專利名稱：一種利用磁珠提取全血基因組dna的試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組DNA的提取方法，特別涉及一種利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DNA作為遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象。提取基因組DNA是許多分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)，在諸如基因組測序、Southern雜交、PCR擴增、構(gòu)建BCA文庫、分子克隆等常規(guī)實驗中，獲得高分子量、高純度的基因組DNA是開展研究工作的重要前提。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入發(fā)展，在基因水平上對疾病進(jìn)行檢測、診斷已經(jīng)成為臨床診斷的一項基本技術(shù)手段；尤其是法醫(yī)學(xué)中的個體識別、親子鑒定等，對所提取基因組DNA的完整性及純度要求更高。血液取材方便可靠，因此許多研究均以血液作為材料以提取完整的基因組DNA。而出于對實驗成本、工作效率等多方面因素的考慮，研究人·員希望盡可能一次性獲取最大采血量(2-10ml)的基因組DNA，以進(jìn)行長期保存，滿足長期、反復(fù)、多種研究的需要?；蚪MDNA提取一般需遵循以下幾個原則1、保證提取的DNA具有一定的長度；2、純化后不應(yīng)存在對沒有抑制作用的物質(zhì)；3、排除有機溶劑和金屬離子污染；4、蛋白質(zhì)、多糖、脂類等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。對于范圍在2-10ml血樣的基因組DNA提取，經(jīng)典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反復(fù)抽提，此過程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁瑣、耗時耗力，極易造成樣本的丟失和污染。目前市場上商品化的離心柱型試劑盒操作簡單，但一般只能滿足微量全血(100-500ul)的提取需求，而對于中大量血液的基因組提取，則操作中會包含反復(fù)的移液、離心，易造成樣本的交叉污染。磁珠法是近幾年才發(fā)展起來的核酸提取方法。磁珠是指直徑幾十納米至數(shù)微米，在磁場下表現(xiàn)出磁性，由無機/有機或者無機/無機材料組成的外形呈現(xiàn)為球狀的復(fù)合粒子。運用此法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有機溶劑，提取的核酸純度高、產(chǎn)量大。專利號為 200810200588. X,200910223901. 6,200910307632. 1,201110124322. 3 的專利分別公開了利用磁珠提取核酸的試劑盒或者方法，但都只是針對血液或其他來源樣本中的病毒核酸所設(shè)計，并未涉及到血液基因組DNA的提??；專利號20101035963. 4的專利公開了 “一種用磁珠分離基因組DNA的試劑盒及其應(yīng)用”，其應(yīng)用主要針對于從動植物組織中提取基因組DNA ;專利號201010153890. I的專利公開了一種“血液基因組磁珠小提試劑盒極其提取方法”，此試劑組成和方法，只適用于小樣本量(50-200ul)血液的基因組DNA提取，對于大體積樣本的提取，則容易受到紅細(xì)胞及血液其他組分的干擾和污染，無法適用于對基因組需求量較大的試驗研究，這也是目前國內(nèi)市場上磁珠法全血基因組試劑盒所面臨的技術(shù)瓶頸。因此，提供一種可從大體積全血樣本中提取基因組DNA的方法和試劑盒，并且操作簡單、成本低廉、提取的基因組產(chǎn)量高、質(zhì)量佳，對于滿足臨床診斷和研究人員對樣本長期保存、反復(fù)使用的需求是很有必要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用磁珠提取中大量全血基因組DNA的方法和試劑盒，特別針對較大樣本量(2-10ml)的全血材料，經(jīng)過對血液組分的簡單處理，即可去除大部分雜質(zhì)，利用單分散磁性微球特異吸附基因組DNA，僅需簡單的漂洗步驟，即可獲得產(chǎn)量高、純度好、片段完整的基因組DNA，適用于PCR檢測、酶切反應(yīng)、分子雜交、測序等下游實驗。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，所述試劑盒由磁珠懸浮液、基因提取液和磁架構(gòu)成；所述磁珠懸浮液以氯化鐵和氯化亞鐵為磁性材料，在氮氣和氫氧化鈉的作用下，通過化學(xué)共沉淀形成磁性粒子，再將磁性粒子用硅酸鈉修飾，水分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述基因提取液包括紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、結(jié)合液、蛋白酶K工作液、漂洗液I、漂洗液2、漂洗液3和洗脫液；所述紅細(xì)胞裂解液終濃度組成為10(T200mmOl/L氯化銨、5 20mmol/L鉀鹽，O. 05 O. lmmol/LEDTA，溶劑為水，pH 為 7. 0 8· O ；所述細(xì)胞裂解液終濃度組成為50 200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽a、5(Tl00mmol/L螯合劑、500 800mmol/L鈉鹽和質(zhì)量終濃度O. 5^5%十二磺基硫酸鈉，溶劑為水，pH為7. (Γ8. 0，所述螯合劑為EDTA (乙二胺四乙酸)；·所述結(jié)合液終濃度組成為2 8mol/L離液鹽a、0. 2^2mol/L醋酸鈉，溶劑為水，pH為4. (Γ6. 0，所述離液鹽a為鹽酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉、碘化鉀、高氯酸鈉或氯化鋰；所述漂洗液I終濃度組成為1 4 mo I/L的離液鹽b，0. f 2mol/L醋酸鈉，體積終濃度2(Γ30%的無水乙醇，溶劑是水，pH值4.(Γ 6. 0，所述離液鹽b為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或高氯酸鈉；所述漂洗液2終濃度組成為1 4 mol/L的離液鹽c，0. f 2mol/L醋酸鈉，體積終濃度5(Γ70%的無水乙醇，pH值4. (Γ 7. 0，溶劑為水，所述離液鹽c為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或高氯酸鈉；所述漂洗液3為體積濃度75%無水乙醇溶液或無水乙醇；所述洗脫液終濃度組成為l(T20mmOl/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，0.5mmol/LEDTA 水溶液，pH9. O。所述蛋白酶K工作液在試劑盒中的終濃度為20mg/mL。進(jìn)一步，所述磁珠以磁珠懸浮液的形式存在，即每毫升磁珠懸浮液中含有直徑為1-5 μ m的磁珠50mg,其余為水。進(jìn)一步，所述磁珠懸浮液按如下方法制備(I)磁性粒子的配制首先對4mol/L的氫氧化鈉水溶液通氮氣進(jìn)行除氧處理，然后將氫氧化鈉水溶液置于80°C的水浴中并持續(xù)通入氮氣；其次，將O. 5mol/L氯化鐵水溶液與O. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液以體積比2:1混合，緩慢倒入上述水浴中的氫氧化鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)30min，將反應(yīng)液靜置冷卻沉淀，去除上清；最后取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氫氧化鈉水溶液與氯化鐵水溶液和氯化亞鐵鹽酸溶液的總體積比為1:0. 6 ；(2)磁性粒子修飾配基取上述磁性粒子用去離子水a(chǎn)進(jìn)行超聲分散，獲得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中分別加入無水乙醇a、質(zhì)量濃度22 25%濃氨水、體積濃度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在400rpm下攪拌24小時，將反應(yīng)混合液用乙醇與水分別清洗三次，最后用4ml去離子水b分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述去離子水a(chǎn)的體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為100ml/g,所述無水乙醇a體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為400ml/g,濃氨水體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為5ml/g。進(jìn)一步，所述紅細(xì)胞裂解液終濃度組成優(yōu)選為150mmol/L氯化銨、lOmmol/L碳酸氫鉀，O. lmmol/L EDTA，溶劑為水，pH 為 7. 4。進(jìn)一步，所述細(xì)胞裂解液終濃度組成優(yōu)選為100mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽a、IOOmmoI/L螯合劑、500mmol/L氯化鈉和質(zhì)量終濃度0. 5%十二磺基硫酸鈉，溶劑為水，pH為8. O，所述螯合劑為EDTA。 進(jìn)一步，所述結(jié)合液終濃度組成優(yōu)選為3. 6mol/L高氯酸鈉、0. 2mol/L醋酸鈉、溶劑為水，PH為4. O。進(jìn)一步，所述漂洗液I終濃度組成優(yōu)選為1. 2 mol/L的高氯酸鈉，0. lmol/L醋酸鈉，體積終濃度30%的無水乙醇，溶劑是水，pH值4. 5。進(jìn)一步，所述漂洗液2終濃度組成優(yōu)選為1. 2 mol/L的高氯酸鈉，0. lmol/L醋酸鈉，體積終濃度70%的無水乙醇，pH值6，溶劑為水。本發(fā)明還提供一種利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒在提取全血基因組DNA中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒的應(yīng)用為(1)預(yù)處理向新鮮、冷凍或抗凝全血中加入其體積3倍的紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后室溫靜置5 10min，離心，棄大部分上清，最終保留大約100 μ L體積殘留上清液(通常為全部上清體積的2. 5%)；
(2)裂解將上述沉淀與殘留上清充分重懸、分散后，獲得重懸分散的細(xì)胞液，在每IOOyL重懸分散的細(xì)胞液中加入40 μ L蛋白酶K工作液，振蕩混勻10s，再向上述每100 μ L重懸分散細(xì)胞液中加入300 μ L細(xì)胞裂解液，56°C下振蕩溫育15 30min，獲得混合液；(3)核酸吸附向上述步驟(2)所得的每含IOOyL重懸分散細(xì)胞液的混合液中加入SOOyL結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ L磁珠懸浮液(加入量為每含100 μ L重懸分散細(xì)胞液的混合液中加入20 μ L磁珠懸浮液)，充分混勻后，靜置5min，形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁架上靜置吸附f2min，棄上清液，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入漂洗液I重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f 2min，棄上清，再加入漂洗液2重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f 2min后，棄上清，再加入漂洗液3重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f 2min后，棄上清，室溫靜置至無乙醇?xì)馕?，獲得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體；所述漂洗液廣漂洗液3的體積用量以能夠充分懸浮磁珠即可；(5)洗脫最后向步驟(4)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入洗脫液，振蕩混勻20s，55°C孵育lOmin，振蕩混勻5s，在磁架上靜置吸附廣2min，取上清，獲得所述基因組DNA。本發(fā)明所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒的應(yīng)用中，若待提取的全血為微量(即小于200μ L )時，可以省去利用紅細(xì)胞裂解液預(yù)處理的步驟，將全血直接加入蛋白酶K工作液及細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解處理。本發(fā)明所述的漂洗液I、漂洗液2和漂洗液3均為漂洗液，為便于區(qū)分表述不同步驟所用漂洗液不同而命名，數(shù)字I，2，3本身沒有含義。
本發(fā)明所述離液鹽a、離液鹽b、離液鹽c均為離液鹽，為便于區(qū)分不同溶液中所用離液鹽量不同而命名，所述去離子水a(chǎn)和去離子水b均為去離子水，為便于區(qū)分不同步驟使用去離子水不同而命名，所述無水乙醇a和無水乙醇b均為無水乙醇，為便于區(qū)分不同步驟使用無水乙醇量不同而命名，字母本身沒有含義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明適于中大量全血基因組DNA的提取，操作簡便，只需對紅細(xì)胞進(jìn)行簡單預(yù)處理，即可對大體積的全血樣本進(jìn)行快速提取，Ih內(nèi)可完成操作，適合高通量、自動化提取；反應(yīng)體系靈活，可根據(jù)樣品體積作體系的相應(yīng)調(diào)整；不使用苯酚、氯仿等有機溶劑，對操作人員安全無毒副作用；提取效率高，能夠從2ml全血中提取20 60 μ gDNA,且片段完整；形成的磁珠-DNA復(fù)合體可不經(jīng)洗脫直接用于核酸檢測實驗，如PCR、qPCR，方便快速。


圖I實施例2方法獲得的基因組DNA片段完整性檢測，泳道1、2 :利用本發(fā)明試劑盒提取的基因組DNA ;泳道3 IOOObp gene ruler ;泳道4、5 :用Qiagen試劑盒提取的基因 組 DNA。圖2實施例3方法獲得的基因組DNA片段完整性檢測，泳道l:1000bp generuler ;泳道2、3 :用本發(fā)明試劑盒提取的基因組DNA。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例I :試劑盒組成與配制磁珠懸浮液的制備(I)磁性粒子的配制配制200ml、4mol/L的氫氧化鈉水溶液，并通氮氣對其進(jìn)行除氧。然后將氫氧化鈉溶液置于80°C的水浴中并進(jìn)行不間斷的通氮氣，將O. 5mol/L氯化鐵水溶液80ml與O. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液40ml混合，緩慢倒入上述水浴的氫氧化鈉水溶液中，期間進(jìn)行攪拌，會有大量黑色沉淀產(chǎn)生，半個小時后停止攪拌反應(yīng)，室溫(25°C )靜置自然冷卻沉淀，去除上清。取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到粒徑在1-5 μ m的磁性粒子。(2)磁性粒子修飾配基稱取上述磁性粒子200mg,用20ml去離子水進(jìn)行超聲分散，然后移入一個250ml的三口燒瓶中。再分別加入80ml無水乙醇、Iml質(zhì)量濃度22 25%濃氨水、ImlTEOS乙醇溶液(TE0S400 μ I )，400rpm下機械攪拌24小時，將反應(yīng)混合液用無水乙醇與水分別清洗三次，最后用4ml去離子水分散，獲得所述磁珠懸浮液。紅細(xì)胞裂解液終濃度組成為150 mmol/L氯化銨，10 mmol/L碳酸氫鉀，O. lmmol/L EDTA,溶劑是水，pH 值為 7. 4 ；蛋白酶K工作液20mg/mL ；細(xì)胞裂解液終濃度組成為100 mmoL/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，100 mmoL/LEDTA、500mmoL/L氯化鈉、質(zhì)量終濃度0. 5%的十二磺基硫酸鈉，溶劑是水，該裂解液pH值為8 ；結(jié)合液終濃度組成為3. 6mol/L的高氯酸鈉、0. 2mol/L醋酸鉀，溶劑為水，pH值為 4. O ;漂洗液I終濃度組成為I. 2 mol/L高氯酸鈉、體積終濃度30%的無水乙醇，O. lmol/L醋酸鈉，溶 劑是水，pH值4.5 ;漂洗液2終濃度組成為1. 2 mol/L的高氯酸鈉、體積終濃度70%的無水乙醇，O. lmol/L醋酸鈉，溶劑為水，pH值6 ;漂洗液3 :無水乙醇；洗脫液終濃度組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，O. 5mmol/LEDTA水溶液，pH 值 9. O。實施例2 微量人抗凝全血基因組DNA提取I)實驗材料新鮮、冷凍或抗凝人全血2)基因組DNA提取步驟微量全血基因組DNA的提取，可省略紅細(xì)胞裂解步驟。(I)裂解取100 μ I新鮮、冷凍或抗凝全血加入到I. 5ml離心管中，并加入20 μ I蛋白酶K工作液(購自金普諾安(北京))使其終濃度為4mg/ml，將離心管置于旋渦振蕩器上混勻10秒鐘；再加入300 μ I實施例I方法制備的細(xì)胞裂解液，56°C溫育15min，期間不時
震蕩；(2)核酸吸附向上述混合液中加入800 μ I實施例I方法配制的結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ I實施例I方法制備的磁珠懸浮液(使用前混勻)，輕柔顛倒混勻lOmin，形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液；將上述裝有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液的離心管放在磁架(上海奧潤微納)上靜置吸附廣2min，吸棄上清，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體；(3)漂洗向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入1000 μ I實施例I方法配制的漂洗液I重懸磁珠，輕柔顛倒Imin,再放在磁架上靜置吸附l 2min,吸棄上清；加入1000 μ I實施例I方法配制的漂洗液2重懸磁珠，輕柔顛倒lmin，再放在磁架上吸附f 2min，吸棄上清；加入1000 μ I實施例I方法配制的漂洗液3，重懸磁珠，置于磁力架上f 2min，吸棄上清；開蓋，在室溫(25°C)靜置2min，直至聞不到乙醇?xì)馕叮@得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體；(4)洗脫向步驟(3)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入50 μ I實施例I方法配制的洗脫液，在旋渦振蕩器上混勻20秒鐘，然后在55°C水浴孵育IOmin;取出后在旋渦振蕩器上混勻5秒鐘，在磁架上吸附f 2min，吸取上清于新的EP管，獲得基因組DNA。同時以Q公司(Qiagen，951336)試劑盒對100 μ I新采集的人抗凝全血進(jìn)行基因組DNA提取，得到的基因組DNA經(jīng)超微量分光光度計(ND 1000, NanoDrop)NanoDrop檢測濃度，DNA 純度用 OD260mi/OD280nm 比值來衡量(純 DNA 0D260/0D280 I. 8 (> I. 9，表明有 RNA污染；< I. 6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)，一般認(rèn)為0D260/0D280在1.8-2. O之間，DNA都屬于純凈)，結(jié)果見表I所示。表I兩種試劑盒提取DNA結(jié)果比較
本試劑盒(磁珠法)Q公司試劑盒(吸附柱運7~ _重復(fù)I 重復(fù)2重復(fù)I 重復(fù)2_QD 比Ι 1.99 1.972.06 1.80 DNA 濃丨ii: (ng/ul) 72.7 72.228.6 29.0
從表I可以看出，本試劑盒提取得到的基因組DNA純度達(dá)到了質(zhì)和量的要求，比Q公司提取結(jié)果略好一些(本發(fā)明試劑盒0D260nm/0D280nm比值均在I. 8-2. O范圍內(nèi))，且本發(fā)明所得的基因組DNA產(chǎn)量明顯提高，約為Q公司產(chǎn)量的2. 5倍左右。3)基因組DNA片段完整性檢測分別取10 μ I步驟2)提取的基因組DNA，于質(zhì)量濃度O. 8%的瓊脂糖凝膠上，在IOOv電壓下電泳15min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，以Q公司試劑盒提取的基因組DNA作為對照，如圖I所示。從圖I可以看到，兩種試劑盒提取得到的基因組DNA均比較完整。實施例3 中量人抗凝全血基因組DNA提取實驗材料新鮮、冷凍或抗凝人全血
基因組DNA提取步驟(I)預(yù)處理將抗凝全血(使用前回復(fù)到室溫)顛倒混勻后，吸取2ml加至裝有6ml實施例I方法制備紅細(xì)胞裂解液的離心管中，顛倒混勻6-8次，倒置輕彈管壁，確保充分混勻，室溫放置IOmin,期間不時顛倒輕彈混勻數(shù)次,3，500g離心3 min,倒棄紅色上清,并小心的盡可能多的吸棄上清，留下完整的管底白細(xì)胞團和大約100 μ I的殘留上清；渦旋振蕩至白細(xì)胞團充分重懸、分散，獲得重懸分散的細(xì)胞液；(2)裂解將分散重懸的細(xì)胞液100 μ I轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管，并加入40 μ I蛋白酶K工作液旋渦振蕩器上混勻10秒鐘，再加入300 μ I實施例I方法制備細(xì)胞裂解液，560C下溫育30min，期間不時震蕩,獲得混合液440 μ I。(3)核酸吸附再向上述混合液中加入800 μ I實施例I方法制備結(jié)合液，充分混勻后加入20 μ I實施例I方法制備磁珠懸浮液，輕柔顛倒混勻IOmin ;形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁架上靜置吸附f2min，棄上清液，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入1000 μ I實施例I方法制備漂洗液1，重懸磁珠，輕柔顛倒lmin,再放在磁架上靜置吸附l 2min,吸棄上清；加入1000 μ I實施例I方法制備漂洗液2，重懸磁珠，輕柔顛倒lmin，再放在磁架上吸附l 2min，吸棄上清；再加入1000 μ I漂洗液3,重懸磁珠,置于磁力架上f 2min,吸棄上清；開蓋,在室溫靜置2min,直至聞不到乙醇?xì)馕?，獲得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體；(5)洗脫向步驟(4)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入600 μ I實施例I方法制備洗脫液，在旋渦振蕩器上混勻20秒鐘，然后在55°C水浴孵育lOmin，取出后在旋渦振蕩器上混勻5秒鐘，在磁架上靜置吸附f2min，吸取上清于新的EP管，獲得基因組DNA。將所提取的基因組DNA經(jīng)NanoDrop檢測濃度，DNA純度用OD26(lnm/OD28(lnm比值來衡量(I. 80-2. O)。每個檢測重復(fù)2次，結(jié)果見表2所示。表2人全血基因組提取效果
重復(fù)I重復(fù)2OD Ltifl.Γ 9~\
DNA 濃度(ng/ul )_777_78_8_從表2可以看出，本試劑盒提取得到的基因組DNA純度能夠滿足實驗要求，且基因組DNA提取效率較高，可從2ml全血獲得約45 μ gDNA。取10 μ I的基因組DNA，于質(zhì)量濃度 O.8%的瓊脂糖凝膠上在IOOv電壓下，電泳15min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，可見基因組DNA完整性好(圖2所示)。
權(quán)利要求
1.一種利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由磁珠懸浮液、基因提取液和磁架構(gòu)成；所述磁珠懸浮液以氯化鐵和氯化亞鐵為磁性材料，在氮氣和氫氧化鈉的作用下，通過化學(xué)共沉淀形成磁性粒子，再將磁性粒子用硅酸鈉修飾，水分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述基因提取液包括紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、結(jié)合液、蛋白酶K工作液、漂洗液I、漂洗液2、漂洗液3和洗脫液； 所述紅細(xì)胞裂解液終濃度組成為10(T200mmoI/L氯化銨、5 20mmoI/L鉀鹽，O. 05 O.lmmol/L EDTA，溶劑為水，pH 為 7. 0 8· O ； 所述細(xì)胞裂解液終濃度組成為50 200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽a、50^500mmol/L螯合劑、500 800mmol/L鈉鹽和質(zhì)量終濃度O. 5 5%十二磺基硫酸鈉，溶劑為水，pH為7. 0 8· 0，所述螯合劑為EDTA ； 所述結(jié)合液終濃度組成為2 8mol/L離液鹽a、0. 2^2mol/L醋酸鈉，溶劑為水，pH為4.(Γ6. 0，所述離液鹽a為鹽酸胍、異硫氰酸胍、硫氰酸胍、碘化鈉、碘化鉀、高氯酸鈉或氯化鋰； 所述漂洗液I終濃度組成為I 4 mol/L的離子液鹽b，0. f2mol/L醋酸鈉，體積終濃度2(Γ30%的無水乙醇，溶劑是水，pH值4.(Γ 6. 0，所述離液鹽b為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或高氯酸鈉； 所述漂洗液2終濃度組成為4 mol/L的離液鹽C，O. f 2mol/L醋酸鈉，體積終濃度5(Γ70%的無水乙醇，pH值4. (Γ 7. 0，溶劑為水，所述離液鹽c為鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉或高氯酸鈉； 所述漂洗液3為體積濃度75%無水乙醇水溶液或無水乙醇； 所述洗脫液終濃度組成為l(T20mmOl/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，O. 5mmol/L EDTA水溶液，pH9. O。
2.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述磁珠以磁珠懸浮液的形式存在，即每毫升磁珠懸浮液中含有直徑為1-5 μ m的磁珠50mg,其余為水。
3.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述磁珠按如下方法制備(1)磁性粒子的配制首先對4mol/L的氫氧化鈉水溶液通氮氣進(jìn)行除氧處理，然后將氫氧化鈉水溶液置于80°C的水浴中并持續(xù)通入氮氣；其次,將O. 5mol/L氯化鐵水溶液與O. 5mol/L氯化亞鐵鹽酸溶液以體積比2:1混合，緩慢倒入上述水浴中的氫氧化鈉水溶液中，攪拌反應(yīng)30min，將反應(yīng)液靜置冷卻沉淀，去除上清；最后取沉淀用無水乙醇和水各清洗三遍，60°C真空干燥，得到所述磁性粒子；所述氫氧化鈉水溶液與氯化鐵水溶液和氯化亞鐵鹽酸溶液的總體積比為1:0. 6 ; (2)磁性粒子修飾配基取上述磁性粒子用去離子水a(chǎn)進(jìn)行超聲分散，獲得磁性粒子分散液，向所述磁性粒子分散液中分別加入無水乙醇a、質(zhì)量濃度22 25%濃氨水、體積濃度40%的正硅酸乙酯的乙醇溶液，在400rpm下攪拌24小時，將反應(yīng)混合液用無水乙醇與水分別清洗三次，最后用去離子水b分散，獲得所述磁珠懸浮液；所述去離子水a(chǎn)的體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為100ml/g，所述無水乙醇a體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為400ml/g，濃氨水體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為5ml/g，正硅酸乙酯的乙醇溶液體積用量以磁性粒子質(zhì)量計為5ml/g。
4.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述紅細(xì)胞裂解液終濃度組成為150mmol/L氯化銨、10mmol/L碳酸氫鉀，O. lmmol/L EDTA，溶劑為水，pH 為 7. 4。
5.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述細(xì)胞裂解液終濃度組成為100 mmol/L三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽a、100mmol/L螯合劑、500mmol/L氯化鈉和質(zhì)量終濃度O. 5%十二磺基硫酸鈉，溶劑為水，pH為8. 0，所述螯合劑為EDTA。
6.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述結(jié)合液終濃度組成為3. 6mol/L高氯酸鈉、O. 2mol/L醋酸鈉、溶劑為水，pH為6. O。
7.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述漂洗液I終濃度組成為1. 2mol/L的高氯酸鈉，O. lmol/L醋酸鈉，體積終濃度30%的無水乙醇，溶劑是水，pH值4. 5。
8.如權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒，其特征在于所述漂洗液2終濃度組成為I. 2mol/L的高氯酸鈉，O. lmol/L醋酸鈉，體積終濃度70%的無水乙醇，pH值6.0，溶劑為水。
9.一種權(quán)利要求I所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒在提取全血基因組DNA中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為(1)預(yù)處理向新鮮、冷凍或抗凝全血中加入其體積3倍的紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后室溫靜置5 10min，離心，棄大部分上清；(2)裂解將上述沉淀與殘留上清充分重懸、分散后，獲得重懸分散的細(xì)胞液，將每100 μ L重懸分散的細(xì)胞液中加入40 yL蛋白酶K工作液，振蕩混勻10s，再向上述每100 μ L重懸分散細(xì)胞液中加入300 μ L細(xì)胞裂解液，56°C下振蕩溫育15 30min，獲得混合液；(3)核酸吸附向上述步驟(2)所得的每含100 μ L重懸分散細(xì)胞液的混合液中加入800 μ L結(jié)合液，充分混勻后再加入20 μ L磁珠懸浮液，充分混勻后，靜置5min，形成含有磁珠-DNA的復(fù)合體溶液，將上述復(fù)合體溶液置于磁架上靜置吸附f 2min，棄上清液，獲得磁珠-DNA的復(fù)合體；(4)漂洗向上述磁珠-DNA的復(fù)合體中加入漂洗液I重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f2min，棄上清，再加入漂洗液2重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f 2min后，棄上清，再加入漂洗液3重懸磁珠，在磁架上靜置吸附f 2min后，棄上清，室溫靜置至無乙醇?xì)馕?，獲得漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體；(5)洗脫最后向步驟(4)漂洗后的磁珠-DNA的復(fù)合體中加入洗脫液，振蕩混勻20s，55°C孵育lOmin，振蕩混勻5s，在磁架上靜置吸附f2min，取上清，獲得所述基因組DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用磁珠提取全血基因組DNA的試劑盒及應(yīng)用，所述試劑盒由磁珠懸浮液、基因提取液和磁架構(gòu)成；所述基因提取液包括紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞裂解液、結(jié)合液、蛋白酶K工作液、漂洗液1、漂洗液2、漂洗液3和洗脫液；本發(fā)明適于中大量全血基因組DNA的提取，操作簡便，只需對紅細(xì)胞進(jìn)行簡單預(yù)處理，即可對大體積的全血樣本進(jìn)行快速提取，1h內(nèi)可完成操作，適合高通量、自動化提取；反應(yīng)體系靈活，可根據(jù)樣品體積作體系的相應(yīng)調(diào)整；不使用苯酚、氯仿等有機溶劑，對操作人員安全無毒副作用；提取效率高，能夠從2ml全血中提取20~ 60μgDNA，且片段完整。
文檔編號C12N15/10GK102888397SQ20121036219
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者吳箭, 王珺, 張瓊 申請人:杭州碩航生物科技有限公司