專利名稱：鮑魚內(nèi)臟多糖替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然高分子領(lǐng)域，具體地涉及鮑魚內(nèi)臟多糖替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鮑魚(Haliotis spp.)屬軟體動(dòng)物門，腹足綱,原始腹足目，鮑科,鮑屬，為藻食性動(dòng)物，是我國(guó)傳統(tǒng)的海珍品，其氨基酸含量全面、脂肪和膽固醇的含量很低，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。鮑魚內(nèi)臟占鮑魚總重的15 25%，作為鮑魚加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，利用價(jià)值極低，亟待開發(fā)其高值化利用方法，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，促進(jìn)鮑魚養(yǎng)殖行業(yè)的良性持續(xù)發(fā)展。鮑魚內(nèi)臟多糖是鮑魚內(nèi)臟的主要組成部分，其結(jié)構(gòu)受鮑魚種類和生長(zhǎng)環(huán)境而有所不同。近年來(lái)，有研究報(bào)道從大連產(chǎn)鮑魚內(nèi)臟中提取的鮑魚內(nèi)臟多糖其具有抗腫瘤，提高機(jī)體免疫力，抗氧化等多種生理活性；而從青島產(chǎn)鮑魚內(nèi)臟中提取的鮑魚內(nèi)臟多糖具有改善 四氯化碳致急性肝損傷大鼠的肝功能等活性。伴隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和人工臟器工學(xué)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量要求越來(lái)越高。而大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)離不開血清，目前培養(yǎng)基中使用的血清主要來(lái)源于小?；蛱ヅ?，不僅價(jià)格昂貴，而且其成分復(fù)雜，含有激素類物質(zhì)，易受到細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒等的污染，特別是近年來(lái)動(dòng)物源性疾病，如瘋牛病、口蹄疫等病毒性疾病的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，，因此血清成為細(xì)胞培養(yǎng)工學(xué)和人工臟器工學(xué)發(fā)展的瓶頸，急需一種安全可靠的血清替代物，以解決上述問(wèn)題。本發(fā)明涉及到一種來(lái)源于鮑魚內(nèi)臟的多糖，其替代血清用于細(xì)胞培養(yǎng)，為血清替代物及組織工學(xué)研究提供新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是在于需要提供一種用于替代血清的活性物質(zhì)，其在保證不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)的條件下，不會(huì)帶來(lái)任何不良作用，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)上的不足。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種鮑魚內(nèi)臟多糖替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中應(yīng)用，鮑魚內(nèi)臟多糖可替代血清保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)不良作用。所述的鮑魚內(nèi)臟多糖組成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鮑魚內(nèi)臟多糖主鏈結(jié)構(gòu)中含有一3)-β -D-GlcpA-(I — 4)-a -L-Rhap-(3S04)-(I —，一 3) - β -D-GlcpA-(l — 4)-α -L-Rhap-(2S04)-(1 —兩種結(jié)構(gòu)單元，兩種單元數(shù)量比例為2:1。進(jìn)一步，所述的鮑魚內(nèi)臟多糖在細(xì)胞培養(yǎng)基中替代部分血清。


附圖I細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定鮑魚內(nèi)臟多糖對(duì)總細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響。附圖2MTT法測(cè)定鮑魚內(nèi)臟多糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響a鮑魚內(nèi)臟多糖加樣24h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響；b鮑魚內(nèi)臟多糖加樣48h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，c鮑魚內(nèi)臟多糖加樣72h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，其中柱狀圖上的*表示與正常組相比差異顯著。附圖3不同鮑魚內(nèi)臟多糖濃度梯度添加對(duì)替代血清的影響a鮑魚內(nèi)臟多糖濃度梯度添加24h后對(duì)替代血清的影響；b鮑魚內(nèi)臟多糖濃度梯度添加48h后對(duì)替代血清的影響，其中柱狀圖上的#表示與10%血清組相比，差異顯著；*表示與2%血清組相比，差異顯著;附圖4血清及鮑魚內(nèi)臟多醣梯度添加對(duì)替代血清的影響
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。但本發(fā)明的技術(shù)方案不受實(shí)施例任何形式的限制。 實(shí)施例I鮑魚內(nèi)臟多糖的制備將干鮑魚內(nèi)臟磨粉，加入O. IM乙酸鈉緩沖溶液(pH6. 0),0. I倍樣品質(zhì)量的木瓜蛋白酶、5mM EDTA溶液和5mM半胱氨酸溶液，于60°C水浴下攪拌反應(yīng)24h之后，反應(yīng)混合物離心獲得上清液，即鮑魚內(nèi)臟酶解液，隨后向上清液中加入終濃度為10%的陰離子表面活性劑溶液，室溫下放置24小時(shí)后，離心，棄上清，沉淀溶解于3MNaCl和乙醇以體積比為100 15的混合溶液中，再加入2倍體積的95%乙醇溶液，4°C放置24小時(shí)，離心，沉淀用80%和95%乙醇洗2-3次，最后將沉淀于60°C干燥2小時(shí)，蒸餾水溶解，用透析袋透析并脫鹽，濃縮，凍干，得鮑魚內(nèi)臟粗多糖；隨后鮑魚內(nèi)臟粗多糖經(jīng)過(guò)DEAE-52陰離子交換層析和S-200凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行分離純化，得到的物質(zhì)即為所述鮑魚內(nèi)臟多糖。通過(guò)化學(xué)分析和光譜分析確定本發(fā)明中的鮑魚內(nèi)臟臟多糖成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述鮑魚內(nèi)臟多糖主鏈有一3) - β -D-GlcpA-(I — 4) - a -L-Rhap- (3S04)-(I —，一 3)-β-D-GlcpA-(I — 4)-α-L-Rhap-(2S04)_ (I —兩種結(jié)構(gòu)單元，兩種結(jié)構(gòu)單元數(shù)量比例為2:1實(shí)施例2鮑魚內(nèi)臟多糖對(duì)H印G2細(xì)胞的增殖作用(I)細(xì)胞計(jì)數(shù)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)制成密度為5 X IO4個(gè)iL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，IOOyL/孔。待24h貼壁后加入 200 μ L/ 孔的濃度分別為 50 μ g · mL—1,100 μ g · mL—1, 200 μ g · mL—1 和 400 μ g · mL—1多糖的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加等量不含多糖的完全培養(yǎng)基。在37、5%C02條件下培養(yǎng)24h后，用IX-51型倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。(2) MTT 法測(cè)定將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞，用RPMI - 1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)制成密度為2 X IO4個(gè)iL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，IOOyL/孔。待24h貼壁后更換成濃度分別為50、100、200和400 μ g · mL—1多糖的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，200 μ L/孔?？瞻讓?duì)照組加等量不含多糖的完全培養(yǎng)基。37°C、5%C02條件下分別培養(yǎng)24h、48h和72h后，棄去培養(yǎng)基，加入MTT液(PBS液配制，終濃度為O. 5mg · mL—1)。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，加入酸化異丙醇，吹打至藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570nm各孔吸光度(A)0 MTT/%=A570 (樣品組)/A570 (空白對(duì)照組)X 100%。(3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見圖I和圖2a、2b、2c，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，鮑魚內(nèi)臟多糖組的總細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯高于空白對(duì)照組；MTT數(shù)據(jù)也表明鮑魚內(nèi)臟多糖處理組細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組，兩組數(shù)據(jù)均且呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)無(wú)副作用，且具有一定的細(xì)胞增殖效果。實(shí)施例3不同鮑魚內(nèi)臟多糖濃度梯度添加對(duì)替代血清的影響(I)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞布板方式如實(shí)施例I。待24h貼壁后更換為含2%血清，濃度分別為50、20和IOyg- ml/1鮑魚內(nèi)臟多糖的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，200 μ L/孔。分別以加等量含 10%血清的完全培養(yǎng)基組為空白對(duì)照組，加等量的含2%血清濃度的培養(yǎng)基組作為模型組。37°C、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24h和48h，測(cè)定各組細(xì)胞存活率。(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見圖3a、3b，2%血清處理組細(xì)胞存活率低于正常組，加入鮑魚內(nèi)臟多糖后，細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)顯著的增加，且呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)多糖濃度降低到10 μ g -mL-1時(shí)，仍表現(xiàn)出促細(xì)胞增殖活性，增殖效率接近于正常組。以上結(jié)果顯示，在含2%牛血清培養(yǎng)基中，鮑魚內(nèi)臟多糖在IOyg 添加量時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖與10%血清相當(dāng)，可替代8%牛血清。實(shí)施例4血清及多糖梯度添加對(duì)替代血清的影響(I)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞布板方式如實(shí)施例I。待24h貼壁后更換為含2%、4%、6%和8%血清且對(duì)應(yīng)多糖含量分別為的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，200 μ L/孔。分別以加等量含10%血清的完全培養(yǎng)基組和對(duì)應(yīng)血清含量組為空白對(duì)照組。37°C、5%C02條件下分別培養(yǎng)48h，測(cè)定各組細(xì)胞存活率。(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 17. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，以P < O. 05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見圖4，與10%血清處理組相比，單純的血清梯度遞減的細(xì)胞存活率呈現(xiàn)梯度減小的趨勢(shì)，但鮑魚內(nèi)臟多糖在10、8、6、4μ g .mL-1添加量，血清含量分別為2%、4%、6%和8%時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖與10%血清相當(dāng)，細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常。說(shuō)明10、8、6、4μ gmr1的鮑魚內(nèi)臟多糖分別可以替代8%、6%、4%和2%的血清，用于細(xì)胞培養(yǎng)。所有上述的首要實(shí)施這一知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并沒(méi)有設(shè)定限制其他形式的實(shí)施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用這一重要信息，上述內(nèi)容修改，以實(shí)現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權(quán)利。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等 效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種鮑魚多糖替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用，該鮑魚內(nèi)臟多糖組成成分包括鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖，所述的鮑魚內(nèi)臟多糖主鏈結(jié)構(gòu)中含有一3)-β -D-GlcpA-(I -4)-α -L-Rhap- (3S04) _ (I —，一 3) - β -D-GlcpA-(I — 4) _ a -L-Rhap- (2S04) - (I —兩種結(jié)構(gòu)單元，兩種單元數(shù)量比例2:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鮑魚多糖替代血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用，其特征在于鮑魚內(nèi)臟多糖在細(xì)胞培養(yǎng)基中的替代部分血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鮑魚內(nèi)臟多糖代替血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的應(yīng)用，在細(xì)胞培養(yǎng)基中該鮑魚內(nèi)臟多糖可以代替部分血清，且能維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，無(wú)毒副作用。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102839149SQ20121035183
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者王玉明, 武風(fēng)娟, 薛勇, 李兆杰, 王靜鳳, 常耀光, 徐杰, 唐慶娟, 薛長(zhǎng)湖 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)