專利名稱：一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測技術(shù)及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列(DNA microarray)、寡核苷酸陣列(oligonucleotide array),該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫(yī)學(xué)診斷，由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為基因芯片技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量 序列進(jìn)行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交(Southern Blotting和NorthernBlotting等)技術(shù)操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如基因表達(dá)譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。但是，通?；蛐酒跈z測之前，需要對從樣品中獲取的DNA/mRNA樣品必須進(jìn)行擴(kuò)增提高閱讀靈敏度。在PCR擴(kuò)增過程中，必須同時進(jìn)行樣品標(biāo)記，標(biāo)記方法有熒光標(biāo)記法、生物素標(biāo)記法、同位素標(biāo)記法等。而且，在擴(kuò)增過程中由于DNA的序列差異，所摻入的熒光標(biāo)記的dCTP不一致,在同樣條件下，G/C含量高的DNA信號明顯強于G/C含量低的DNA。在芯片檢測之前，PCR產(chǎn)物與芯片上的探針進(jìn)行雜交，所需時間長，不同分子所需雜交條件不一致，誤差大，且由于雜交位于固相表面，所以有一定程度的空間阻礙作用。樣品制備上，當(dāng)前多數(shù)公司在標(biāo)記和測定前都要對樣品進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試?yán)@過該問題，這包括Mosaic Technologies公司的固相PCR擴(kuò)增體系以及Lynx Therapeutics公司提出的大量并行固相克隆方法,兩種方法各有優(yōu)缺點,但目前尚未取得實際應(yīng)用。鏈置換等溫擴(kuò)增技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種酶促DNA體外等溫擴(kuò)增方法，即，具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒定溫度下用非熱變性的方法解開DNA雙鏈的，在延伸新鏈的同時將下游舊鏈剝離的一種新的擴(kuò)增方式。分子信標(biāo)是一種設(shè)計巧妙的熒光探針。在長度為15-30 mer寡核苷酸探針的兩端分別加上5-8 mer序列互補的莖桿區(qū)。在自由狀態(tài)時由于莖桿區(qū)互補序列的結(jié)合使探針分子形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，所以又被稱為發(fā)夾探針。探針的5’端及3’端分別標(biāo)記熒光素分子及淬滅劑分子。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端靠近，使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-10 nm)，此時發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。當(dāng)分子信標(biāo)與序列完全互補的靶標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時，信標(biāo)莖桿互補區(qū)被拉開，熒光分子和淬滅分子距離增大，熒光分子所產(chǎn)生的熒光不能被淬滅分子所吸收，發(fā)射熒光。且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標(biāo)的量成正比。分子信標(biāo)技術(shù)以其操作簡單、靈敏度高、特異性強、可對核酸進(jìn)行實時定量測定、甚至可以用于活體分析等特點不僅在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用，而且在疾病基因檢測與診斷等生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究中也將充當(dāng)重要的角色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測技術(shù) 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種采用分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測目標(biāo)DNA/RNA的方法，包括如下步
驟
(O分子信標(biāo)的設(shè)計分子信標(biāo)包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中，環(huán)狀區(qū)能與目標(biāo)DNA/RNA特異結(jié)合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8 25個堿基，標(biāo)記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)連接環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) ；分子信標(biāo)3’端修飾有熒光分子；
(2)芯片點樣與鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)將分子信標(biāo)5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標(biāo)微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進(jìn)行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴(kuò)增目的基因；
或者是將分子信標(biāo)與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標(biāo)微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴(kuò)增目的基因；
所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補，優(yōu)選為12個堿基；所述引物與3’莖桿區(qū)互補；
(3)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行熒光數(shù)值分析，根據(jù)熒光值，確定樣品DNA是否為目標(biāo)DNA及其含量。分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)為長度15 30個堿基的序列。5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)的互補序列長5 11個堿基。為了避免分子信標(biāo)太接近芯片表面而產(chǎn)生空間位阻影響反應(yīng)，可在分子信標(biāo)的5’端連接10 30個胸腺嘧啶或腺嘌呤。為實現(xiàn)將分子信標(biāo)固定在固相支持物上，需對分子信標(biāo)的5’末端進(jìn)行化學(xué)修飾，其修飾基團(tuán)應(yīng)與固相支持物表面修飾的化學(xué)基團(tuán)發(fā)生共價化學(xué)反應(yīng)，以便將分子信標(biāo)DNA穩(wěn)定牢固地連接在固相支持物表面，如分子信標(biāo)5’末端修飾氨基，固相支持物表面修飾醛基，貝1J可形成Schiff base,使分子信標(biāo)穩(wěn)定牢固地連接在固相支持物表面。分子信標(biāo)3’ 端標(biāo)記的熒光分子為 FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX> Texas Red、AMCA> JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye 等有機突光染料或量子點等無機染料中的任一種；淬滅探針上的突光淬滅基團(tuán)為P-苯二胺(Para-phenylene diamine,PPD)、η-丙基沒食子酸鹽(propyl gallate，NPG)、1，4-二偶氮雙環(huán)(2，2，2)-辛烷(I,4-diazobicyelo (2, 2, 2) -octane, DABC0)、TAMRA、BHQ-l、BHQ_2、Eclipse、Iowa Black、納米金顆粒中的任一種。固相支持物為玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一種。優(yōu)選的，在鏈置換等溫擴(kuò)增過程中，加入用熒光標(biāo)記的dCTP，可以提高其檢測的靈敏度。一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測試劑盒，包括固定在固相支持物表面的分子信 標(biāo)、淬滅探針、引物、鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液，其中
所述分子信標(biāo)包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中環(huán)狀區(qū)能與目標(biāo)DNA/RNA特異結(jié)合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8 25個核苷酸，標(biāo)記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)靠近環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；分子信標(biāo)的5’端修飾有-NH2, 3’端修飾有熒光分子；
所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸序列，至少8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補；
所述引物與3’莖桿區(qū)互補。鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液的組成為50mM Tris-HCl pH 7. 0 8. 0，I. 5 mM MgSO4,10mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種 dNTP，20 μ g/ml BSA, 25 100 U/ml DNA 聚合酶。本發(fā)明綜合鏈置換等溫擴(kuò)增技術(shù)及分子信標(biāo)技術(shù)的優(yōu)點，使DNA在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，且隨著DNA的擴(kuò)增，分子信標(biāo)的熒光信號不斷被釋放，被釋放的目標(biāo)DNA又結(jié)合到新的分子信標(biāo)上，從而進(jìn)行下一輪的擴(kuò)增及熒光信號釋放。依靠DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)達(dá)到擴(kuò)增放大信號的目的，通過分子信標(biāo)的開環(huán)和閉環(huán)達(dá)到信號檢測的目的。由于DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)，消除了淬滅基團(tuán)由于熒光能量共振轉(zhuǎn)移對熒光基團(tuán)發(fā)光的影響。在沒有外加和環(huán)互補的DNA時，分子信標(biāo)處于閉合狀態(tài)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相鄰而不發(fā)光，而加入該DNA后環(huán)被打開，標(biāo)記的基團(tuán)之間距離增大，使淬滅基團(tuán)不能有效淬滅熒光，從而發(fā)出檢測信號。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明使DNA/RNA擴(kuò)增與信號檢測合為一體，且不需要額外標(biāo)記、雜交及洗滌過程，既簡化了操作步驟，提高效率，又可以將反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，從而避免了 PCR儀的使用。也可基因邊擴(kuò)增邊檢測，實現(xiàn)了芯片的實時檢測，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。同時，樣品中目標(biāo)DNA與分子信標(biāo)的雜交發(fā)生在分子信標(biāo)的環(huán)上，避免了傳統(tǒng)生物芯片由于雜交位于固相表面所產(chǎn)生的空間位阻的影響。因此，本發(fā)明分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增實時檢測基因芯片的研制，綜合了鏈置換反應(yīng)及分子信標(biāo)的優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)基因芯片的缺點，實現(xiàn)DNA及RNA生物表達(dá)水平的實時高通量的檢測，為功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床診斷與藥物篩選等領(lǐng)域中的DNA及RNA相關(guān)研究提供新方法。


圖I是本發(fā)明分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)示意圖(I :環(huán)狀區(qū)，2 :3’莖桿區(qū)，3 :5’莖桿區(qū)，4 :5’莖桿區(qū)延長段);
圖2是分子信標(biāo)、通用淬滅探針及通用引物之間的關(guān)系示意 圖3是技術(shù)原理及方案流程 圖4是丙型肝炎病毒檢測基因芯片實時熒光掃描結(jié)果(從左到右依次為丙型肝炎病毒RNA樣品組、乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組)；圖5是HIV病毒檢測基因芯片實時熒光掃描結(jié)果(從左到右依次為HIV病毒RNA樣品組I、HIV病毒RNA樣品組2、乙型肝炎病毒DNA樣品組、丙型肝炎病毒RNA樣品組)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實施例I
本實施例僅以醛基玻片為固相支持物，檢測丙型肝炎病毒RNA為例，說明本發(fā)明的研制及其應(yīng)用。(I)探針的設(shè)計及合成
試驗中所涉及的探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成， 針對丙型肝炎病毒RNA的檢測，設(shè)計了 I條分子信標(biāo)，序列如下
MB: NH-T2tlU TCA TCA TCA TCA TTCTTGGACACAkCT KkCQCCkTQQCT KQkCCTGTGTCCAAGA -FAM(SEQ ID N0:1)(T2CI為連接分子信標(biāo)與固相支持物的20個T，下劃線為環(huán)狀區(qū)序列，斜體為莖桿區(qū)序列，加粗為5’莖桿區(qū)延長段)；
通用淬滅探針GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:2)；
通用引物CTTTCTATCTTTCTATCTTGGAC (SEQ ID NO:3);
其中，分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)見圖1，分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)和淬滅探針及引物之間的關(guān)系，如圖2所示。通用淬滅探針與分子信標(biāo)的5’莖桿區(qū)延長段特異互補，通用引物與分子信標(biāo)的3’莖桿區(qū)特異性互補。(2)芯片的設(shè)計及點樣
玻片醛基化玻片(購自博奧生物科技有限公司)
(i)將上述氨基修飾的分子信標(biāo)，用4X SSC溶解，配置濃度為200 nM，并在95°C變性5分鐘，之后緩慢降至室溫，保持I小時，使分子信標(biāo)復(fù)性，并折疊成正確的結(jié)構(gòu)；
( )取上一步得到的產(chǎn)物和等量體積的DMSO混勻后，采用點樣儀，按照預(yù)先設(shè)計的排列順序，在上述醛基玻片上開始點樣；
(iii)點樣后，將芯片置于濕盒內(nèi)，密封濕盒，于42°C反應(yīng)過夜。然后用4XSSC清洗，去除沒有結(jié)合上的分子信標(biāo)。(3)樣品DNA/RNA及淬滅探針與芯片的雜交
將樣品DNA/RNA(1 nM)及淬滅探針(200 nM)混合液加入到已固定有分子信標(biāo)的玻片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內(nèi)，42°C雜交反應(yīng)I小時；雜交反應(yīng)后玻片用4X SSC (含O. 1%SDS)溶液洗滌兩次，最后用超純滅菌水清洗2遍，置于離心管中離心，去掉表面液體并室溫自然干燥。(4)芯片上的等溫鏈置換反應(yīng)及芯片的實時檢測
將含通用引物(10 nM)的鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液(200 μ L)加到步驟(3)中的微陣列芯片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，42°C等溫擴(kuò)增lh，并在芯片掃描儀下進(jìn)行實時掃描，記錄突光信號，根據(jù)Robust Multiple-array Average (RMA)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液(200 μ L)的組成為5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M each dNTPs,40 mM Tris-HCl ρΗ7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20
本次實驗設(shè)三個實驗組(丙型肝炎病毒RNA樣品組、乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組)，各組均設(shè)一個空白對照(以去離子水替代分子信標(biāo))。實驗結(jié)果如圖4所示僅丙型肝炎病毒RNA樣品組具有熒光信號，熒光強度為8. 27855，根據(jù)RMA分析，其核酸濃度為I. 0524nM,乙型肝炎病毒DNA樣品組和HIV病毒RNA樣品組、以及各空白對照組均沒有熒光信號，說明本方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。實施例2
本實施例僅以醛基玻片為固相支持物，檢測HIV病毒RNA為例，說明本發(fā)明的研制及其應(yīng)用。(I)探針的設(shè)計及合成
試驗中所涉及的探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，
針對HIV病毒RNA的檢測，設(shè)計了 I條分子信標(biāo)，序列如下
MB: NH-To.-^TCATCATCATCATTCTTGGACACAQkkCCkkQQQQkkCTQkCTGTGTCCAAGA-FAMi SEQID N0:4) (T2tl為連接分子信標(biāo)與固相支持物的20個T，下劃線為環(huán)狀區(qū)序列，斜體為莖桿區(qū)序列，加粗為5’莖桿區(qū)延長段)；
通用淬滅探針GTAGTAGTAGTA-TAMRA (SEQ ID N0:5)；
通用引物TCATCAATCAATCTTTCTTGGAC (SEQ ID N0:6)；
其中，分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)和淬滅探針及引物之間的關(guān)系，如圖2所示。通用淬滅探針與分子信標(biāo)的5’莖桿區(qū)延長段特異互補，通用引物與分子信標(biāo)的3’莖桿區(qū)特異性互補。(2)芯片的設(shè)計、淬滅探針雜交及點樣
玻片醛基化玻片(購自博奧生物科技有限公司)
(i)將上述氨基修飾的分子信標(biāo)和淬滅探針，用4X SSC混合溶解，配置濃度均為200nM，并在95°C變性5分鐘，之后緩慢降至室溫，保持I小時，使分子信標(biāo)復(fù)性，并折疊成正確的結(jié)構(gòu)，同時淬滅探針結(jié)合到分子信標(biāo)上；
( )取上一步得到的產(chǎn)物和等量體積的DMSO混勻后，采用點樣儀，按照預(yù)先設(shè)計的排列順序，在上述醛基玻片上開始點樣；
(iii)點樣后，將芯片置于濕盒內(nèi)，密封濕盒，于42°C反應(yīng)過夜。然后用4XSSC清洗，去除沒有結(jié)合上的分子信標(biāo)和探針。(3)樣品RNA與芯片的雜交
將樣品RNA (I nM)加入到已固定有分子信標(biāo)的玻片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，放置于密封濕盒內(nèi)，42°C雜交反應(yīng)I小時；雜交反應(yīng)后玻片用4 X SSC (含O. P/oSDS)溶液洗滌兩次，最后用超純滅菌水清洗2遍，置于離心管中離心，去掉表面液體并室溫自然干燥。(4)芯片上的等溫鏈置換反應(yīng)及芯片的實時檢測
將含通用引物(10 nM)的鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液(200 μ L)加到步驟(3)中的微陣列芯片上，用憎水硅烷處理的蓋玻片覆蓋溶液及微陣列，42°C等溫擴(kuò)增lh，并在芯片掃描儀下進(jìn)行實時掃描，記錄突光信號，根據(jù)Robust Multiple-array Average (RMA)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液(200 μ L)的組成為5 U polymerase Klenow fragmentexo- (Fermentas),50 μ M dNTPs, 40 mM Tris-HCl pH7. 8,10 mM DTT,10 mM MgCl20本次實驗設(shè)四個實驗組(HIV病毒RNA樣品組1、HIV病毒RNA樣品組2 (鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液中的dCTP以等濃度的FAM-11-dCTP代替))、乙型肝炎病毒DNA樣品組、丙型肝炎病毒RNA樣品組，各組均設(shè)一個空白對照(以去離子水替代分子信標(biāo))。實驗結(jié)果如圖5所示乙型肝炎病毒DNA樣品組和丙型肝炎病毒RNA樣品組、以及各空白對照組均沒有熒光信號，僅HIV病毒RNA樣品組及HIV病毒RNA樣品組2具有熒光信號，HIV病毒RNA樣品組熒光強度分別為7. 7218，根據(jù)RMA分析，其核酸濃度為O. 9986nM，HIV病毒RNA樣品組2熒光強度為10. 63853，HIV病毒RNA樣品組2的熒光值高于HIV病毒RNA樣品組的熒光值，證明FAM-I Ι-dUTP對dCTP的替換能起到提高熒光信號的作用，說明本方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
權(quán)利要求
1.一種采用分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測目標(biāo)DNA/RNA的方法，包括如下步驟 (1)分子信標(biāo)的設(shè)計分子信標(biāo)包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中，環(huán)狀區(qū)能與目標(biāo)DNA/RNA特異結(jié)合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8 25個堿基，標(biāo)記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)連接環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；分子信標(biāo)3’端修飾有熒光分子； (2)芯片點樣與鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)將分子信標(biāo)5’端固定到固相支持物表面，形成分子信標(biāo)微陣列芯片，然后將淬滅探針及樣品DNA/RNA與芯片進(jìn)行雜交，洗滌，然后將鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、引物加到微陣列芯片上，等溫擴(kuò)增目的基因； 或者是將分子信標(biāo)與淬滅探針混合，點樣固定到固相支持物表面，形成分子信標(biāo)微陣列芯片，然后將鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、引物及樣品DNA/RNA加到微陣列芯片上，等溫擴(kuò)增目的基因； 所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸序列，至少有8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補；所述引物與3’莖桿區(qū)互補； (3)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行熒光數(shù)值分析，根據(jù)熒光值，確定樣品DNA是否為目標(biāo)DNA及其含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)為長度15 30個堿基的序列；5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)的互補序列長5 11個堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信標(biāo)的5’端連接有10 30個胸腺嘧啶或腺嘌呤。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述分子信標(biāo)的5’末端修飾氨基，固相支持物表面修飾醛基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，分子信標(biāo)3’端標(biāo)記的熒光分子為FAM、HEX、TET、FITC、Cy3、Cy5、Cy5. 5、PE、TAMRA、ROX、Texas RecUAMCA、JOE、rhodamine、bodipy、Alexa dye等有機熒光染料或量子點等無機染料中的任一種；淬滅探針上的熒光淬滅基團(tuán)為 P-苯二胺(Para-phenylene diamine, PPD)、η-丙基沒食子酸鹽(propyl gallate,NPG)、1，4- 二偶氮雙環(huán)(2，2,2)-辛烷(1，4-diazobicyelo (2,2,2)-octane,DABC0)、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、Eclipse、Iowa Black、納米金顆粒中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述固相支持物為玻片、塑料片、微球、磁珠中的任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液的組成為50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，I. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，可在鏈置換等溫擴(kuò)增過程中，所加入的dCTP用熒光標(biāo)記。
9.一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測試劑盒，包括固定在固相支持物表面的分子信標(biāo)、淬滅探針、引物、鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液，其中 所述分子信標(biāo)包括環(huán)狀區(qū)、5’莖桿區(qū)和3’莖桿區(qū)；其中環(huán)狀區(qū)能與目標(biāo)DNA/RNA特異結(jié)合，5’莖桿區(qū)的序列比3’莖桿區(qū)長出8 25個核苷酸，標(biāo)記為5’莖桿區(qū)延長段，5’莖桿區(qū)靠近環(huán)狀區(qū)部分的序列與3’莖桿區(qū)序列互補與3’莖桿區(qū)序列互補，使得形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；分子信標(biāo)的3’端修飾有熒光分子； 所述淬滅探針為5’端修飾有熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸序列，至少8個堿基與5’莖桿區(qū)延長段互補； 所述引物與3’莖桿區(qū)互補。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈置換等溫擴(kuò)增反應(yīng)液的組成為50mM Tris-HCl pH 7· 0 8· 0，1. 5 mM MgSO4,10 mM 二硫蘇糖醇(DTT)，50 400 μ M 每種 dNTP，20 μ g/ml BSA，25 100 U/ml DNA 聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子信標(biāo)鏈置換等溫擴(kuò)增基因芯片檢測技術(shù)及試劑盒。本發(fā)明綜合鏈置換等溫擴(kuò)增技術(shù)及分子信標(biāo)技術(shù)的優(yōu)點，使DNA在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，且隨著DNA的擴(kuò)增，分子信標(biāo)的熒光信號不斷被釋放，被釋放的目標(biāo)DNA又結(jié)合到新的分子信標(biāo)上，從而進(jìn)行下一輪的擴(kuò)增及熒光信號釋放。依靠DNA聚合酶的鏈置換反應(yīng)達(dá)到擴(kuò)增放大信號的目的，通過分子信標(biāo)的開環(huán)和閉環(huán)達(dá)到信號檢測的目的。本發(fā)明使DNA/RNA擴(kuò)增與信號檢測合為一體，且不需要額外標(biāo)記、雜交及洗滌過程，既簡化了操作步驟，提高效率，且實現(xiàn)了芯片的實時檢測，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102888457SQ20121036182
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者龔桂香 申請人:江陰天瑞生物科技有限公司