專利名稱：一種阿維菌素菌種選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種阿維菌素菌種選育方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素是由阿佛曼鏈霉菌生產(chǎn)的一組由十六元大環(huán)內(nèi)酯與一個(gè)二齊墩果糖所構(gòu)成的一類殺蟲抗生素，其在防治農(nóng)業(yè)病蟲害和畜牧業(yè)寄生蟲病中有獨(dú)特效果，已在我國大量使用，并是我國出口的第二大殺蟲劑品種。目前，在我國阿維菌素菌種育種中，其性能的優(yōu)劣由搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液生產(chǎn)抗生素效價(jià)的高低來判定。現(xiàn)有技術(shù)中阿維菌素篩選自然選育流程如下選擇出發(fā)株、制備分離平 板培養(yǎng)基、制備單孢子懸浮液、涂布分離培養(yǎng)、挑單菌落接斜面、搖瓶初篩(搖瓶培養(yǎng)、HPLC法檢測)、初篩留種、接復(fù)篩斜面、搖瓶復(fù)篩(搖瓶培養(yǎng)、HPLC法檢測)、復(fù)篩留種、性狀考察和高產(chǎn)菌種復(fù)篩留種。上述方法存在著流程繁瑣、選育周期長、工作量大、需要專用設(shè)備(恒溫振蕩器)、能耗大、成本高、篩選效率低等缺陷。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，本著“初篩以量為主、復(fù)篩以質(zhì)為主”的篩選原則，盡可能地放大初篩數(shù)量，使初篩的手段盡可能地快速、簡單；但現(xiàn)行工藝從單菌落培養(yǎng)到菌種性能的初篩檢測還是需35天左右，緩慢又繁瑣；并且，在此期間菌種培養(yǎng)恒溫室、搖瓶培養(yǎng)恒溫振蕩器均處于在線使用狀態(tài)，設(shè)備及功能間的利用率低、菌選耗時(shí)長，對于阿維菌素菌種選育工作來說，篩選工作依然處于低效率狀態(tài)。因此，提供一種快速初篩方法對于阿維菌素的生產(chǎn)來說具有非常重要的意義。抑菌圈測定抗生素效價(jià)方法是傳統(tǒng)的快速初篩測定法。其原理是待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制試驗(yàn)菌生長的物質(zhì)，或能分泌某種酶并將無毒的物質(zhì)水解成對試驗(yàn)菌有毒的物質(zhì)，從而在該菌落周圍形成試驗(yàn)菌不能生長的抑菌圈。方法是將待檢測菌種的單菌落瓊脂塊移至含有試驗(yàn)菌(多采用短小芽孢桿菌)的瓊脂塊培養(yǎng)基上，在適宜溫濕度下培養(yǎng)一段時(shí)間后取出，用游標(biāo)卡尺來分別測定各抑菌圈的直徑，直徑大小反映了瓊脂塊產(chǎn)抗生素能力的大小，以此判斷、擇優(yōu)選取。由于阿維菌素沒有抑菌活性，其自身不能分泌抑制試驗(yàn)菌生長的物質(zhì)或分泌某種對試驗(yàn)菌有毒的物質(zhì)，當(dāng)其轉(zhuǎn)入含試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基上就會被試驗(yàn)菌所抑制甚至殺滅，所以阿維菌素菌選過程中效價(jià)的檢測不能采用抑菌圈法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種有效縮短阿維菌素菌種選育周期，提高篩選效率，降低篩選成本的菌種選育方法。本發(fā)明采用瓊脂塊培養(yǎng)初篩流程選育法，過程為生產(chǎn)菌種斜面培養(yǎng)，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養(yǎng)出單菌落，同時(shí)進(jìn)行挑取單菌落點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基平板上及挑單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，待點(diǎn)種菌落培養(yǎng)成熟后，用HPLC法檢測產(chǎn)素能力作為初篩效價(jià)，挑取與初篩效價(jià)高的斜面菌落搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩搖瓶效價(jià)HPLC法檢測，高產(chǎn)菌株復(fù)篩留種，高產(chǎn)菌株性能考察，最終留種。上述工藝具體來說為挑選生產(chǎn)使用的阿維菌素斜面一瓶，制備成單孢子懸浮液，梯度稀釋后按一定體積注入分離培養(yǎng)基中，涂步均勻，按照菌種工藝培養(yǎng)至5 7天(菌落成型、表面有孢子分泌)，用滅菌牙簽選取各型單菌落(菌落形態(tài)要有記錄)點(diǎn)種于點(diǎn)種優(yōu)化培養(yǎng)基上，點(diǎn)種培養(yǎng)平皿倒置于恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)10 12天，培養(yǎng)溫度28± 1°C ;分離平皿倒置于恒溫培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)2天左右，認(rèn)真觀察菌落的生長變化。待分離培養(yǎng)基上單菌落生長成熟，挑取單菌落制備斜面；待點(diǎn)種培養(yǎng)基上單菌落生長成熟，用接種鏟鏟下單菌落、用適宜溶劑提取后經(jīng)HPLC做初篩檢測；待斜面生長成熟，鏟下并用適宜溶劑提取后經(jīng)HPLC做初篩檢測。在試驗(yàn)過程中認(rèn)真觀察各階段菌株的生長情況、統(tǒng)計(jì)HPLC檢測結(jié)果、分析各數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表之間的相關(guān)性，得到以下發(fā)明效果本發(fā)明可以有效縮短阿維菌素的選育周期、提高篩選效率、節(jié)約篩選成本；瓊脂塊培養(yǎng)初篩法得到的菌種性能與相應(yīng)的增殖斜面得到的驗(yàn)證結(jié)果能有效對應(yīng)。本發(fā)明的效果與傳統(tǒng)的阿維菌素?fù)u瓶初篩選育方法相比，本發(fā)明可以將篩選周期縮短近半個(gè)月，并且瓊脂塊培養(yǎng)初篩法得到的菌種性能與相應(yīng)的增殖斜面得到的驗(yàn)證結(jié)果能有效對應(yīng)。
具體實(shí)施方式
I、儀器與材料I. I 儀器漩渦混合器、臺式低速離心機(jī)、安捷倫高效液相色譜儀。I. 2 材料:出發(fā)菌株(挑選生產(chǎn)使用菌株阿佛曼鏈霉菌Streptomyces avermitilis,),分離(斜面)培養(yǎng)基、點(diǎn)種培養(yǎng)基、種子搖瓶培養(yǎng)基、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基；丙酮(分析純)、甲醇(分析純)、無水甲醇(色譜純)，有機(jī)濾膜。I. 2. I 培養(yǎng)基I. 2. I. I分離(斜面)培養(yǎng)基(g / L):可溶性淀粉10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6,MgSO4. 7H201. 2,K2HPO4. 3H203. 0、CaC033.0、瓊脂粉20;PH7. 2 7. 4，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 2 點(diǎn)種培養(yǎng)基(g / L)1#---可溶性淀粉 10、(NH4)2S042. 5,NaCLO. 6、MgS04. 7H201. 2、K2HP04. 3H203.0、CaC033. 0、瓊脂粉 20;PH7. 2 7. 4，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。2#玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏4. 0、CaC033.0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。3#玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米漿 2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。4#玉米淀粉25、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米漿 4. 0、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025、瓊脂粉 20;
PH7. O 7. 2，用蒸餾水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 3搖瓶種子培養(yǎng)基(g / L):玉米淀粉25、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏5. O、玉米漿4. O、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自來水配制，121°C滅菌30min。I. 2. I. 4搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g / L):玉米淀粉70、黃豆餅粉8. O、花生餅粉10、酵母粉5. O、酵母膏3. O、玉米漿2. 2、C0CL2. 6H200. 003、淀粉酶 O. 0025 ；PH7. O 7. 2，用自來水配制，121°C滅菌30min。
2、方法2. I培養(yǎng)方法2. I. I分離平皿的制備挑選大生產(chǎn)使用的生長飽滿的工作細(xì)胞庫斜面，加入15ml無菌水，用接種環(huán)刮取孢子，將其懸浮在無菌水中，制成混合均勻的孢子懸浮液。用滅菌的濾紙進(jìn)行過濾，收集過濾孢子液，并進(jìn)行10-1 10-6梯度稀釋，取10-5、10-6稀釋液O. I O. 15ml注入于分離培養(yǎng)基平板上，用三角耙耙勻，倒置于恒溫培養(yǎng)室28±1°C培養(yǎng)7 9天。2. I. 2點(diǎn)種平皿的制備取培養(yǎng)至第5 7天的上述分離平板，用肉眼篩選出飽滿、均勻、分泌孢子量大、形態(tài)規(guī)整或經(jīng)驗(yàn)型產(chǎn)抗能力差的單菌落，在背面標(biāo)記序號；并在點(diǎn)種培養(yǎng)基背面標(biāo)記相應(yīng)的序號(I個(gè)分離單菌落對應(yīng)2個(gè)點(diǎn)種菌落序號；分別用3-1、3-2標(biāo)示)，用滅菌過的牙簽輕輕點(diǎn)種于相應(yīng)序號位置標(biāo)記處的點(diǎn)種培養(yǎng)基上，點(diǎn)種培養(yǎng)平皿倒置于恒溫培養(yǎng)室28± 1°C培養(yǎng)10 12天；分離平皿倒置于恒溫培養(yǎng)室28± 1°C繼續(xù)培養(yǎng)2天左右，認(rèn)真觀察菌落的生長變化。2. I. 3斜面制備用點(diǎn)種肉眼篩選方法選取優(yōu)質(zhì)單菌落和點(diǎn)種后帶序號的單菌落，用接種環(huán)挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)室28土 1°C培養(yǎng)7 9天。2. I. 4種子搖瓶將培養(yǎng)好的斜面菌種用接種鏟鏟取I. 0cm*I. Ocm接種于種子搖瓶培養(yǎng)基中，28±l°C、220r / min振蕩培養(yǎng)25 30hr，觀察其菌絲生長情況。2. I. 5發(fā)酵搖瓶將培養(yǎng)成熟的種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵搖瓶中，28±l°C、220r / min振蕩培養(yǎng)10天。2. 2 初篩:2.2.1液體搖瓶復(fù)篩取2. I. 5培養(yǎng)好的發(fā)酵液IOml于離心管中，3000r / min離心IOmin,棄去上清液。加入丙酮IOml,在鏇潤混合器上振蕩提取5min,靜置IOmin,再經(jīng)3000r / min離心IOmin,得萃取液，經(jīng)O. 45u有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取5. Oul樣品濾液進(jìn)樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產(chǎn)能力。2. 2. 2瓊脂塊培養(yǎng)初篩
分別將2塊2. I. 2培養(yǎng)好的、同序號點(diǎn)種單菌落鏟下置于同一離心管中，加IOml分析純甲醇，在鏇潤混合器上充分振蕩3min提取，4000r / min離心lOmin、靜置IOmin后，經(jīng)O. 45u有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取5. Oul樣品濾液進(jìn)樣，利用自動高效液相色譜儀檢測菌株的生產(chǎn)能力。3、結(jié)果與分析3. I 結(jié)果3.1.1點(diǎn)種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表I點(diǎn)種培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見I. 2. I. 2。點(diǎn)種菌落生長情況如下表I

權(quán)利要求
1.一種阿維菌素菌種選育方法，其特征在于采用瓊脂塊培養(yǎng)法。
2.按照權(quán)利要求I所述的阿維菌素菌種選育方法，其具體步驟為生產(chǎn)菌種斜面培養(yǎng)，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養(yǎng)出單菌落，同時(shí)進(jìn)行挑取單菌落點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基平板上及挑單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，待點(diǎn)種菌落培養(yǎng)成熟后，用HPLC法檢測產(chǎn)素能力作為初篩效價(jià)，挑取與初篩效價(jià)高的斜面菌落搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩搖瓶效價(jià)HPLC法檢測，高產(chǎn)菌株復(fù)篩留種，聞廣菌株性能考察，最終留種。
3.按照權(quán)利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述挑取單菌點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基平板上時(shí)每個(gè)單菌落點(diǎn)種兩塊。
4.按照權(quán)利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述單菌落點(diǎn)種和單菌落斜面培養(yǎng)是在在28土 1°C條件下培養(yǎng)7 9天。
5.按照權(quán)利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述涂布分離培養(yǎng)是在28±1°C條件下培養(yǎng)10 12天。
6.按照權(quán)利要求2所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于上述HPLC法檢測產(chǎn)素能力是指點(diǎn)種固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)結(jié)束后，將源于同一單菌落的兩塊瓊脂塊取下置于同一離心管中，加適量甲醇，充分震蕩混合，轉(zhuǎn)速4000rpm離心lOmin、靜置后，經(jīng)O. 45um有機(jī)濾膜過濾，收集過濾液，用HPLC法測定單菌落的產(chǎn)素能力。
7.按照權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的阿維菌素菌種選育方法，其特征在于用于分離培養(yǎng)、點(diǎn)種培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為瓊脂塊固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阿維菌素菌種選育方法，采用瓊脂塊培養(yǎng)法進(jìn)行初篩，即生產(chǎn)菌種斜面培養(yǎng)，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養(yǎng)出單菌落，同時(shí)進(jìn)行挑取單菌落點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基平板上及挑單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，待點(diǎn)種菌落培養(yǎng)成熟后，用HPLC法檢測產(chǎn)素能力作為初篩效價(jià)，挑取與初篩效價(jià)高的斜面菌落搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩搖瓶效價(jià)HPLC法檢測，高產(chǎn)菌株復(fù)篩留種，高產(chǎn)菌株性能考察，最終留種。本發(fā)明可以有效縮短阿維菌素的選育周期、提高篩選效率、節(jié)約篩選成本。與傳統(tǒng)的阿維菌素?fù)u瓶初篩選育方法相比，本發(fā)明可以將篩選周期縮短近半個(gè)月，并且瓊脂塊培養(yǎng)初篩法得到的菌種性能與相應(yīng)的增殖斜面得到的驗(yàn)證結(jié)果能有效對應(yīng)。
文檔編號C12N1/20GK102839143SQ20121036061
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者李學(xué)兵, 崔莉, 張燕玉 申請人:寧夏啟元藥業(yè)有限公司