專利名稱：細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基及細菌纖維素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及細菌纖維素的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
細菌纖維素(Bacterial Cellulose，BC)是一類由微生物產(chǎn)生的純纖維素，是葡萄糖單體分子以β_1，4-糖苷鍵聚合而成的高分子聚合物。與植物纖維相比，BC不含木質(zhì)素和半纖維素，具有優(yōu)良的生物親和性、生物相容性、生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性，被公認為世界上安全的性能優(yōu)異的新型生物材料。在食品、造紙、聲學(xué)器材、石油開采和人造皮膚、醫(yī)用材料等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。雖然BC因其優(yōu)越性能，有廣泛應(yīng)用前景，但產(chǎn)量低、附加值高是限制其進一步應(yīng)用的“瓶頸”，這是菌株本身具有的代謝特性決定的。微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的目標(biāo)在于提高 代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，但是在某種意義上來看結(jié)果具有不可預(yù)知性，這是由于菌株所具有的代謝特性所造成的。由于發(fā)酵過程的非線性、時變性和生物傳感器的缺乏以及各參數(shù)之間的嚴(yán)重關(guān)聯(lián)，給發(fā)酵過程建模帶來了很大的困難。發(fā)酵過程中因素復(fù)雜多變，并且各因素之間的交叉影響，試驗因素與其結(jié)果之間具有較強的離散性，因此使用常規(guī)方法建立的發(fā)酵模型相對而言比較粗放，誤差大。所以，無法通過常規(guī)方法確定細菌纖維素合理的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前細菌纖維素產(chǎn)量低的問題，而提供的一種細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基及細菌纖維素的發(fā)酵方法。本發(fā)明細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成。利用上述細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的細菌纖維素發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的細菌纖維素產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。本發(fā)明方法適用于多種細菌纖維素產(chǎn)生菌，如漢氏葡糖醋桿菌DHM1_3(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是武漢市，武漢大學(xué)，保藏日期為2010年12月5日，保藏號為 CCTCC NO :M2010332)、Gluconacetobacter europaeus 和醋化醋桿菌。米用本發(fā)明發(fā)酵方法發(fā)酵培養(yǎng)的漢氏葡糖醋桿菌、Gluconacetobacter europaeus和醋化醋桿菌的細菌纖維素產(chǎn)量大幅提升，增加量均超過80%。通過發(fā)酵培養(yǎng)基的改變，改變了細菌纖維素產(chǎn)生菌的代謝流量，其中更是涉及現(xiàn)代代謝工程理論及代謝通量、代謝物組學(xué)等方面的因素，因此，本發(fā)明不是簡單培養(yǎng)基成分的調(diào)整。漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3(Gluconacetobacter hansenii DHM1-3)為漢氏葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter hansenii),屬于葡糖醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter);保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是武漢市，武漢大學(xué)，保藏日期為2010年12月5日，保 藏號為 CCTCC NO M2010332o


圖I是優(yōu)化前后細菌纖維素發(fā)酵代謝流分布。圖2是基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵過程曲線圖，“ ”曲線為殘?zhí)呛壳€，“〇”曲線為乙酸產(chǎn)量曲線，曲線為乙醇殘余量曲線，“■”曲線為菌體含量曲線，“▲”曲線為BC產(chǎn)量曲線。圖3是具體實施方式
五使用本發(fā)明細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵細菌纖維素的過程曲線圖，“ ”曲線為殘?zhí)呛壳€，“〇”曲線為乙酸產(chǎn)量曲線，曲線為乙醇殘余量曲線，“ ■”曲線為菌體含量曲線，“▲”曲線為BC產(chǎn)量曲線。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23 %的磷酸氫二鈉、O. 454 % O. 458 %的磷酸氫二鉀、2. 22 % 2. 23 %的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基降低了 HMP途徑流量，有利于細菌纖維素的合成；在Acetate節(jié)點，減少了進入TCA循環(huán)的無效碳循環(huán)造成的浪費，從而使更多的代謝流量進入了細菌纖維素合成途徑。本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇和乳酸的添加，能快速氧化進入TCA循環(huán)用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化產(chǎn)生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途徑中關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而在滿足菌體生長所需能量的條件下，使代謝流量更多的進入細菌纖維素合成方向。本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基可控制發(fā)酵過程的pH值，確保更多代謝流量進入菌體生成及產(chǎn)物合成途徑,減少代謝副產(chǎn)物生成。
具體實施方式
二 本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225 %的磷酸氫二鈉、O. 455 % O. 457 %的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226 %的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
具體實施方式
三本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。本實施方式效果最佳。
具體實施方式
四本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；
二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的細菌纖維素產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發(fā)酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用本實施方式中的發(fā)酵培養(yǎng)基打破了細菌纖維素產(chǎn)生菌自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性，改變了代謝產(chǎn)物的積累，從而實現(xiàn)了對細胞代謝途徑的修飾，提高了細菌纖維素。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
四的不同點是步驟一中將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上，在30°C的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h ;固體培養(yǎng)基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、O. 1%的1(2即04、0. 1%的檸檬酸、0.025%的1%504、2%的瓊脂和余量的水組成。其它步驟及參數(shù)與實施方式四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氫二鈉、O. 455% O. 457%的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。其它步驟及參數(shù)與實施方式五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。其它步驟及參數(shù)與實施方式五相同。
具體實施方式
八本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的細菌纖維素產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332% 的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發(fā)酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。分別選用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4^P余量的蒸餾水組成)，功能驗證細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量百分比由3. 9789%的葡萄糖、O. 3396%的牛肉膏、O. 1933%的酵母膏、O. 2230%的磷酸氫二鈉、O. 4565%的磷酸氫二鉀、2. 2255%的乙醇和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5)和本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基進行對比發(fā)酵試驗和理論研究。采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基進行細菌纖維素產(chǎn)生菌的發(fā)酵生產(chǎn)，在Acetate節(jié)點優(yōu)化前流量的70. 78%進入TCA循環(huán)，并且整個代謝途徑中大多流量進入了無效循環(huán)造成碳源浪費；而采用本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基有23. 03%的流量進入TCA循環(huán)，41. 28%流量進入了乙酸途徑。本實施方式中添加檸檬酸鈉對細菌纖維素產(chǎn)量有重大影響，使之與基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基相比產(chǎn)量顯著增加。檸檬酸鈉可加快丙酮酸向AcCOA的轉(zhuǎn)變，加速乙酸的消耗，減少胞外乙酸的積累，使得發(fā)酵前期進入乙酸副產(chǎn)物生成途徑流量減少，并更早的被利用進入生成細菌纖維素途徑，提高細菌纖維素產(chǎn)量。檸檬酸鈉的加入能使發(fā)酵后期甘油加速分解利用，甘油通過FADH2進入呼吸鏈參與能量代謝。實驗證明檸檬酸鈉使發(fā)酵的代謝轉(zhuǎn)變更早發(fā)生，檸檬酸鈉不僅能很好的調(diào)控代謝流量，使之更多的進入細菌纖維素生成途徑。發(fā)酵液及胞內(nèi)的pH值降低是由發(fā)酵液中有機酸的積累造成的，而低pH影響生物合成途徑中關(guān)鍵酶，同樣較低的PH也使得細胞活力受到影響，因此，pH過低不僅影響發(fā)酵環(huán)境，還會增加副產(chǎn)物的產(chǎn)生，限制了 BC的形成。檸檬酸鈉具有很好pH緩沖及調(diào)節(jié)性能，可為細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基維持較高的pH值；而且檸檬酸鈉能增強PDH活性，增加PYR等有機酸的消耗，能進一步的維持較高PH值，提升BC產(chǎn)量。pH動態(tài)平衡依賴于ATP，ATP供給增強可促進該平衡過程，檸檬酸鈉是一種弱酸強堿鹽，具有良好的PH調(diào)節(jié)和緩沖性能，檸檬酸鈉的添加有利于ATP能量的轉(zhuǎn)化。此外，檸檬酸鈉可抑制PK酶活，減少了有機酸等代謝副產(chǎn)物的生成；而且能影響PYR節(jié)點途徑流量分配，減少副產(chǎn)物生成，提高BC的產(chǎn)量。EMP途徑中，檸檬酸鈉起到主要的調(diào)控作用，使丙酮酸激酶酶活大大降低，產(chǎn)生的乙酸和丙酮酸副產(chǎn)物后期進入糖異生途徑被利用合成細菌纖維素；TCA途徑中，發(fā)酵初期本實施方式中細菌纖維素產(chǎn)生菌的丙酮酸脫氫酶O3DH)酶活比優(yōu)化前提高3. 5855倍以上，檸檬酸副產(chǎn)物大大減少；丙酮酸脫氫酶酶活活性被提高，而I3DH作為TCA循環(huán)的前體物質(zhì)乙酰CoA生成的關(guān)鍵酶，催化PYR氧化脫羧生成乙酰CoA，同時將NAD+還原為NADH，為生物體供應(yīng)充足能量；同時乙酰CoA的增加，一方面加速TCA循環(huán)，為菌體生長和BC合成提供能量；另一方面，可以激活丙酮酸羧化酶，加速PYR生成草酰乙酸，促進糖異生，合成更多BC。本實施方式細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中朽1檬酸鈉最大的作用不是在抑制丙酮酸激酶，而是減少代謝流進入代謝副產(chǎn)物和無效循環(huán)途徑。從整個發(fā)酵過程來看，發(fā)酵初期在滿足菌體快速生長的同時，代謝流快速進入能量代謝和代謝副產(chǎn)物生成方向，發(fā)酵中期胞外代謝副產(chǎn)物出現(xiàn)明顯的代謝轉(zhuǎn)變，部分代謝副產(chǎn)物被利用，此時糖異生途徑被強化，產(chǎn) 物合成速率加快?？刂埔宜岷蚑CA循環(huán)之間的流量分配，降低乙酸、檸檬酸等代謝副產(chǎn)物的生成，從而提高細菌纖維素產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率。乙醇快速氧化轉(zhuǎn)化為乙酸，產(chǎn)生菌體生長及產(chǎn)物生成所需能量，所以本實施方式發(fā)酵初期乙醇主要起到提高能量的調(diào)控作用。乙醇的加入可調(diào)控碳流通過G6P節(jié)點進入BC直接合成途徑，而且乙醇快速產(chǎn)生的高能荷增強PDH活性，致使TCA循環(huán)流量減少，減少了檸檬酸的產(chǎn)生和碳源浪費，達到了提高BC產(chǎn)量的目的。并且乙醇的添加活躍HMP途徑，大量代謝流通過HMP途徑進入EMP途徑，增強菌體呼吸代謝能力，使PK酶活大幅升高(而PK酶活過高不利于產(chǎn)物積累)，為初級代謝提供能量；但同時因為本實施方式中檸檬酸鹽與葡萄糖的聯(lián)合代謝會增加胞內(nèi)Ca2+的濃度，從而強烈抑制PK酶的活力，減慢EMP過程，糖異生途徑相應(yīng)地增強，因此BC產(chǎn)量增加，副產(chǎn)物的生成相應(yīng)地減少；同時發(fā)酵初期HMP途徑生成大量能量滿足了菌體生長及產(chǎn)物合成的需要，此時高活性的PDH催化產(chǎn)生的乙酰CoA激活丙酮酸羧化酶，加速PYR通過草酰乙酸進入糖異生途徑，進行產(chǎn)物合成，此時乙酰CoA進入TCA途徑流量減少，因此本實施方式發(fā)酵過程中檸檬酸積累量遠低于采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基。采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基PK酶活整個發(fā)酵過程比較低，這是因為發(fā)酵過程HMP途徑較弱，為菌體生長提供的所需能量及中間產(chǎn)物不足造成的。與采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基相比，功能驗證細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵初期HK酶活是前者的2. 71倍，G6PDH為前者2. 43倍，實驗結(jié)論與Takaaki等(TakaakiNaritomi, Tohrukouda, Fumihiro Yoshinagaet al. Effect of Ethanol on BacterialCelluose Prodution from Fructosein Continuous Culture. Journal Of FermentationAnd Bioengineering, 95 (1998)，598-603.)添加乙醇抑制G6PDH的結(jié)論不同，添加乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵初期G6TOH酶活依舊較高。在本實施方式發(fā)酵中后期G6TOH活性受到抑制，說明發(fā)酵初期乙醇在通過HMP途徑快速提供菌體生長所需能量及前體物質(zhì)方面具有重要作用；乙醇調(diào)控對HK、G6PDH影響較大。本實施方式發(fā)酵過程中乙酸積累下降，是由于添加檸檬酸鈉，PK酶活降低，EMP途徑減弱，需要更多乙醇通過TCA為菌體供能，則乙酸鹽轉(zhuǎn)化成乙酸的產(chǎn)量減少；同時糖異生途徑的增強也會加速乙酸的利用。本實施方式發(fā)酵過程中PYR積累量明顯提高；這種結(jié)果與酶活變化并沒有明顯的相關(guān)性；是因為檸檬酸鈉降低PK酶活，EMP途徑被抑制，糖異生途徑增強，乙酸、甘油作為底物形成PYR進入糖異生途徑，使得PYR積累量進一步增加。本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法可明顯提高BC產(chǎn)量。
具體實施方式
五本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成； 三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發(fā)酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發(fā)酵試驗。以基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵方法為優(yōu)化前，以本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法為優(yōu)化后，根據(jù)分析和實驗得出漢氏葡糖醋桿菌DHM1-3優(yōu)化前后細菌纖維素發(fā)酵代謝流分布(如圖I所示，由于PFK缺乏或者活性很低，在構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)時忽略了 F6P — G3P的反應(yīng)。HPM途徑和TCA循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶反應(yīng)是NADPH的主要合成途徑。產(chǎn)生的NADPH主要用于生物合成。由于HMP代謝葡萄糖產(chǎn)生NADPH，然后進入TCA循環(huán)，這個過程中并沒有代謝分支；HMP代謝網(wǎng)絡(luò)簡化為G6P — RU5P — 2/3F6P+1/3G3P)。圖I中以葡萄糖的摩爾消耗速率為100計，得到各產(chǎn)物生成速率對應(yīng)葡萄糖消耗速率的比值。將這些速率代入矩陣，通過MATLAB利用最小二乘法計算得到優(yōu)化前后代謝流分布。HMP途徑中G6P到RU5P的反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，TCA循環(huán)中a-酮戊二酸脫氫酶和檸檬酸合成酶催化的反應(yīng)也是不可逆的，由此得到的代謝通量分布圖中并沒有出現(xiàn)負值，因此計算得到的代謝流量沒有違背生化熱力學(xué)條件，說明構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)較為合理。由圖I可以看出，葡萄糖主要經(jīng)過HM、TCA途徑進行能量代謝，并為菌體生成提供核酸、蛋白質(zhì)、脂肪、小分子中間代謝產(chǎn)物等。剩余的代謝流量進入細菌纖維素合成途徑或者代謝流溢流進入無效循環(huán)。對比優(yōu)化前后代謝通量分布發(fā)現(xiàn)，菌體生長通量相差不大；HMP途徑代謝流量由優(yōu)化前的90. 77降為74. 9 ;優(yōu)化后碳流量在流向生成大量菌體的同時，有22. 8%的流量進入細菌纖維素合成途徑，優(yōu)化前的細菌纖維素合成流量只占6. 68%。對比優(yōu)化前后菌體生物量及產(chǎn)物產(chǎn)量，可知細菌纖維素的合成與菌體的生長密切相關(guān)，但菌體的大量生長并不是細菌纖維素產(chǎn)量提高的直接原因。碳代謝流量先充分滿足菌體合成后，才轉(zhuǎn)入次生代謝產(chǎn)物的合成和代謝副產(chǎn)物的生成。優(yōu)化前后代謝通量分布另一個區(qū)別就是優(yōu)化前乙酸通量為0，而優(yōu)化后乙酸通量高達41. 28%。這也可能是影響優(yōu)化后培養(yǎng)基細菌纖維素產(chǎn)量繼續(xù)提高的一個原因。因為乙醇的添加和快速氧化，在快速提高能量增加細菌纖維素產(chǎn)量的同時，也增加了乙酸的產(chǎn)生，從而惡化發(fā)酵液環(huán)境，影響菌體和細菌纖維素產(chǎn)量繼續(xù)增加，使流量更多的進入無效循環(huán)。而優(yōu)化前乙酸為0，細菌纖維素產(chǎn)量很低，可能的原因是HMP和TCA產(chǎn)生的能量僅用于菌體生成，而細菌纖維素合成途徑可能受到阻礙或者反饋調(diào)節(jié)沒被解除，或者是生成的乙酸，在能量不足的情況下直接被氧化利用，使之無法積累。優(yōu)化前進入HMP的流量是90. 77，細胞多糖合成是2. 55，細菌纖維素合成是6. 68。這個過程所需能量主要是通過HMP代謝葡萄糖和TCA循環(huán)得到。細菌纖維素產(chǎn)量過低可能是在HMP和TCA循環(huán)過程中產(chǎn)生較多的無效循環(huán)所致。
優(yōu)化后進入HMP的流量是74. 9，細胞多糖合成是2. 3，細菌纖維素合成是22. 8。與優(yōu)化前通量相比，后者代謝流量發(fā)生了較大改變。優(yōu)化后^(22.8)/^5(74.9) = 0.304，而優(yōu)化前r2 (6. 68) /r5 (90. 77) = O. 07。也就是說優(yōu)化后碳代謝流更多流向細菌纖維素合成方向，從而使其產(chǎn)量比優(yōu)化前有了大幅提高。造成這種情況的原因，是乙醇和檸檬酸鈉的添力口，能快速氧化進入TCA循環(huán)用于能量生成；另外由于乙醇的快速氧化產(chǎn)生高能荷的ATP，而高能荷的ATP是HMP途徑中關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而在滿足菌體生長所需能量的條件下，使代謝流量更多的進入細菌纖維素合成方向。對于Acetate節(jié)點，流入F6P和PYR的流量都是來自于HMP,通過Acetate進入乙酸和AcCOA0 F6P生成Acetate涉及一系列生化反應(yīng)，它是替代EMP途徑使代謝流進入TCA循環(huán)，這與HMP中間產(chǎn)物有關(guān)。優(yōu)化前后的最大差別就是，優(yōu)化前來自于HPM流量的81. 2進入了 AcCOA，而優(yōu)化后41. 28的流量進入了乙酸途徑，僅有30. 17的流量進入AcCOA。從整個途徑來看，優(yōu)化前沒有乙酸產(chǎn)生可能是某些代謝途徑障礙所致。而優(yōu)化后產(chǎn)生大量乙酸是乙醇快速氧化的結(jié)果，并不是細菌纖維素產(chǎn)量提高的原因。在細菌纖維素合成過程中，除乙酸外，葡萄糖酸的產(chǎn)生也使pH快速下降。另外，發(fā)酵后期由于菌體進入衰亡期，纖維素的生物合成變慢，出現(xiàn)代謝溢流，使代謝流發(fā)生遷移，更多的流量進入代謝副產(chǎn)物生產(chǎn)途徑。這些副產(chǎn)物的形成可能與條件控制直接相關(guān)。因此基于代謝流分析，可以看出本實施方式從遺傳角度和發(fā)酵控制方面使副產(chǎn)物的生成減少，就能達到代謝流遷移的目的，從而增大細菌纖維素生物合成途徑的流量?；炯毦w維素發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵過程曲線圖如圖2所示，本實施方式使用本發(fā)明細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵細菌纖維素的過程曲線圖如圖3所示。測得基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 232g/L，產(chǎn)量一直增加不明顯，本實施方式每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中細菌纖維素產(chǎn)量增加很快，跟菌體生長趨勢相似，所獲得的細菌纖維素膜膜干重為3. 362g/L，增重克數(shù)為2. 13g/L，細菌纖維素增產(chǎn)173%。在底物消耗方面，兩種培養(yǎng)基發(fā)酵過程基本相似，都在第一天都有一個快速消耗，這與漢氏葡糖醋桿菌獨特的代謝途徑相關(guān)，有部分葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，這也是致使發(fā)酵液pH值降低很快，影響細菌纖維素產(chǎn)量的一個重要原因。此后兩天耗糖不高，基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基在第三天進入快速耗糖期，直至發(fā)酵終止耗糖并沒減慢，與菌體生長相適應(yīng)，可能相當(dāng)一部分消耗的糖都進入菌體生長途徑。本實施方式在第四天進入快速耗糖期，到最后一天有個小幅減慢過程。兩者殘?zhí)欠謩e為26. 5g/L和18. 5g/L，但兩者的糖利用率都不高，分別為41%和47% ;而本實施方式與基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基最大的不同就是添加了乙醇，乙醇從發(fā)酵開始就快速消耗，直至第四天耗盡，葡萄糖才開始進入快速消耗期。乙醇在發(fā)酵開始就快速氧化，為菌體生長代謝和產(chǎn)物生成提供足夠的能量，從而使更多的碳代謝流量進入產(chǎn)物合成途徑。這也解釋了耗糖量相差不大，本實施方式產(chǎn)量卻是基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的2. 73倍的情況。基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中可能因為乙酸代謝途徑或者別的代謝途徑出現(xiàn)障礙，代謝中間產(chǎn)物出現(xiàn)積累，影響了碳代謝流通過糖異生非直接途徑合成細菌纖維素。本實施方式發(fā)酵過程中乙酸有了一定積累，但后期乙酸量減少，原因可能是因為發(fā)酵前期乙醇快速氧化產(chǎn)生的能量被利用，而乙醇被氧化轉(zhuǎn)化成乙酸，后期能量不夠乙酸作為底物又被重新利用?；炯毦w維素發(fā)酵培養(yǎng)基中代謝流發(fā)生了遷移，大量進入了無效循環(huán)，造成碳 源浪費。本實施方式使得產(chǎn)物產(chǎn)量有了明顯提高更適合菌體生長和發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素。
具體實施方式
六本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的醋化醋桿菌接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的醋化醋桿菌轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、O. 3%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的ΚΗ2Ρ04、0. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發(fā)酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發(fā)酵試驗。測得基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為O. 57g/L，本實施方式每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 04g/L，增重克數(shù)為O. 47g/L，細菌纖維素增產(chǎn)82. 46%。
具體實施方式
八本實施方式細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施一、將保存的Gluconacetobacter europaeus接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化；二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的Gluconacetobacter europaeus轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，種子培養(yǎng)基按重量百分比由2 %的蔗糖、O. 3 %的酵母膏、O. 5 %的蛋白胨、O. 2 %的ΚΗ2Ρ04、O. 015%的MgSO4和余量蒸餾水制成；三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵；步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6. 5。細菌纖維素發(fā)酵完成后所生成的細菌纖維素膜浮于液面，膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將膜浸泡于O. IM的NaOH溶液中100°C煮沸20min，然后去 除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明；之后再用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測PH值，至pH值約為7. 2后80°C干燥至恒重，進行稱重。采用基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量百分比由5%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5% 的蛋白胨、O. 2% 的 Na2HPO4'O. 1%的 K2HPO4、O. I % 的檸檬酸、O. 025% 的 MgSO4 和余量的蒸餾水組成)進行對比發(fā)酵試驗。測得基本細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為O. 89g/L，本實施方式每升細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中所獲得的細菌纖維素膜膜干重為I. 87g/L，增重克數(shù)為O. 98g/L，細菌纖維素增產(chǎn)110. 11%。
權(quán)利要求
1.細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O. 30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O.21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O. 454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O. 19% O.21 %的酵母膏、O. 215 % O. 225 %的磷酸氫二鈉、O. 455 % O. 457 %的磷酸氫二鉀、2.225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92%的葡萄糖、O. 332%的牛肉膏、O. 191%的酵母膏、O. 218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2 %的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成。
4.采用權(quán)利要求I所述細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的細菌纖維素發(fā)酵方法，其特征在于細菌纖維素的發(fā)酵方法按以下步驟實施 一、將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行菌種平板活化； 二、種子培養(yǎng)用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上活化的細菌纖維素產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，再放置于溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,種子培養(yǎng)基按重量百分比由2%的蔗糖、0.3%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.2%的KH2PO4、O. 015 %的MgSO4和余量蒸餾水制成； 三、發(fā)酵培養(yǎng)按體積7%的接種量將種子培養(yǎng)基接入細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后靜置于28°C條件下的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，即完成細菌纖維素的發(fā)酵； 步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 5% 4. 5%的葡萄糖、O.30% O. 36%的牛肉膏、O. 18% O. 22%的酵母膏、O. 21% O. 23%的磷酸氫二鈉、O.454% O. 458%的磷酸氫二鉀、2. 22% 2. 23%的乙醇、O. 15% O. 25%的檸檬酸鈉和余量的蒸懼水組成，初始pH值為6. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細菌纖維素的發(fā)酵方法，其特征在于步驟一中將保存的細菌纖維素產(chǎn)生菌接種到固體培養(yǎng)基上，在30°C的恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h ;固體培養(yǎng)基按重量百分比由3%的葡萄糖、O. 5%的酵母膏、O. 5%的蛋白胨、O. 2%的Na2HP04、0. 1%的Κ2ΗΡ04、0. I %的檸檬酸、O. 025%的MgS04、2%的瓊脂和余量的水組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細菌纖維素的發(fā)酵方法，其特征在于步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 8% 4. 2%的葡萄糖、O. 32% O. 34%的牛肉膏、O.19% O. 21%的酵母膏、O. 215% O. 225%的磷酸氫二鈉、O. 455% O. 457%的磷酸氫二鉀、2. 225 2. 226%的乙醇、O. 18% O. 22%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始pH值為6.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細菌纖維素的發(fā)酵方法，其特征在于步驟三中細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量百分比由3. 92 %的葡萄糖、O. 332 %的牛肉膏、O. 191 %的酵母膏、O.218%的磷酸氫二鈉、O. 456%的磷酸氫二鉀、2. 226%的乙醇、O. 2%的檸檬酸鈉和余量的蒸餾水組成，初始PH值為6. 5。
全文摘要
細菌纖維素高產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基及細菌纖維素的發(fā)酵方法，涉及一種細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基及細菌纖維素的發(fā)酵方法。它解決了目前細菌纖維素產(chǎn)量低的問題。培養(yǎng)基由葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、乙醇、檸檬酸鈉和蒸餾水組成。發(fā)酵方法一、菌種活化；二、種子培養(yǎng)；三、發(fā)酵培養(yǎng)。采用本發(fā)明技術(shù)細菌纖維素產(chǎn)量大幅提升，增加量均超過80％。本發(fā)明可用于細菌纖維素生產(chǎn)領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/01GK102827897SQ20121036208
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者雷虹, 李元敬, 張基亮, 陳雪梅, 田華, 平文祥, 韓德權(quán) 申請人:黑龍江大學(xué)