專利名稱：一種角質(zhì)酶的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以疏水色譜和陰離子交換為主要手段角質(zhì)酶的分離純化方法，屬于生物技術(shù)分離純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角質(zhì)酶(Cutinase，EC3. I. I. 74)是一種能破壞角質(zhì)多聚物分子的酯鍵使其水解為單體和小分子寡聚體的胞外誘導(dǎo)水解酶，它主要存在于植物病原菌中，是病原菌侵入植物時(shí)用以突破植物表皮第一道屏障角質(zhì)所需要的酶。角質(zhì)酶屬于a/β水解酶家族，可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和角質(zhì)等聚酯，它作為一種多功能水解酶，在食品及化工等諸多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。角質(zhì)酶既可水解不溶性多聚體角質(zhì)的酯鍵，也可以作用于其他長鏈、短鏈脂肪酸酯、乳化的甘油三酯等。除了水解反應(yīng)外，角質(zhì)酶還能參與酸與醇的酯化。作為一種能裂解酶，角質(zhì)酶主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面
I、在生物催化方面的應(yīng)用在工業(yè)產(chǎn)品及工藝中，角質(zhì)酶具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。從可溶性合成酯類到不溶性長鏈甘油的多種酯，角質(zhì)酶對(duì)其均有水解作用，角質(zhì)酶可在較低水分活度下進(jìn)行脂肪和油的專酯化或醇類的(立體)選擇性酯化；可進(jìn)行丁酸和2-丁醇、甲基_、乙基_、丙基丙酸酯等物質(zhì)之間的酯化、專酯化反應(yīng)，也可參與合成聚合物表面活性劑及含有一個(gè)或多個(gè)手性中心的藥物。2、在農(nóng)業(yè)化學(xué)品工業(yè)中的應(yīng)用大量性質(zhì)不同的化合物，例如除草劑、殺蟲劑和植物生物物質(zhì)等，沉積或吸附在植物表面，它們對(duì)植物的作用很大程度取決其通過角質(zhì)層的能力。根據(jù)這一特點(diǎn)，人們研究了含有角質(zhì)酶的制劑，開發(fā)用于農(nóng)用化學(xué)品的增效劑及輔劑、植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)物、除草劑及植物生長的抑制劑等。3、在護(hù)理用品行業(yè)的應(yīng)用由于角質(zhì)酶具有脂肪酶的性能，已被用作洗衣店的解脂肪酶或洗碟的清潔劑，用于去除脂肪。角質(zhì)酶及其采用酶工程獲得的變體已經(jīng)開發(fā)用于生產(chǎn)清潔劑或去污劑，聯(lián)合利華等公司擁有其相關(guān)專利。4、在食品工業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品深加工中的應(yīng)用角質(zhì)酶在乳制品工業(yè)中牛奶脂肪的水解，以及油化學(xué)工業(yè)中具有應(yīng)用潛力；可用于低附加值的農(nóng)副產(chǎn)品加工廢物轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的脂肪酸等物質(zhì)。5、在塑料廢物的生物降解和廢水處理方面的應(yīng)用每年全球大約產(chǎn)生140，000，OOOt的合成塑料，這些合成塑料大都性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境造成的污染已經(jīng)成為環(huán)境保護(hù)所面臨的一大問題。聚己內(nèi)酯(polylcaprolactone,PCL)是其中一種合成聚酯，有研究發(fā)現(xiàn)它可被一些植物病原真菌降解。Murphy等人研究證實(shí)植物病原真菌茄病鐮刀菌降解聚己內(nèi)酯過程中發(fā)揮作用的正是角質(zhì)酶，因此，在PCL生物降解方面，人們對(duì)角質(zhì)酶的用途有了新的認(rèn)識(shí)。此外,Teles等人應(yīng)用角質(zhì)酶對(duì)皮革工業(yè)的固體廢物進(jìn)行了脫脂研究。6、在紡織工業(yè)中的應(yīng)用紡織工業(yè)傳統(tǒng)的對(duì)棉織物進(jìn)行前處理是采用強(qiáng)堿高溫處理工藝，它存在許多不足之處，傳統(tǒng)工藝，流程復(fù)雜冗長，設(shè)備龐大、纖維損傷大；棉織物前處理水耗和能耗大等。用酶對(duì)棉織物進(jìn)行前處理是國內(nèi)外公認(rèn)的21世紀(jì)的環(huán)保型染整技術(shù)，對(duì)紡織專用酶制劑的需求必將逐漸增大，推廣應(yīng)用前景廣闊。棉花的角質(zhì)層直接影響棉花的可紡性，2002年首次報(bào)道假單胞菌所產(chǎn)角質(zhì)酶用于棉纖維角質(zhì)層生物煮練的研究，研究表明它可有效提高原棉表層的潤濕性。在生物煮練過程中，角質(zhì)酶與果膠裂解酶具有較好的協(xié)同效應(yīng)，亦可用于去除織物表面的聚酯類污點(diǎn)，提高織物的質(zhì)量。紡織工業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和支柱產(chǎn)業(yè)，在國內(nèi)生產(chǎn)總值和外貿(mào)出口總值中占有重要比例。紡織工業(yè)廢水主要來自染整工段,包括退漿、煮煉、漂白、絲光、染色、印花和整理等，污染物主要是棉毛等紡織纖維上的污物、鹽類、油類和脂類，以及投加的各種上漿料、染料、助劑、酸、堿等，廢水量大，是嚴(yán)重的污染源之一。為了使棉纖維獲得優(yōu)良的潤濕性和白度，需要在前處理過程中去除角質(zhì)層、果膠質(zhì)和蛋白質(zhì)等各種伴生物。傳統(tǒng)的煮煉工藝用燒堿、肥皂、表面活性劑等的水溶劑，在120°C、pH值10 13的條件下對(duì)棉纖維進(jìn)行煮煉。煮煉廢水量大，呈強(qiáng)堿性，BOD和COD均高達(dá)每升數(shù)千毫克。 使用生物煮練技術(shù)，最大的好處是提高染色的均勻性及減輕環(huán)境污染。隨著社會(huì)對(duì)紡織品和環(huán)境的環(huán)保問題日益重視，對(duì)紡織品的高檔化和高附加值加工的追求，酶用于紡織中，易于生物降解，不會(huì)污染環(huán)境與紡織品，另一方面生物酶能賦予被加工的紡織品許多獨(dú)特的效果，獨(dú)有的高催化效率和高度的專一性，使生物酶的應(yīng)用具有光明的前景。2004年6月中旬在奧地利格拉茨召開的第三屆國際紡織技術(shù)交流會(huì)(INTB)上Bucheri^PKinuGrancaric等專家對(duì)棉纖維生物煮練中的酶制劑分別做了相關(guān)研究報(bào)告。在生物煮煉方面，有報(bào)道角質(zhì)酶用于紡織工業(yè)中棉纖維角質(zhì)層生物煮練，可提高原棉的潤濕性，與果膠裂解酶具有較好的協(xié)同效應(yīng)，能更好地去除角質(zhì)層、果膠層，保證織物的良好紡織性能，與其他紡織酶制劑復(fù)合使用可實(shí)現(xiàn)紡織的綠色加工。國內(nèi)外的研究主要集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化以及基因工程菌的篩選，而對(duì)于角質(zhì)酶分離純化的報(bào)道較少。中國專利CN100537758C介紹了一種角質(zhì)酶的分離純化方法，其以疏水色譜為主要手段分離純化野生菌所產(chǎn)角質(zhì)酶，該方法只適用于嗜熱子囊菌Thermobif idafusca發(fā)酵液的分離純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種角質(zhì)酶的分離純化方法，采用疏水色譜和陰離子交換為主要手段，有效的分離角質(zhì)酶發(fā)酵液，適用于鐮刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬M(fèi)onilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt發(fā)酵來源的發(fā)酵液,擴(kuò)大了分離純化的范圍，為之后的蛋白質(zhì)測(cè)序、性質(zhì)應(yīng)用分析和基因工程菌構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明主要的工藝步驟為(I)將角質(zhì)酶發(fā)酵液離心去除菌體后，向粗酶液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到90% -95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析，透析后離心，收集上清液；
(2)向透析后的酶液加入研磨后的固體硫酸銨至20%-60%飽和度，盡快上樣于經(jīng)30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液與不含硫酸銨的Tris-HCl緩沖液線性洗 脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水層析后,測(cè)定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對(duì)活性較高的收集液進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)蛋白純度，若SDS-PAGE結(jié)果顯示多條蛋白帶，則收集酶活性較高的酶液，進(jìn)行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析；(3)步驟(2)中酶活較高的收集液經(jīng)濃縮后在Tris-HCl緩沖液中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經(jīng)緩沖液洗脫至A28tl不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有O. 2-1. OmoI/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有報(bào)道工藝，具有以下創(chuàng)新點(diǎn)(I)本發(fā)明方法適用范圍突破了以往的僅限于單一發(fā)酵來源的發(fā)酵液，適用于鐮刀菌屬 Fusarium、炭疽菌屬 Colletotrichum、鏈核盤菌屬 Monilinia、曲霉屬 Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt菌株發(fā)酵液；(2)工藝簡單，靈活性高。本發(fā)明分離純化工藝根據(jù)不同發(fā)酵液在硫酸銨沉淀和疏水色譜的分離情況來決定是否采用之后的弱陰離子柱層析分離。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I(I)將由鐮刀屬Fusarium oxysporium發(fā)酵獲得的角質(zhì)酶發(fā)酵液離心去除菌體后，向粗酶液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到90%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl (pH值為8. O, 20mM)緩沖液溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析4小時(shí)，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至30%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, IOmM)洗脫，流速為2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水層析后,測(cè)定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性,對(duì)活性較高的收集液進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)蛋白純度，SDS-PAGE結(jié)果顯示多條蛋白帶，收集酶活性較高的酶液，進(jìn)行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析；(3)將上一步酶活較高的收集液經(jīng)濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經(jīng)緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，IOmM)和含有O. 2mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min，收集活性峰。實(shí)施例2(I)將炭疽菌屬Colletotrichum gloeosporioides發(fā)酵而來的角質(zhì)酶發(fā)酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,40mM)溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析4小時(shí)，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至20% -60%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. O, 20mM)預(yù)平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,20mM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0，20mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為8. 0,20mM)洗脫，流速為2. 5mL/min,Phenyl-Sepharose疏水層析后,測(cè)定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性,對(duì)活性較高的收集液進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)蛋白純度。實(shí)施例3(I)將鏈核盤菌屬M(fèi)onilinia fructicola角質(zhì)酶發(fā)酵液離心出去菌體后，向粗酶 液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到92%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析2小時(shí)，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至50%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)預(yù)平衡的Phenyl-S印harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫,流速為2. 5mL/min, Phenyl-Sepharose疏水層析后,測(cè)定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對(duì)活性較高的收集液進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)蛋白純度。實(shí)施例4(I)將曲霉屬Aspergillus oryzae角質(zhì)酶發(fā)酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到94%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7.0，20mM)溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析一段時(shí)間，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至20% -60%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)預(yù)平衡的Phenyl-S^harose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)洗脫，流速為2. 5mL/min ；(3)上一步酶活較高的收集液經(jīng)濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為 . 0，8mM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經(jīng)緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有O. 5mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰。實(shí)施例5(I)將Ascochyta rabiei角質(zhì)酶發(fā)酵液離心出去菌體后，向粗酶液中加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到95%飽和度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,20mM)溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理的透析袋中，在相同緩沖溶液中透析5小時(shí)，透析后離心，收集上清液；(2)向透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至30%飽和度，上樣于30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱中，先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)平衡至A28tl值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)與不含硫酸銨的同一緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)洗脫，流速為2. 5mL/min ；(3)上一步酶活較高的收集液經(jīng)濃縮后在Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0，12mM)中充分透析后，加入同種緩沖液平衡的DEAE-Sepharose層析柱中，酶蛋白經(jīng)緩沖液洗脫至 A280不變后，用Tris-HCl緩沖液(pH值為7. 0,8mM)和含有O. 4mol/L NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min，收集活性峰。
權(quán)利要求
1.一種角質(zhì)酶的分離純化方法，其特征在干 (1)將角質(zhì)酶發(fā)酵液離心去除菌體后，向粗酶液中緩慢加入經(jīng)研磨烘干后固體硫酸銨，使硫酸銨達(dá)到一定濃度，冷凍離心，收集沉淀，將沉淀用適量TriS-HCl緩沖液溶解后，倒入經(jīng)煮沸處理后的透析袋中，相同緩沖溶液中透析，透析后離心，收集上清液。
(2)向步驟(I)透析后的酶液加入經(jīng)研磨烘干后的固體硫酸銨至一定飽和度，上樣于經(jīng)30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液預(yù)平衡的Phenyl-S^harose疏水柱，上樣結(jié)束后先用30%硫酸銨飽和度的Tris-HCl緩沖液平衡至A280值不變后，再用30%硫酸銨飽和的Tris-HCl緩沖液與不含硫酸銨的Tris-HCl緩沖液線性洗脫150min，最后用Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為2. 5mL/min，測(cè)定280nm吸收峰處集中管中酶液的活性，對(duì)活性較高的收集液進(jìn)行SDS-PAGE，確認(rèn)蛋白純度，若SDS-PAGE結(jié)果顯示多條蛋白帯，則收集酶活性較高的酶液，進(jìn)行DEAE-Sepharose弱陰離子交換柱層析。
(3)將步驟(2)酶活較高的收集液濃縮后在Tris-HCl緩沖液中充分透析，加入同種緩沖液平衡的DEAE-S印harose層析柱中，酶蛋白經(jīng)緩沖液洗脫至A280不變后，用Tris-HCl緩沖液和含有NaCl的同一洗脫液線性梯度洗脫，流速為2. 5mL/min,收集活性峰，即為所制備的電泳純角質(zhì)酶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于角質(zhì)酶發(fā)酵液的來源可以為錸刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬M(fèi)onilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼ニ孢屬Ascochyt的真菌發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于3個(gè)步驟所實(shí)施的溫度均要求在0-4°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于3個(gè)步驟中所述的Tris-HCl緩沖液的pH值范圍為7. 0-9.0，其中步驟(I)中Tris-HCl緩沖液的濃度為20-40mM，步驟⑵和(3)中Tris-HCl緩沖液的濃度為8_20mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于步驟(I)中硫酸銨的濃度為90% -95% ;透析時(shí)間為2-10小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于步驟(2)中向透析后的酶液加入經(jīng)研磨后烘干的固體硫酸銨至一定飽和度指的飽和度為20% -60%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角質(zhì)酶分離純化方法，其特征在于步驟(3)中NaCl的濃度為 O. 2-1. OmoI/Lο
全文摘要
本發(fā)明提供一種鐮刀菌屬Fusarium、炭疽菌屬Colletotrichum、鏈核盤菌屬M(fèi)onilinia、曲霉屬Aspergillus、黑星菌屬Venturia、鏈格孢菌屬Alternaria、葡萄孢菌屬Botrytis、殼二孢屬Ascochyt來源的角質(zhì)酶發(fā)酵液的分離純化方法，其特點(diǎn)在于選用硫酸銨沉淀和疏水色譜進(jìn)行分離純化后，可根據(jù)角質(zhì)酶純度選用弱陰離子交換進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，得到了電泳純的角質(zhì)酶溶液，可根據(jù)后續(xù)需求進(jìn)行進(jìn)一步的加工。本發(fā)明適用范圍廣，方法簡單，酶純度高，是一種高效、簡潔的酶分離純化方法。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102839163SQ20121036150
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者王秀英 申請(qǐng)人:四川金稞生物科技有限公司