專(zhuān)利名稱：一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌株，特別涉及一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皂苷的毒性主要表現(xiàn)為溶血性，一般認(rèn)為，溶血性是其苷元可以與紅細(xì)胞壁上膽甾醇結(jié)合生成不溶于水的復(fù)合物沉淀，破壞細(xì)胞滲透壓，使紅細(xì)胞發(fā)生崩解，進(jìn)而導(dǎo)致溶血現(xiàn)象。皂苷有無(wú)溶血活性與皂苷元有關(guān)，活性強(qiáng)弱與糖分子的大小、糖分子之間的連接、糖分子上的取代基等有關(guān)，此外還與皂苷的濃度有關(guān)。 茶皂素的結(jié)構(gòu)如附圖I所示，屬于三萜類(lèi)皂苷，由糖體、配基和有機(jī)酸組成。從分子結(jié)構(gòu)看，茶皂素是一種非離子表面活性劑。其親水基團(tuán)是強(qiáng)電負(fù)性的含氧基團(tuán)組成，這些基團(tuán)集中在茶皂素的糖體配體，有機(jī)酸配體及皂苷配基的連接部位，構(gòu)成親水部分。其中配基是由非極性的碳?xì)洵h(huán)鏈構(gòu)成，在水溶液中呈現(xiàn)憎水的傾向，成為親油的主體，所以茶阜素的結(jié)構(gòu)分為親水和親油兩部分。Sobolewska等在發(fā)表于2010年9月(9卷,3期)《Phytochemistry Review》(植物化學(xué)評(píng)論)425-474 頁(yè)的《Saponins as cytotoxicagents a review》(綜述阜苷一細(xì)胞毒素)一文中稱利用酶解法去除阜苷的糖體配體，會(huì)降低皂苷的溶血性。酶水解工業(yè)化應(yīng)用成本較高，如能利用微生物發(fā)酵來(lái)降低茶籽柏的毒性，將更有工業(yè)化應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種面包乳桿菌菌株，以及利用該菌株進(jìn)行茶籽柏固態(tài)發(fā)酵脫毒的方法，經(jīng)發(fā)酵脫毒后的茶籽柏溶血作用明顯下降，降低了茶籽柏的毒性。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種面包乳桿菌菌株，所述菌株的分類(lèi)命名為面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6304,保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰兩路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2012年6月28日。所述面包乳桿菌菌株的16s rDNA堿基序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還公開(kāi)了所述面包乳桿菌菌株的篩選和應(yīng)用于茶籽柏發(fā)酵脫毒的方法，包括以下步驟I、種子培養(yǎng)將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，然后于37°C厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37°C培養(yǎng)24h，使菌液的0D_值達(dá)到
0.8，備用，所述種子培養(yǎng)基成分為蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纖維二糖 20. Og,吐溫-80lml，檸檬酸三銨 2. 0g，K2HP042. 0g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，MnSO4 ·2Η20 0. 05g，蒸懼水1000ml。2、茶籽柏9g，加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸銨2% (w/w)的pH5. O的磷酸鹽緩沖溶液7. 2ml，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。
3、按接種量10% (菌液/茶籽柏，ml/g)將步驟I中經(jīng)種子培養(yǎng)后的所述面包乳桿菌菌株接種于步驟2所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中，固液比I : 0.8( 八)，371發(fā)酵3611，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。4、茶籽柏發(fā)酵脫毒往步驟3中所述發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱重并用生理鹽水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液A，備用；往步驟2中所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱重并用生理鹽水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液B，作為對(duì)照，備用。5、溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)酵效果(I)取血將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精對(duì)動(dòng)物的取血部位進(jìn)行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動(dòng)物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中，制得血樣?！?2)血樣處理將所述血樣于4°C冷凍離心，300rmp/5min ;離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復(fù)本步驟至所述血樣上清無(wú)色，然后用生理鹽水稀釋到2% (v/v)，得稀釋后的血樣。(3)溶血實(shí)驗(yàn)分別取所述茶皂素固形物溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ I、100μ I和120 μ 1，分別用生理鹽水定容至500 μ 1，再分別加入500 μ I所述稀釋后的血樣，37°C溶血Ih，IOOOOrpm離心5min，從各管中取上清液600 μ 1，混勻后，于540nm測(cè)定OD，空白對(duì)照為500 μ I生理鹽水和500 μ I所述稀釋后的血樣的混合液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用面包乳桿菌發(fā)酵的茶籽柏溶血作用明顯下降，降低了茶籽柏的毒性，從而彌補(bǔ)了茶籽柏在冷血?jiǎng)游镲暳蠎?yīng)用方面的不足。


圖I為茶皂素結(jié)構(gòu)圖Rp R2 :反(側(cè))白芷酸和醛酸；R1 = CHO, CH2OH, CH3 ；R2 = CHO, CH3。圖2為發(fā)酵前后茶籽柏提取物的溶血效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :I.配制培養(yǎng)基平板培養(yǎng)(MRS固體培養(yǎng)基)蛋白胨lO.Og，牛肉膏l(xiāng)O.Og，酵母抽提物5.0g，葡萄糖 20. Og,吐溫-801ml,乙酸鈉 5g，檸檬酸三銨 2. 0g, K2HP042. 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g，碳酸隹丐IOg,瓊脂15g,蒸懼水1000ml。121°C滅菌，倒平板。種子培養(yǎng)蛋白胨10.0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纖維二糖20. Ogji:溫-801ml，檸檬酸三銨 2. Og, Κ2ΗΡ042· 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g,蒸餾水IOOOml02.茶籽柏固態(tài)發(fā)酵
取100 μ L保藏號(hào)為CGMCC No. 6304的面包乳桿菌菌液，于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，將涂布好的平板37°C厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37°C培養(yǎng)24h，使菌液的OD6tltl值達(dá)到O. 8，備用。取部分脫去茶皂素的茶籽柏(含2. 3% (w/w)茶皂素)9g，加入7. 2ml的pH5. O磷酸鹽緩沖溶液(添加葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)、硫酸銨2% (w/w))。攪拌均勻后12rC，15min高壓滅菌，備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。在超凈臺(tái)中移取O. 9ml經(jīng)種子培養(yǎng)后的菌液于上述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，真空脫氣，密封，置于37°C恒溫培養(yǎng)36h，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基。3.提取茶皂素 往發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱重并用生理鹽水配制成茶皂素固形物濃度為100 μ g/ml的溶液A，備用；往未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，將所得產(chǎn)物稱重并用生理鹽水配制成茶皂素固形物濃度同樣為100 μ g/ml的溶液B，作為對(duì)照，備用，所述茶皂素的結(jié)構(gòu)如圖I所示。4.溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)酵效果(I)取血將肝素鈉和裝有生理鹽水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精對(duì)動(dòng)物取血部位進(jìn)行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素鈉溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素鈉；用注射器從動(dòng)物靜脈中取血后，去除針頭，將血慢慢推到裝有冰生理鹽水的試管中。(2)血樣處理將血樣于4°C冷凍離心，300rmp/5min ;離心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理鹽水，用移液槍輕吹，使血溶解；重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)至血樣上清無(wú)色，將血樣用生理鹽水稀釋到2% (v/v)，得稀釋后的血樣。(3)溶血實(shí)驗(yàn)分別于上述稀釋后的血樣500 μ I中分別添加上述溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ 1、100μ I和120 μ 1，用生理鹽水補(bǔ)充至總體積為1ml，于37°C溶血Ih后，IOOOOrpm離心5min,從各管中取上清液600 μ I，混勻后，于540nm測(cè)定0D,空白對(duì)照為500 μ I生理鹽水和500 μ I所述稀釋后的血樣的混合液。OD表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。纖細(xì)胞溶血量越高，則離心后的血樣顏色越深，血樣的OD54tl越高，因此可以用OD值來(lái)反應(yīng)溶血量。計(jì)算半數(shù)溶血量(HD5tl),即表示在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，通過(guò)茶皂素作用，使一定量的血紅細(xì)胞半數(shù)破裂所需最小茶皂素的量。即OD54tl值達(dá)到完全溶血時(shí)的50%時(shí)所需要茶皂素的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。從圖上可明顯看出發(fā)酵后的茶籽柏溶血效果有明顯降低，未發(fā)酵茶籽柏的HD5tl為7. 96 μ g，發(fā)酵后的茶籽柏的HD5tl為13. 18 μ g，發(fā)酵前后HD5tl值增加了 65. 58%oHD50 = (13. 18-7. 96) /7. 96 X 100%= 65. 58 %。
權(quán)利要求
1.一種面包乳桿菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 6304。
2.如權(quán)利要求I所述的面包乳桿菌菌株在茶籽柏發(fā)酵脫毒中的應(yīng)用。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的面包乳桿菌菌株進(jìn)行茶籽柏發(fā)酵脫毒的方法，包括以下具體步驟 (1)種子培養(yǎng)將所述面包乳桿菌菌株進(jìn)行種子培養(yǎng)，使菌液的0D_值達(dá)到O.8，備用； (2)按固液比I: O. 8(w/v)往茶籽柏中加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸銨2% (w/w)的pH5. O的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后高壓滅菌備用，得到未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基； (3)將經(jīng)種子培養(yǎng)后的所述面包乳桿菌菌株接種于(2)中所述未發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中，37 °C發(fā)酵36h，得發(fā)酵的固體培養(yǎng)基； (4)茶籽柏發(fā)酵脫毒往(3)中所述發(fā)酵的固體培養(yǎng)基中加入乙醇，80°C振搖4h，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮至干，制得脫毒的茶籽素。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述種子培養(yǎng)的具體操作為將所述面包乳桿菌菌株于MRS固體培養(yǎng)基上涂布，然后于37°C厭氧培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，繼續(xù)37°C培養(yǎng)24h，使菌液的OD6tltl值達(dá)到O. 8，備用，所述種子培養(yǎng)基成分為蛋白胨10. Og，牛肉膏10. Og，酵母抽提物5. Og，纖維二糖20. 0g，吐溫-801. 0ml，檸檬酸三銨2. Og,Κ2ΗΡ042· Og, MgSO4 · 7Η20 O. 2g, MnSO4 · 2H20 0. 05g，蒸餾水 1000ml。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中(3)中所述菌株的接種量為10%(ml/g)。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中(4)中所述乙醇的濃度為70%(v/v)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種面包乳桿菌菌株及其應(yīng)用，所述的菌株面包乳桿菌(Lactobacillus crustorum)，保藏編號(hào)為CGMCC No.6304，本發(fā)明還涉及將所述菌株用于茶籽粕的固態(tài)發(fā)酵脫毒的方法，具體步驟為(1)斜面培養(yǎng)；(2)種子培養(yǎng)；(3)固態(tài)發(fā)酵；本發(fā)明的有益效果是利用面包乳桿菌發(fā)酵的茶籽粕溶血作用明顯下降，降低了茶籽粕的毒性，從而彌補(bǔ)了茶籽粕在冷血?jiǎng)游镲暳蠎?yīng)用方面的不足。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102965301SQ20121035913
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者張建華, 尹麗茸, 黃蓓, 吳秉宇, 李雙雙, 林立 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 福建天生農(nóng)業(yè)股份有限公司