)，揭示了 miR —222在前列腺癌患者血清中和組織中含量明顯升高。該發(fā)明對(duì)開發(fā)中國人群前列腺癌的血清學(xué)臨床診斷方案中具有重要的應(yīng)用前景。本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)血液樣品中微小RNA miR-222及其前體的試劑在制備用于對(duì)對(duì)象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對(duì)微小RNAmiR-222及其前體具有特異性的試劑，具體是對(duì)miR-222及其前體有檢測(cè)特異性的PCR引物和探針以及利用該探針制備的基因芯片。所述miR-222的序列如SEQ ID NO 1所示；在一個(gè)優(yōu)選例中，所述特異性引物選自SEQ ID NO: 2所示序列；在一個(gè)優(yōu)選例中，所述特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。本發(fā)明通過檢測(cè)血液中miR-222的含量來診斷對(duì)象是否患有前列腺癌。在一個(gè)優(yōu)選例中，通過實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)miR-222進(jìn)行測(cè)定，包括(I)提取對(duì)象血液樣品中的RNA，并添加人工合成的線蟲miR-39寡聚核苷酸作為參照物；(2)利用反轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA ；(3)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)樣品中miR-222的含量；(4)用線蟲miR-39的含量作為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如果對(duì)象血清中miR — 222含量與正常對(duì)照組相比明顯升高，則診斷該對(duì)象罹患前列腺癌。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)象血液中微小RNA miR-222或其前體的水平高于對(duì)照血清中的水平，則提示所述對(duì)象罹患前列腺癌。其次，本發(fā)明同時(shí)提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，該試劑盒檢測(cè)的目標(biāo)核酸為具有SEQ ID NO 1所示多核苷酸序列的miR-222，具體包括(I)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；包括熱啟動(dòng)Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應(yīng)緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR-222特異性引物；在一個(gè)優(yōu)選例中，所述miR-222特異性引物選自SEQIDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’(SEQIDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果利用本試劑盒中提供的試劑，結(jié)合本領(lǐng)域研究人員熟知的RNA提取試劑和通用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑，本發(fā)明可以特異性地檢測(cè)血清中miR-222的含量，有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。


圖I為內(nèi)參miRNA和目的miRNA的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線，可見溶解曲線均為單峰，無非特異性峰出現(xiàn)；圖2為qRT-PCR檢測(cè)miR-222在正常人和前列腺癌患者血清中的表達(dá)量柱高=x—+SE ；圖3為miR-222在前列腺癌患者血清中相對(duì)表達(dá)量ROC曲線分析。圖4 為前列腺組織的 miR_222FISH 照片(200X)A:Normal prostate B :PCa_l(gleason score :6 分)C :PCa_2 (gleason score :9 分X
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I本發(fā)明首先提供了一種檢測(cè)血液樣品中微小RNA miR-222及其前體的試劑在制備用于對(duì)對(duì)象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對(duì)微小RNAmiR-222 (如SEQ ID NO 1所示)及其前體具有特異性的試劑，具體是對(duì)miR-222及其前體有檢測(cè)特異性的PCR引物和探針及使用該探針制備的基因芯片。所述的特異性引物選自SEQ ID NO:2所示序列；所述的特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。實(shí)施例2、前列腺癌診斷試劑盒本發(fā)明所述試劑盒檢測(cè)的目標(biāo)核酸為具有SEQ ID NO :I所示多核苷酸序列的miR-222，具體包括(I)聚合酶鏈反應(yīng)試劑；包括熱啟動(dòng)Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應(yīng)緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR-222特異性引物；在一個(gè)優(yōu)選例中，所述miR-222特異性引物選自SEQIDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’ (SEQIDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。實(shí)施例3、診斷效果實(shí)驗(yàn)I、利用我們發(fā)明的異種移植模型(即將前列腺癌組織移植到免疫缺欠小鼠的腎包膜中，所得到的組織系與臨床腫瘤的病理特征高度相關(guān))和新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性前列腺癌異種移植組織系(來自于同一個(gè)前列腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本)中miRNAs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了深入的研究。通過比較我們鑒定出104個(gè)表達(dá)差異的miRNAs，除了一些已知的miRNAs和它們的異型體(isomiRs),還有一部分是尚未被發(fā)現(xiàn)的新的miRNAs。其中21個(gè)miRNAs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，5個(gè)miRNAs已經(jīng)被報(bào)道在前列腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，這也從側(cè)面證明了我們采用的研究手段的有效性。除了那些已經(jīng)被證明和前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs外，我們還發(fā)現(xiàn)了 36個(gè)迄今為止尚未被報(bào)道的miRNAs (ffatahiki etal.，PLOS One 2011)，這其中可能存在著潛在的可作為中國人群前列腺癌患者血清學(xué)生物標(biāo)志物的miRNAs。2、血清中微量miRNA的提取由于miRNA在血清中的含量很少，在實(shí)驗(yàn)前期，我們參閱了大量的文獻(xiàn)，嘗試了純化柱試劑盒提取法和液相Trizol提取法提取miRNA。發(fā)現(xiàn)Trizol法提取的miRNA的量和純度更好一些(miRNA的蛋白含量及鹽分含量更少)。在用Trizol法中我們進(jìn)行了兩方面的優(yōu)化(I)血清中含蛋白量較多，可以加大Trizol的含量，以使所含的蛋白質(zhì)得到充分的變性；并用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行多次抽提，以將所含的蛋白質(zhì)進(jìn)行充分的去除；(2)因?yàn)閙iRNA分子量很小,在加入異丙醇沉淀這步中，不容易沉淀下來,可以適量的延長(zhǎng)沉淀時(shí)間，以使miRNA充分的沉淀下來增加miRNA的得率。3、血清中微量miRNA的檢測(cè)方法
米用All-in-One miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)miRNA的特點(diǎn)和PCR擴(kuò)增原則，采用所發(fā)明的試劑盒在MJ Opticon II定量PCR儀上檢測(cè)miR-222和線蟲miR-39的含量。miRNA的相對(duì)表達(dá)量使用2_Δ "ct法計(jì)算。4、檢測(cè)在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs在前列腺癌患者血清中的含量(I)我們對(duì)天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供的百余份臨床資料和病人病歷信息等進(jìn)行了整理工作，篩選出了 28例正常人，49例高分級(jí)(7-9分)前列腺癌患者病歷，13例低分級(jí)前列腺患者病歷，并取得其血液樣本。(2)對(duì)這些臨床樣本進(jìn)行miRNA提取，QRT-PCR檢測(cè)得到如下結(jié)果從所收集的血清樣品中提取RNA，利用特異于miR — 222的PCR引物，采用反轉(zhuǎn)錄一實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)該miRNA的表達(dá)水平。所使用的PCR引物能夠特異、有效地?cái)U(kuò)增待檢測(cè)序列(圖I)。所得到的數(shù)據(jù)用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，miR-222在前列腺癌患者血清中表達(dá)升高(圖2)。表ImiR - 222在正常組和前列腺癌組血清中的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)
組別NumberRelative amountP-value (PCavs
權(quán)利要求
1.檢測(cè)血液樣品中微小RNAmiR-222及其前體的試劑在制備用于對(duì)對(duì)象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑是對(duì)微小RNA miR-222及其前體具有特異性的試劑，具體是對(duì)miR-222及其前體有檢測(cè)特異性的PCR引物和探針以及利用該探針制備的基因芯片。
2.如權(quán)利要求I中所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-222的序列如SEQID NO 1所
3.一種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒檢測(cè)的目標(biāo)核酸為具有SEQ IDNO I所示多核苷酸序列的miR-222,具體包括 (1)聚合酶鏈反應(yīng)試劑； (2)miR-222特異性引物，如SEQ ID NO:2所示; (3)線蟲miR-39參照寡核苷酸序列，如SEQIDNO: 3所示； (4)線蟲miR-39特異性引物，如SEQIDN0:4所示； (5)熒光染料SYBR-GREEN I ； (6)使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微小RNA(miR-222，如SEQ ID NO1所示)在前列腺癌血清學(xué)診斷試劑盒中的應(yīng)用，具體涉及檢測(cè)血液樣品中miR-222的試劑在制備用于對(duì)象前列腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑是對(duì)微小RNAmiR-222及其前體具有特異性的試劑，具體是對(duì)miR-222及其前體有檢測(cè)特異性的探針和PCR引物。本發(fā)明還涉及一種前列腺癌診斷試劑盒，包括聚合酶鏈反應(yīng)試劑；miR-222特異性引物；線蟲miR-39參照寡核苷酸序列；線蟲miR-39特異性引物；熒光染料SYBR-GREEN1；使用說明書。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)象血液中miR-222或其前體的水平高于對(duì)照血清中的水平，則提示所述對(duì)象罹患前列腺癌，該試劑盒可有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816862SQ20121035168
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者王玉琢, 石建黨, 張琚, 成颯, 楊闊, 杜小玲, 原輝, 徐勇, 羅飛 申請(qǐng)人:南開大學(xué)