專利名稱：一種脂肪肉瘤鑒別診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用DDIT3熒光探針制備的熒光原位雜交檢測的試劑盒，還涉及其DDIT3熒光探針的制備方法，本發(fā)明的DDIT3熒光探針及相應(yīng)的試劑盒可用于脂肪肉瘤的鑒別診斷。
背景技術(shù)：
脂肪肉瘤(Iiposarcomas)是一種常見的惡性軟組織腫瘤,起源于脂肪母細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的間葉細(xì)胞，故表現(xiàn)為不同分化程度的異型脂肪母細(xì)胞，均含有脂質(zhì)。根據(jù)細(xì)胞成分的不同，脂肪肉瘤又可分為①高分化脂肪肉瘤，也稱脂肪瘤樣脂肪肉瘤粘液型脂肪肉瘤；③圓細(xì)胞型脂肪肉瘤；④多形型脂肪肉瘤；⑤未分化型脂肪肉瘤，但腫瘤中通常·是多型細(xì)胞混合存在。本病多見于30 70歲患者，以50歲左右發(fā)病最多。男性多于女性。四肢特別是大腿、臀部好發(fā)，上肢、腹膜后、頭、頸塊，直徑3 IOcm多見，后腹膜巨大者直徑可達(dá)20cm以上，腫瘤常為結(jié)節(jié)狀，或分葉狀，質(zhì)軟或稍硬。本病進(jìn)展相對緩慢，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除可延長病人生命。分化型及粘液型脂肪肉瘤預(yù)后較好，5年生存率可達(dá)80%左右，多形型、圓細(xì)胞型、去分化型脂肪肉瘤預(yù)后差，5年生存率20% 50%。轉(zhuǎn)移以血行轉(zhuǎn)移為主，多轉(zhuǎn)移到肺。肉瘤分類與臨床預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)，對于患者的治療非常重要。尤因肉瘤(Ewing sarcoma)和橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)對長春新喊/放線菌素D/環(huán)憐酰胺加異環(huán)磷酰胺/依托泊苷反應(yīng)效果好。滑膜肉瘤對阿霉素和異環(huán)磷酰胺反應(yīng)效果好，而黏液樣脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)優(yōu)先與 trabectedine (ET-743, Yondelis,PharmaMar與Johnson&Johnson藥廠研發(fā))反應(yīng)。臨床需要將脂肪肉瘤與惡性纖維組織細(xì)胞瘤中的普通型和粘液型以及橫紋肌肉瘤中的多形型進(jìn)行鑒別。一般認(rèn)為惡性纖維組織細(xì)胞瘤，來源于未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，并分化為纖維細(xì)胞和組織細(xì)胞，是最常見的軟組織惡性腫瘤之一。橫紋肌肉瘤是軟組織肉瘤中惡性程度較高的，按多形性、胚胎性和腺泡性的順序惡性程度依次增高。橫紋肌肉瘤是小兒軟組織肉瘤中最多見的一種，占小兒惡性實(shí)體瘤的10%。橫紋肌肉瘤是20歲以下病人軟組織中最常見的肉瘤。目前進(jìn)行脂肪肉瘤鑒別診斷主要依靠病理學(xué)診斷。但因大約10%的肉瘤處于低分化，依靠傳統(tǒng)的組織和免疫學(xué)方法無法分類，結(jié)果使患者很難得到最佳的治療。如，惡性纖維組織細(xì)胞瘤與多形性脂肪肉瘤的鑒別診斷，后者無分層改變，但有成脂細(xì)胞和脂細(xì)胞的分化。在惡性纖維組織細(xì)胞瘤中也可能存在胞漿內(nèi)空泡，但在成脂細(xì)胞中，空泡能向細(xì)胞核和周圍轉(zhuǎn)移，并使核變平，另外，在惡性纖維組織細(xì)胞瘤細(xì)胞形成的空泡中含有粘多糖物質(zhì)。由于兩種腫瘤(前者和多形性脂肪肉瘤)的脂質(zhì)染色均為陽性，故對鑒別診斷無任何意義。手術(shù)中橫紋肌肉瘤的形態(tài)無明顯特征，很像高度軟組織肉瘤。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，在軟組織腫瘤中已經(jīng)鑒別出許多遺傳改變，這成為了腫瘤輔助診斷和分類的新的生物標(biāo)志物，對于祀向治療也產(chǎn)生積極意義。[AD Singhi, EA Montgomery. Liposarcomas. SurgicalPathology Clinics, Volume 4, Issue 3, Pages 963-994 ；Aatur D. Singhi, ElizabethA.MontgomeryKrikelis D，Judson1. Role of chemotherapy in the management of softtissue sarcoma. Expert RevAnticancer Ther. 2010 ；10 :249-60. PMID :20132000. doi 10. 1586/era. 09. 176 ；Grier HE,Krailo MD,Tarbell NJ et al. Addition of ifosfamideand etoposide to standard chemotherapy for Ewing ! s sarcoma and primitiveneuroectodermal tumor of bone. N Engl J Med. 2003 ；348 :694-701 Ruymann FBiGrovasAC. Progress in the diagnosis and treatment of rhabdomyosarcoma and relatedsoft tissue sarcomas. Cancer Invest.2000 ； 18 :223-41 ；Sleijfer S，Ouali M，vanGlabbeke M et al. Prognostic and predictive factors for outcome to first-lineifosfamide-containing chemotherapy for adult patients with advanced softtissue sarcomas An exploratory, retrospective analysis on large series fromthe European Organization for Research and Treatment of Cancer-Soft Tissue andBone Sarcoma Group(E0RTC-STBSG).Eur J Cancer. 2010 ；46 :72-83 ；Alffedo L.Valente，Jamie Tull, Shengle Zhang. Utility of fluorescence in situ hybridization insub-classifying unclassified high-grade sarcomas A study of 40cases usingbreak-apart probes of EWSRl，F(xiàn)0X01A，SS18 andDDIT3 genes. Journal of Solid Tumors， April 2012，Vol. 2，No. 2 :4_9]DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(DNAdamage inducible transcript 3，DDIT3，也叫 CHOP)位于12號染色體長臂I區(qū)3帶，與其相關(guān)的染色體重排在黏液樣脂肪肉瘤(MLS)、圓細(xì)胞脂肪肉瘤(round cell liposarcomas,RCLS)和混合型脂肪肉瘤(mixed liposarcomas)中常見。而其中的一種易位t(12;16)(ql3;pll)被認(rèn)為是上述類型脂肪肉瘤的核型標(biāo)志，出現(xiàn)在超過95%的病例中。這個易位形成FUS/DDIT3融合蛋白；在少數(shù)病例中也發(fā)現(xiàn)t (12 ;22) (ql3 ；ql2)染色體易位，形成EWS/DDIT3融合蛋白。FUS/DDIT3融合基因的出現(xiàn)對于MLS是敏感和特異的指標(biāo)。在其他形態(tài)學(xué)上相似的腫瘤中不出現(xiàn)，如腹膜后粘液變?yōu)橹鞯母叻只救饬龊驼骋豪w維肉瘤。[Downs-Kelly, Erinn DO, Goldblum, John R. et, al. TheUtility of Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)in the Diagnosis of MyxoidSoft Tissue Neoplasms. American Journal of Surgical Pathology. 2008. 32(1) :8-13;]綜上，DDIT3重排作為MLS、RCLS及混合型脂肪肉瘤的特異標(biāo)志，有望成為腫瘤鑒別診斷的生物標(biāo)志物。但該基因的檢測方法目前僅停留在試驗(yàn)室階段，國內(nèi)市場無靈敏度高、特異性好的檢測試劑。熒光原位雜交技術(shù)基于堿基互補(bǔ)原則，用已知序列標(biāo)記DNA探針與載玻片上的待測DNA/RNA互補(bǔ)雜交，在熒光顯微鏡下檢測雜交信號判斷結(jié)果。FISH技術(shù)將細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)改變聯(lián)系起來，讓微小的基因改變顯現(xiàn)于肉眼之下，拓展了細(xì)胞遺傳學(xué)檢測的范圍，顯著提高了其識別異常染色體的能力。目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究中的基因擴(kuò)增、易位重排及缺失等檢測。本發(fā)明利用熒光原位雜交技術(shù)，以DDIT3基因斷裂區(qū)兩端為靶標(biāo)，分別設(shè)計并制備熒光探針。利用探針實(shí)現(xiàn)對DDIT3基因重排的檢測，有助于脂肪肉瘤的鑒別診斷，通過準(zhǔn)確診斷，達(dá)到及時準(zhǔn)確治療的目的。本發(fā)明提供了一種脂肪肉瘤分子標(biāo)志物DDIT3探針的制備方法，并在此基礎(chǔ)上利用探針自主研制了 DDIT3基因斷裂檢測試劑盒，填補(bǔ)了國內(nèi)該檢測領(lǐng)域的空白，具有十分重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供DDIT3基因探針(GSP DDIT3)的制備方法。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，GSP DDIT3的制備步驟包括(I)克隆篩選通過NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有DDIT3(12ql3)基因斷裂區(qū)兩側(cè)的克隆，并對這些克隆進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)的克隆。(2)克隆培養(yǎng)和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買相應(yīng)的克隆(InvitrogenRPCIlL C)，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中 搖菌培養(yǎng)8 12小時；針對DDIT3基因探針使用相應(yīng)的STS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，從而完成待選克隆的鑒定。(3)基因探針制備對鑒定陽性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提??；通過OD值的測定對質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量；然后，對質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化；獲得探針，避光、-20±5°C儲存。(4)基因探針驗(yàn)證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，克隆篩選步驟中含有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端最優(yōu)選的克隆，編號為 RPll_1077C21(chrl2 :57658810. . 57865820)和 CTD-2554015 (chrl2 57939268. · 58154978)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，RP11-1077C21克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的STS引物對序列為上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’ (SEQ ID NO :1)和下游引物5’ -CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’ (SEQ ID NO 2) ;PCR 擴(kuò)增條件為94°C 5 分鐘；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X35循環(huán)；72°C 7分鐘。CTD-2554015克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的 STS 引物對序列為上游引物 5’ -GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’ (SEQ ID NO 3)和下游引物 5’ -ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’ (SEQ ID NO 4) ;PCR 擴(kuò)增條件為94°C 5 分鐘；(940C 30 秒，58 0C 30 秒，72 °C 45 秒)X 35 循環(huán)；72°C 7 分鐘。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA提取可使用市售的質(zhì)粒提取試劑盒，優(yōu)選Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中克隆質(zhì)粒DNA的定量是將質(zhì)粒DNA稀釋后分別測定260nm和280nm下的吸光度，計算產(chǎn)物濃度。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，探針制備步驟中質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記可以使用切口平移方法標(biāo)記，利用DNaseI和DNA聚合酶I實(shí)現(xiàn)基因探針的熒光標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，50 μ I切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U間，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU間，標(biāo)記條件為16°C 2小時。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的dUTP，并優(yōu)選 Spectrum dUTP。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案，探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用I
2μ I滅菌純化水或Human Cot-1DNA (I μ g/ μ I)溶解沉淀。本發(fā)明的另一個目的是利用DDIT3基因探針制備一種用于輔助脂肪肉瘤鑒別及治療選擇的DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，我們采用了以下技術(shù)方案(I)樣本處理和制片按照原位雜交方法對各類型樣本進(jìn)行處理。(2)雜交配制雜交液，主要包括標(biāo)記探針和雜交緩沖液。合適溫度下進(jìn)行8 16小時的雜交，然后以合適的洗液洗去未結(jié)合上的和非特異結(jié)合的探針；DAPI復(fù)染劑復(fù)染。(3)通過熒光顯微鏡相應(yīng)濾塊觀察熒光信號，對不同信號進(jìn)行觀察計數(shù)?；谝陨霞夹g(shù)方案發(fā)明的試劑盒包括1)雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物、未標(biāo)記的競爭性DNA，DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSCjt酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為O. lg/ml。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，熒光標(biāo)記探針混合物包括GSP DDIT3斷裂探針， 每人份熒光標(biāo)記探針混合物中探針的使用量為1. O μ I。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，由雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物和未標(biāo)記的競爭性DNA配制雜交液，其中未標(biāo)記的競爭性DNA選擇Human C0T-1DNA。每人份雜交液中加入7 μ I雜交緩沖液，I μ I熒光標(biāo)記探針混合物，Human C0T-1DNA使用量為I μ g，并用H2O 補(bǔ)至 10 μ I。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中DAPI復(fù)染劑配制方法為50 250ng DAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS,甘油混合液)。利用本發(fā)明的試劑盒，依照常規(guī)的熒光原位雜交方法對人的中期和間期細(xì)胞進(jìn)行信號計數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)(I)實(shí)現(xiàn)了對子肉瘤樣本中分子標(biāo)志物DDIT3基因狀態(tài)的檢測；(2)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的信號計數(shù)、且結(jié)果重復(fù)性好；(3)無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和制備高質(zhì)量的中期染色體片，可用于中期或間期細(xì)胞信號計數(shù)，操作相對簡單；(4)通過制備成試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，有助綜合評價各分子標(biāo)志物，了解其與腫瘤發(fā)生等的聯(lián)系。


圖1顯示GSP DDIT3近著絲粒端克隆鑒定的電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物138bps。其中I道為marker, 2道為樣本；箭頭標(biāo)示代表lOObp。圖2顯示GSP DDIT3近端粒端克隆鑒定的電泳結(jié)果。目的產(chǎn)物312bps。其中I道為marker, 2道為樣本；箭頭標(biāo)示代表300bp。圖3顯示人類外周血淋巴細(xì)胞中期染色體上GSP DDIT3(紅色/綠色)檢測結(jié)果。圖4顯示人類外周血淋巴細(xì)胞間期細(xì)胞核中GSP DDIT3(紅色/綠色)檢測結(jié)果。圖5顯示脂肪肉瘤組織樣本中GSP DDIT3(紅色/綠色)的檢測結(jié)果。其中箭頭分別指示出兩色探針的熒光信號。
圖6顯示DDIT3基因所在12ql3區(qū)段。
具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1:GSP DDIT3探針的制備(I)引物設(shè)計克隆篩選DDIT3基因位于人染色體12ql3區(qū)段，NCBI Mapview數(shù)據(jù)庫檢索所有含有DDIT3基因的克隆，篩選出基因斷裂端兩邊的克隆，編號為RP11-1077C21和CTD-2554015。(參見附圖6)(2)克隆培養(yǎng)和鑒定購買克隆，分別取100μ I克隆菌液加入至500ml的TB培養(yǎng)液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養(yǎng)8 12小時；RP11-1077C21菌液使用上游引物 5’ -CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3 和下游引物 5’ -CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’ 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C 5分鐘；(94 °C 30秒，55 °C 30秒，72°C 45秒)X35循環(huán)；72°C 7分鐘。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，結(jié)果在138bps具有明亮的條帶(參見附圖1)。CTD-2554015 菌液使用上游引物 5’ -GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’ 和下游引物5’ -ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增條件為94°C 5 分鐘；(94°C 30秒，58 0C 30 秒，72 0C 45 秒)X 35 循環(huán)；72°C 7 分鐘。(3)基因探針制備鑒定陽性的菌液,使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照說明書要求的操作方法進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質(zhì)粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ I) = 0D260 X 50 (ng/ μ I)計算質(zhì)粒DNA濃度。通過切口平移方法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行突光標(biāo)記，探針標(biāo)記的突光素為SpectrumdUTP,分別選擇orange-dUTP和green-dUTP標(biāo)記DDIT3基因兩端探針。按如下方案，嚴(yán)格避光條件下在冰上配制PCR反應(yīng)體系。
組分加入量
IOxDNA聚合酶I buffer 50.5 mM dTTPI
I mM d3TPI
DNA 聚合酶 I lOU/μΙI
DNase I 0.001 U/μΙ5
0.2 mM orange/green-dUTP 2.5 μ 模板I Kg
水補(bǔ)足50μ1配完后震蕩混勻，16°C標(biāo)記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制
標(biāo)記產(chǎn)物45μ1
Human Cot-1 DNA5μ1
醋酸鈉(3mol/L)5μ1
無水乙醇125μ1混勻后置于-80°C冰箱中2小時，4°C 12000rpm離心20分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避熒光標(biāo)記探針混合物雜交緩沖液HumanCOT-1 DNA (Img/ml)H2O
光干燥。使用I μ I滅菌純化水溶解沉淀，獲得DDIT3基因探針，避光、-20°c儲存。(4)DDIT3基因探針驗(yàn)證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細(xì)胞或中期染色體上均可見熒光信號。實(shí)施例2 DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒制備以10人份/盒為例。(I)雜交液配制將標(biāo)記好的探針依次放好，按下表方案配制熒光標(biāo)記探針混合物
權(quán)利要求
1.一種輔助脂肪肉瘤鑒別診斷及治療選擇的DDIT3基因重排熒光原位雜交檢測試劑盒，包括1)雜交緩沖液、熒光標(biāo)記探針混合物、未標(biāo)記的競爭性DNA、DAPI復(fù)染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標(biāo)記探針混合物包含GSP DDIT3斷裂探針，每人份熒光標(biāo)記探針混合物中GSP DDIT3探針的使用量為1. O μ I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于未標(biāo)記的競爭性DNA為HumanC0T-1DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為O. lg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征還在于DAPI復(fù)染劑配制方法為50 250ngDAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS，甘油混合液)。
5.一種制備權(quán)利要求1試劑盒所述DDIT3基因重排檢測基因探針的方法 (1)片段篩選通過NCBIMapview數(shù)據(jù)庫檢索所有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端的克隆，并對這些克隆進(jìn)行篩選，選擇含有DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端區(qū)域的最優(yōu)克隆，編號為RP11-1077C21 和 CTD-2554015 ； (2)培養(yǎng)鑒定按照DDIT3篩選確定的克隆編號購買克隆，常規(guī)培養(yǎng)，使用針對DDIT3基因斷裂點(diǎn)兩端區(qū)域的STS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，從而完成待選DDIT3克隆的鑒定； (3)探針制備對鑒定陽性的菌液，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提??；通過OD值的測定對質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量；然后，通過切口平移方法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化； (4)探針驗(yàn)證使用人類正常分裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗(yàn)證。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于含DDIT3基因3基因斷裂點(diǎn)兩端的克隆培養(yǎng)和鑒定步驟中使用的S T S引物對序列分別為上游引物5，-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3 和下游引物 5 ’ -CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3 ’，及上游引物5’ -GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’ 和下游引物 5’ -ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μ I切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U間，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU間。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針標(biāo)記的熒光素為熒光素標(biāo)記的Spectrum dUTP。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用I 2 μ I滅菌純化水或Human Cot-1DNA(I μ g/μ I)溶解沉淀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用DDIT3熒光探針制備的熒光原位雜交檢測的試劑盒，還涉及其DDIT3熒光探針的制備方法，本發(fā)明的DDIT3熒光探針及相應(yīng)的試劑盒可用于脂肪肉瘤的鑒別診斷。
文檔編號C12N15/11GK102994631SQ20121035788
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者李明, 何瑰, 陳華云 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司